全 文 ：　 〔作者简介〕 李尘远 (1972-), 女 , 河北省迁安县, 讲师 , 硕士学位 , 主要研究方向是中药抗肿瘤。
玉竹提取物 B对 Hela细胞凋亡的影响
李尘远1 , 刘 　玲1 , 潘兴瑜2
(1.锦州医学院医学生物学与遗传学教研室;2.锦州医学院免疫与病原生物学教研室 , 辽宁　锦州　121001)
【摘要】目的　观察中药玉竹提取物 B (EB-PAOA)是否能引起人宫颈癌 Hela细胞的凋亡。方法　将体外培养
的人宫颈癌 Hela细胞与不同浓度的 EB-PAOA 共育 , 通过倒置显微镜和透射电镜进行形态学观察 , 确认凋亡细
胞;通过流式细胞仪检测凋亡率和细胞周期的分布。结果　经过 EB-PAOA 处理后 , 在倒置显微镜和透射电镜
下可观察到 EB-PAOA 引起的典型的凋亡形态学变化;流式细胞仪测定显示经 EB-PAOA 处理后的 Hela细胞
凋亡率呈时间-剂量依赖性 , G0/G1 期细胞减少 , S 期细胞减少 , G 2/M 期细胞增多。结论　EB-PAOA能够诱
导人宫颈癌 Hela细胞凋亡 , EB-PAOA抑制 Hela细胞生长的机制之一是诱导该细胞凋亡。
【关键词】玉竹提取物 B;宫颈癌 Hela细胞;细胞凋亡
【中图分类号】　R979.1　　　【文献标识码】 　A　　　【文章编号】　1000-5161 (2003)06-0014-03
Effect of Ext ract B of Polygonatum Odoratum
on the Apoptosis of Hela Cells
LI Chen-yuan , LIU Ling , PAN Xing-yu
(Department of Medical Biology , Jinzhou Medical College , Jinzhou 121001 China)
【Abstract】　Objective　To observe whether the ex tract B of Polygonatum Odoratum (EB-PAOA)
can induce the apoptosis in human cervix cancer Hela cells.Methods　Human cervix cancer Hela cells
w ere cultured in vit ro w ith dif ferent concentration of EB-PAOA.Cells w ere observed and confirmed
whether there were apopto tic cells wi th an inverted microscope and elect ronmicrog raph.Apoptotic rate
and cell cycles were then detected through a f low cy tometer.Results　It can be observed that large
number of apoptot ic cells had representat ive mo rphological characteristics under the inverted micro-
scope and elect ronmicrog raph.Though the detection of the flow cytometer , i t can be seen that the
apoptotic rate of cells was of time and dose dependence.The analy sis result of cell cy cle indicated that
the number of cells of G0/G1 and S period was reduced , and the number of G2/M period was in-
creased.Conclusions　EB-PAOA can induce the apoptosis of Hela cells , which may be one of the
mechanism of EB-PAOA s inhibi tion effect on Hela cells.
【Key words】　EB-PAOA;Hela cells;apoptosis
　　中药玉竹是是属于百合科 、 黄精属的中草药 。
味甘平 , 性微寒 , 含有多糖 、 单糖 、生物碱 、菸酸
等成份 , 具有生津止渴 、 养阴润燥 、扶正固本等作
用。研究发现 , 玉竹提取物 B (EB-PAOA)对肿
瘤细胞株 CEM 和 CL-187细胞的增殖具有显著的
抑制作用 , 另外 , EB-PAOA对 S-180移植小鼠
足垫所形成的移植瘤有明显的抑制作用 , 对 S -
180腹腔移植的荷瘤鼠可延长其存活期。这都说明
EB-PAOA具有显著的抑瘤效果〔1 ,2〕 。
目前已经知道许多抗肿瘤药物杀伤肿瘤细胞是
通过启动凋亡机制完成的〔3〕 。细胞凋亡与细胞生
长 、分化一样 , 属最基本的细胞学事件或过程 。它
不仅对胚胎发生 、 器官发育和保持机体自稳等方面
至关重要 , 而且在肿瘤发生 、发展及治疗中也起着
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锦州医学院学报
J Jinzhou Med College　2003 Dec., 24(6)
重要作用〔4〕。本实验旨在探讨 EB-PAOA 诱导人
宫颈癌 Hela 细胞凋亡的作用 , 以便了解 EB -
PAOA的抗肿瘤作用机理。
1　材料和方法
1.1　实验材料
1.1.1　实验仪器
倒置显微镜:OLYMPUS , 日本;透射电子显
微镜:JEM -1200EX 型 , 日本;超薄切片机:
LKB-5型 , 日本 。
流式细胞仪:EPICS-PROFILE , Ⅱ型 , 美国
1.1.2　主要试剂
玉竹提取物 B:锦州医学院免疫学教研室潘兴
瑜教授提供
RNA酶 (RNase)和碘化丙啶 (PI):Sigma ,
美国
1.1.3　人宫颈癌 Hela细胞株:购自北京大学医学
部肿瘤研究所
1.2　实验方法
1.2.1　EB-PAOA 对Hela细胞形态学的影响。
(1)将 Hela细胞接种在 24孔板中 , 每孔数量
为 1.8×105 , 培养 24h , 换培养液 , 对照组细胞用
RPM I1640继续培养 , 实验组细胞加入含有不同浓
度的 EB-PAOA的培养基 , 每 6h 倒置显微镜下观
察细胞形态变化 。
(2)取Hela细胞传代于两个 10m l培养瓶 , 置
37℃、 5%CO2温箱 24h 。弃培养液 , 各加 9m l RP-
M I1640完全培养基 , 一瓶作对照 , 另一瓶加入 1:
500的 EB-PAOA , 培养 24h 。取出培养细胞 , 常
规消化后 , 收集于离心管中 , 离心 800 ～ 1000rpm
×10min , 取出离心管中的细胞团并将其投入含预
冷的 2.5%戊二醛磷酸缓冲液的小瓶内 , 4℃固定
12h;0.2M 磷酸缓冲液洗 15min 共 3 次;1%
(10g/L)锇酸固定 3h , 再用 0.2M 磷酸缓冲液洗
15min 共 3 次 。乙醇脱水:50%、 70%、 90%各
15min , 100%15min共 3次;环氧树脂 Epon刻812
包埋 , 放入 37℃温箱中 1h 后置于 60℃, 烤 24h ,
然后将 Epon小片置入含有 Easlman910的 Epon 胶
囊中 (细胞面朝上), 待包埋剂硬化后 , 用玻璃刀
把选定区修好 , 制成电镜切片团块 , 在超薄切片机
切片;醋酸铀-柠檬酸铅双重染色;透射电镜观察
(加速电压 80KV)。
1.2.2　流式细胞仪检测凋亡率和细胞周期的变化
将浓度为 1.8×105/ml的 Hela 细胞悬液培养
24h。三个实验组细胞分别加入不同浓度的 EB-
PAOA , 浓度 (V/V)依次为 1:1500 、 1:1000
和 1:500 , 对照组细胞不加药 。在加药后的第 24h
和 48h , 各组分别取 3瓶培养细胞进行检测 。
每瓶收集 1×106 细胞 , 用 2ml 1640培养基制
成单细胞悬液;离心 1000rpm×5min , 弃上清液;
用 70%预冷的冰乙醇 (-20℃)吹打成单细胞悬
液 , -20℃保存 (24h 以上);样品离心 1000rpm×
5min , 弃上清液。3ml PBS 重悬 5min-10min , 离
心弃 PBS;1ml含 RNase 的 PI染液染色 , 4℃避光
30min;染色后的样品用流式细胞仪检测细胞凋亡
率并进行细胞周期分析 , 数据行统计学分析 ,
SPSS 分析软件 , 低于 G1期 DNA 含量的细胞判断
为凋亡细胞 。
1.2.3　所有数据用 SPSS 统计软件进行方差分析
并做两两比较。
2　结　　果
2.1　EB-PAOA 作用后的 Hela细胞形态变化
(1)倒置显微镜下 , 用 EB-PAOA 处理后的
细胞贴壁异常 , 细胞变圆 、 变小 , 失去细胞连接 ,
胞质空泡化 , 细胞膜皱缩 , 符合凋亡细胞特征 。随
用药浓度加大 , 培养时间延长 , 凋亡细胞数目逐渐
增多;正常对照组细胞大部分形状不变 , 随培养时
间延长 , 可见少量凋亡细胞 。 (2)EB-PAOA 1:
500作用 24h 的 Hela 细胞经透射电镜观察 , 可见
细胞皱缩 , 核染色质固缩 , 在核膜上形成致密小
块 , 半月形 , 核仁消失 , 胞膜起泡 , 线粒体分散呈
空泡化 , 细胞形态完整 。这均显示了凋亡细胞的典
型特征 。对照组细胞则无此变化 。
2.2　流式细胞仪分析结果
流式细胞仪检测 DNA 含量直方图上出现凋亡
峰 , 本实验通过计数凋亡细胞数目得出凋亡率 , 结
果见表 1。结果表明 , 细胞凋亡率呈时间和剂量依
赖性。在 48h细胞对凋亡诱导药物作用最敏感。不
同剂量 EB-PAOA 作用于 Hela 细胞 , 在 1:1500
剂量下 , Hela 细胞即开始凋亡 , 随着剂量增加 ,
凋亡率逐渐增高 , 提示 1:1500 ～ 1:500 剂量为
EB-PAOA 诱导凋亡的最佳剂量。1:500 EB-
PAOA作用 48h , Hela细胞凋亡率达到70.2%。与
空白对照组相比 , 实验组细胞凋亡率均具有显著性
差异 (P <0.01)。
如表 1所示 , 在细胞周期的分析结果中 , 可见
随 EB-PAOA 浓度提高和共育时间延长 , Hela细
15李尘远 ,等.玉竹提取物 B对 Hela细胞凋亡的影响
胞出现 G0/G1 期细胞减少 , G2/M 期细胞增多的现
象 , 而且具时间和剂量依赖性 , 不同浓度 、 不同作
用时间的组间比较均有显著性差异。
表 1　Hela细胞周期各期细胞百分率及凋亡百分率 (AP)
浓度
(V/V)
作用 24h 作用 48h
0 1:1500 1:1000 1:500 0 1:1500 1:1000 1:500 F P
G 0/G 1
S
G2/M
AP
65.7±1.9
21.6±0.8
13.0±0.7
9.5±0.9
53.9±0.6
17.6±1.0
27.8±0.8
23.7±1.0
51.2±0.9
15.5±1.1
34.6±1.2
31.5±1.0
41.9±0.7
8.6±1.0
48.6±2.1
42.2±1.1
62.5±0.6
19.5±1.1
18.5±1.0
12.3±0.8
51.5±0.5
17.4±0.6
30.6±2.5
33.7±1.2
40.5±0.5
7.7±0.2
51.3±1.9
56.0±2.6
30.8±0.5
5.3±1.1
63.3±1.9
70.6±1.8
510.7
139.8
329.8
659.5
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
经两两比较 , 不同浓度 、 不同作用时间的用药组之间及其与对照组之间均有显著性差异 , P<0.01
3　讨　　论
许多抗肿瘤中药都具有诱导癌细胞凋亡的作
用 , 这是它们抗癌的作用机理之一 , 人宫颈癌
Hela细胞株是这类研究中常用的实验对象 , 如土
贝母皂苷和白首乌甾体总苷都可诱导 Hela 细胞的
凋亡〔5 , 6〕。
前期研究证明我国传统中药玉竹的有效提取成
分B (EB-PAOA)具有一定的抗肿瘤作用 , 为揭
示其抗癌机理 , 本实验检测了 EB-PAOA 对 Hela
细胞的诱导凋亡作用。形态学检测结果显示 , EB
-PAOA 作用于 Hela 细胞后 , 出现了大量的凋亡
细胞。另外 , 流式细胞仪的检测说明了 Hela 细胞
随 EB-PAOA的浓度增大及共育时间的延长 , 凋
亡率逐渐增加。电镜观察和流式细胞仪检测是检验
细胞凋亡有效而灵敏的方法 , 因此 , 本实验证实了
EB-PAOA 确实具有诱导 Hela细胞凋亡的作用 ,
这是其抗肿瘤的机理之一 。
细胞周期分析的结果表明 , EB -PAOA 能够
促进Hela细胞由G0/G1 期进入S 期 , S期进入G2/
M 期 , 并阻滞在 G2/M 期 , 随着 EB-PAOA 剂量
逐渐加大 , 这种阻滞现象愈加明显。也就是说 ,
EB-PAOA能够通过抑制肿瘤细胞分裂而降低其
增殖能力 , 若联合应用 G2/M 期特异性药物 , 可能
对肿瘤细胞的抑制起到更好的效果。
本实验为研究 EB-PAOA抗肿瘤的作用机制
提供了理论依据。当然 , EB -PAOA 在诱导肿瘤
细胞凋亡的过程中 , 凋亡相关基因的表达有何变
化 , 如何启动 、诱导细胞凋亡信号 , 以进一步清楚
EB-PAOA的作用机理 , 还有待探讨 。
〔参　考　文　献〕
[ 1] 　潘兴瑜 , 张明策 , 李宏伟.玉竹提取物 B对肿瘤的抑制作用
〔J〕 .中国免疫学杂志.2000.16 (7):460.
[ 2] 　李尘远 , 潘兴瑜 , 张明策 , 等.玉竹提取物B抗肿瘤机制的
初步研究 〔J〕 .中国免疫学杂志.2003.19 (4):253.
[ 3] 　Hannun YA.Apoptosis and the dilemma of cancer chemotherapy
〔J〕 .Blood , 1997:89 (6):1845.
[ 4] 　Wallie AH , Kerr JFR.Cell death:the significance of apoptosis
〔J〕 .In ternational Review of Cytology , 1980:68 (8):251.
[ 5] 　杨萍 , 于延曦 , 马润娣 , 等.土贝母皂苷诱导人宫颈癌 Hela
细胞周期阻滞和细胞凋亡 〔J〕 .癌症 , 2002.21 (4):346.
[ 6] 　张如松 , 叶益萍 , 刘雪莉.白首乌甾体总苷的体外抗肿瘤作
用 〔J〕 .上海第二医科大学学报 , 2000.20 (6):484.
〔收稿日期〕 2003-09-10
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本刊编辑部
16 锦州医学院学报　2003 年 12 月 , 24(6)