全 文 ：２０１４年３月 四川大学学报（自然科学版） Ｍａｒ．２０１４
第５１卷　第２期 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏｌ．５１　Ｎｏ．２
收稿日期：２０１２－０１－２５
基金项目：国家自然科学基金（３１１７１５８６）；国家转基因重大专项（２０１１ＺＸ０８００９－００３－００２）
作者简介：姜欣（１９８７－），女，甘肃武威人，硕士，研究方向为植物遗传与分子生物学．Ｅ－ｍａｉｌ：４９８０３７０３＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者：杨毅．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｙｉ５２８＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ
ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０４９０－６７５６．２０１４．０２．０３３
拟南芥ＡｔＤＷＤ与ＲＣＡＲ１相互作用的初步研究
姜　欣，李德款，陶志文，袁德志，杨　毅
（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都６１００６４）
摘　要：采用ｐｕｌ　ｄｏｗｎ和酵母共转化的方法研究了ＡｔＤＷＤ与ＲＣＡＲ１之间的相互作用．体
外ｐｕｌ　ｄｏｗｎ试验得出ＡｔＤＷＤ与ＲＣＡＲ１之间存在明显的相互作用；酵母共转化试验显示
ＡｔＤＷＤ的截断区域中只有 ＷＤ４５和 ＷＤ３４５转化子可以在ＳＤ四缺培养基平板上长出正常
的酵母菌落．实验结果表明，ＡｔＤＷＤ　Ｃ端的１４５～３５０位氨基酸序列中含有与ＲＣＡＲ１相互
作用的功能域．
关键词：酵母双杂交；Ｐｕｌ　ｄｏｗｎ；ＲＣＡＲ１；ＡｔＤＷＤ
中图分类号：Ｑ７８　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：０４９０－６７５６（２０１４）０２－０４０２－０６
Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ＲＣＡＲ１　ａｎｄ
ＡｔＤＷＤ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
ＪＩＮＧＸｉｎ，ＬＩ　Ｄｅ－Ｋｕａｎ，ＴＡＯ　Ｚｈｉ－Ｗｅｎ，ＹＵＡＮ　Ｄｅ－Ｚｈｉ，ＹＡＮＧ　Ｙｉ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｃｏ－Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ
Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００６４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｕｌ　ｄｏｗｎ　ａｎｄ　ｙｅａｓｔ　ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ａｔ－
ＤＷＤ　ａｎｄ　ＲＣＡＲ１ｉｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｈｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｍ　ｗａｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ｐｕｌ　ｄｏｗｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｏｎ－
ｌｙ　ｔｈｅ　ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ａｒｅａ　ＡｔＤＷＤ　ＷＤ４５ａｎｄ　ＷＤ３４５ｔａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ　ｃｏｕｌｄ　ｇｒｏｗ　ｉｎｔｏ　ｎｏｒｍａｌ　ｙｅａｓｔ　ｃｏｌｏｎｉｅｓ　ｏｎ
ＳＤ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｅｄｉｕｍ　ｐｌａｔｅ，ｔｈｉｓ　ｒｅｓｕｌｔ　ｗａｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ　ｙｅａｓｔ　ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｉｔ　ｉｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ａｒｅａ　ｏｆ　ＡｔＤＷＤ　ｗｉｔｈ　ＲＣＡＲ１ｌｏｃａｔｅｄ　ａｔ　１４５～３５０ａａ　ｏｆ　ＡｔＤＷＤ　Ｃ　ｔｅｒｍｉｎｕｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｙｅａｓｔ　ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ　ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｕｌ　ｄｏｗｎ；ＲＣＡＲ１；ＡｔＤＷＤ
１　引　言
脱落酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ，ＡＢＡ）是植物中一种重
要的内源激素，它参与植物的生长调控，并在多种
环境胁迫中起着重要的调控作用，比如干旱、盐、低
温、高温、病原侵袭等．因此对ＡＢＡ信号通路的研
究对农作物的生长、提高农作物产量有着重要的基
础性意义［１］．脱落酸是２０世纪６０年代发现和分
离出来的一种化合物，随着人们对脱落酸的不断研
究，它的生物学方面的功能越来越受到重视．脱落
酸是２０世纪６０年代发现和分离出来的一种化合
物，随着人们对脱落酸的不断研究，它的生物学方
面的功能越来越受到重视．多年来，对ＡＢＡ的研
究工作一直在进行，尤其对ＡＢＡ受体的研究，至
２００９年，一种新的蛋白家族 ＲＣＡＲｓ／ＰＹＲ／ＰＹＬｓ
被鉴定为 ＡＢＡ 受体［２］．ＡＢＡ 是通过 ＲＣＡＲｓ／
ＰＹＲ／ＰＹＬｓ受体进行通路转导的．ＡＢＡ 能够与
ＲＣＡＲｓ／ＰＹＲ／ＰＹＬｓ结合，当ＡＢＡ 存在时，ＡＢＡ
和ＲＣＡＲｓ／ＰＹＲ／ＰＹＬｓ受体结合，使受体的结构
发生改变，形成能与蛋白磷酸酶（ＰＰ２Ｃｓ）相互作
第２期 　　 姜欣等，拟南芥ＡｔＤＷＤ与ＲＣＡＲ１相互作用的初步研究 　
用的结构域，然后和ＰＰ２Ｃｓ相互作用，这样能够完
全遮盖住ＰＰ２Ｃｓ的磷酸酶活性位点，从而ＰＰ２Ｃ
失去了抑制ＳＮＦ１相关的蛋白激酶２（ＳｎＲＫ２ｓ）亚
家族的能力，具有活性的ＳｎＲＫ２ｓ能够自我磷酸化
或使下游ＡＢＡ应答元件转录因子磷酸化，最终正
调控 ＡＢＡ 应答基因的表达．当 ＡＢＡ 不存在时，
ＲＣＡＲｓ／ＰＹＲ／ＰＹＬｓ受体以二聚体形式存在，它
们不能够和ＰＰ２Ｃｓ相互作用，此时的ＰＰ２Ｃｓ具有
高活性并能抑制下游蛋白激酶ＳｎＲＫ２ｓ的活性，从
而不能产生相应的ＡＢＡ应答反应［３］．
为进一步研究ＡＢＡ信号转导途径，本实验室
以拟南芥为模型，利用酵母双杂交系统共转化方
法，从拟南芥ｃＤＮＡ文库中筛选出了与 ＲＣＡＲ１
相互作用的蛋白ＡｔＤＷＤ．ＡｔＤＷＤ具有Ｅ３泛素
连接酶活性，已知Ｅ３泛素连接酶参与 ＡＢＡ 信号
转导，一些ＤＷＤ家族基因是ＡＢＡ 信号通路中的
负调控因子，因此为了进一步研究 ＡｔＤＷＤ 的在
ＡＢＡ信号通路中的功能，对它与ＲＣＡＲ１之间的
相互作用机制做了初步的研究．本文构建了ＡｔＤ－
ＷＤ蛋白表达载体，采用体外ｐｕｌ　ｄｏｗｎ实验技
术、ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ 检 测 技 术 验 证 ＡｔＤＷＤ 和
ＲＣＡＲ１之间的相互作用，定性和定量实验都充分
证明 ＡｔＤＷＤ和ＲＣＡＲ１之间存在明显的相互作
用。随后进一步构建了含有 ＡｔＤＷＤ不同结构域
序列的ＰＧＡＤＴ７融合载体，采用酵母双杂交的实
验方法分析 ＡｔＤＷＤ 与ＲＣＡＲ１之间的相互作用
及其作用区域，实验结果显示ＡｔＤＷＤ　Ｃ端的１４５
～３５０位氨基酸序列中含有与 ＲＣＡＲ１的氨基酸
序列相互作用的功能域，这对深入研究ＡｔＤＷＤ的
功能及其在植物 ＡＢＡ信号通路的作用机制奠定
了基础．
２　材料与方法
２．１　材　料
拟南芥ｃＤＮＡ，大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α菌
株，ｐＥＴ２８Ａ表达载体、ＧＴＫ载体由本实验室保
存．限制性内切酶，Ｔ４ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ购自Ｆｅｒｍｅｎ－
ｔａｓ公司．Ｐｒｉｍｅｒ　ＳＴＡＲ高保真ＤＮＡ聚合酶购自
ＴａＫａＲａ公司．ＡＨ１０９酵母菌株来源于Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
公司．常用试剂购于成都博瑞克生物技术有限公
司．引物合成及测序由华大基因公司完成．
２．２　方　法
２．２．１　目的基因的分离与载体的构建　以本实验
室保存的拟南芥ｃＤＮＡ为模板，用Ｐｒｉｍｅｒ　ＳＴＡＲ
高保真ＤＮＡ聚合酶和相应的引物扩增基因片段，
得到 ＡｔＤＷＤ 与ＲＣＡＲ１基因全长．构建 ＰＧ－
ＢＫＴ７－ＲＡＣＲ１、ＰＧＡＤＴ７－ＡｔＤＷＤ 和 ｐＥＴ２８Ａ－
ＡｔＤＷＤ、ＧＴＫ－ＲＡＣＲ１载体，分别用于酵母双杂
交实验和ｐｕｌ　ｄｏｗｎ实验．根据Ｓｍａｒｔ软件对Ａｔ－
ＤＷＤ的基因结构域进行预测，将ＡｔＤＷＤ的氨基
酸序列截断成五个部分（图１）：ＷＤ１、ＷＤ２、ＷＤ３、
ＷＤ４、ＷＤ５，由于本实验室之前用ＲＣＡＲ１通过酵
母双杂交方法筛选出ＡｔＤＷＤ时，发现ＲＣＡＲ１与
ＡｔＤＷＤ相互作用部位位于 Ｃ端的可能性较大，
于是将 ＡｔＤＷＤ 的氨基酸序列再分成 ＷＤ３４、
ＷＤ４５、ＷＤ３４５三个部分．然后分别设计引物，
ＰＣＲ扩增，酶切后连接ＰＧＡＤＴ７形成融合载体：
ＰＧＡＤＴ７－ＷＤ１、ＰＧＡＤＴ７－ＷＤ２、ＰＧＡＤＴ７－ＷＤ３、
ＰＧＡＤＴ７－ＷＤ４、 ＰＧＡＤＴ７－ＷＤ５、 ＰＧＡＤＴ７－
ＷＤ３４、ＰＧＡＤＴ７－ＷＤ４５、ＰＧＡＤＴ７－ＷＤ３４５．
图１　不同结构域的ＡｔＤＷＤ氨基酸片段
Ｆｉｇ．１　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｏｍａｉｎ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ
ＡｔＤＷＤ．
２．２．２　蛋白质纯化及Ｐｕｌ　ｄｏｗｎ　蛋白质纯化过
程方法参考文献［４］，得到较纯浓度的三个蛋白
Ｈｉｓ－ＡｔＤＷＤ、ＧＳＴ－ＲＡＣＲ１、ＧＳＴ，其中ＧＳＴ作为
实验中的空白对照．取２０μｇ量的 ＧＳＴ、ＧＳＴ－
ＲＡＣＲ１蛋白，分别向其中各加入４０μＬ谷胱甘
肽－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ介质及５μｇ量的Ｈｉｓ－ＡｔＤＷＤ蛋
白，然后用Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－Ｃｌ，
ｐＨ　７．５，１００ｍＭ　ＮａＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡＮａ２，１ｍＭ
ＤＴＴ，０．２％Ｔｒｉｓｔｏｎ　Ｘ－１００）补足５００μＬ的体系，
４℃，６５ｒ／ｍｉｎ，孵育４ｈ．接着用 Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ
（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－Ｃｌ，ｐＨ　７．５，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，１ｍＭ
ＥＤＴＡＮａ２，１ｍＭ　ＤＴＴ，０．１％ Ｔｒｉｓｔｏｎ　Ｘ－１００）在
４℃，５０ｒ／ｍｉｎ条件下小心洗６次，每次５ｍｉｎ，
低速离心１ｍｉｎ，最后得到蛋白质相互作用复合
３０４
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５１卷
体．在跑蛋白胶前制样，分别在样品中加入３０μＬ
１×ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ，沸水中煮１０ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ
离心５ｍｉｎ，取０．２５μｇ量的 Ｈｉｓ－ＡｔＤＷＤ作为
５％Ｉｎｐｕｔ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和 ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测
方法参考文献［５］，用 Ｈｉｓ－Ｔａｇ特异性抗体作为检
测抗体，用软件Ｂａｎｄｓｃａｎ定量分析 ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ
实验结果．
２．２．３　酶母共转化　制作ＡＨ１０９酵母感受态细
胞，共转化各个目的载体和诱饵载体ＰＧＢＫＴ７－
ＲＡＣＲ１，共转化步骤参照Ｃｌｏｎｔｅｃｈ操作手册和文
献［６］，同时设立对照组，阳性对照为ＰＧＢＫＴ７－
ＲＡＣＲ１＋ ＰＧＡＤＴ７－ＡｔＤＷＤ，阴性对照为 ＰＧ－
ＢＫＴ７－ＲＡＣＲ１ ＋ ＰＧＡＤＴ７ 与 ＰＧＢＫＴ７ ＋
ＰＧＡＤＴ７－ＡｔＤＷＤ，将共转化后的酵母细胞均匀
涂布在缺陷型二缺培养基ＳＤ／Ｌｅｕ－／Ｔｒｐ－平板上，
３０℃培养３～５ｄ，然后挑取阳性单克隆涂在二缺
培养基 ＳＤ／Ｌｅｕ－／Ｔｒｐ－与四缺培养基 ＳＤ／Ｌｅｕ－／
Ｔｒｐ－／Ｈｉｓ－／Ａｄｅ－平板上，３０℃培养３～５ｄ，观察
其生长情况．同时，还将在培养基ＳＤ／Ｌｅｕ－／Ｔｒｐ－
平板上挑取的阳性单克隆接入缺陷型液体培养基
ＳＤ／Ｌｅｕ－／Ｔｒｐ－中，３０ ℃，２２０ｒ／ｍｉｎ，摇菌约４８
小时，至菌液ＯＤ值为０．５～０．６，分别取５μＬ菌
液滴点在培养基ＳＤ／Ｌｅｕ－／Ｔｒｐ－和ＳＤ／Ｌｅｕ－／Ｔｒｐ－／
Ｈｉｓ－／Ａｄｅ－ 平板上，３０℃倒置培养３～５ｄ，观察
菌落生长情况．
３　结果与分析
３．１　不同物种中ＤＷＤ的比对分析
拟 南 芥 ＡｔＤＷＤ （ＧｅｎＢａｎｋ 登 录 号：
ＡＥＥ３６４３５．１）共３４９个氨基酸，含有一个１６个氨
基酸的ＤＷＤ基序核心序列，如图２－Ａ中下划线
标出，在这个核心序列中含有 ＷＤ４０结构域，即
Ｗ、Ｄ两个紧临的氨基酸重复片段．拟南芥的 Ａｔ－
ＤＷＤ氨基酸序列全长与水稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）、玉
米（Ｚｅａ　ｍａｙｓ）、蓖麻 （Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）中的
ＤＷＤ进行氨基酸序列比对，比对结果发现不同物
种中的ＤＷＤ序列相似度较高，拟南芥中的ＡｔＤ－
ＷＤ与蓖麻中的 ＲｃＤＷＤ显示出最高的同源性，
有８３％的氨基酸相同，与水稻ＯｓＤＷＤ，玉米Ｚｍ－
ＤＷＤ的氨基酸序列分别有８１％，７５％的相同（图
２－Ａ）．将蓖麻，杨树（Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ），大豆
（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ），葡 萄 （Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ），苜 蓿
（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ），拟南芥，烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
ｔｏｂａｃｕｍ），水稻，玉米中的ＤＷＤ进行进化树的分
析，分析显示拟南芥ＡｔＤＷＤ是ＤＷＤ家族中的分
枝之一，它的姊妹关系枝进一步又分成若干枝，
拟南芥ＡｔＤＷＤ与这些物种中ＤＷＤ序列之间的
同源性说明拟南芥ＡｔＤＷＤ与蓖麻ＲｃＤＷＤ、大豆
ＧｍＤＷＤ、葡萄ＶｖＤＷＤ都较为相近（图２－Ｂ）．
３．２　蛋白质纯化
分别将构建的载体ｐＥＴ２８Ａ－ＡｔＤＷＤ、ＧＴＫ－
ＲＡＣＲ１以及ＧＴＫ空载体转入Ｒｏｓｅｔｔａ表达菌株，
将转化阳性子活化过夜，然后按照１∶１００的比例
接入５００ｍＬ　ＬＢ培养基中（含相应的抗生素），在
３７℃，２２５ｒ／ｍｉｎ的条件下培养２ｈ，之后加入相
应量的ＩＰＴＧ（异丙基－β－Ｄ－硫代吡喃半乳糖苷）使
其终浓度为０．５ｍＭ，在２８℃，１８０ｒ／ｍｉｎ的条件
下，诱导表达６ｈ，随后将菌体收集，破碎后将蛋
白质经亲和层析纯化，制备样品后通过ＳＤＳ－聚丙
烯酰胺凝胶电泳看出，得到了大小正确，浓度较
高的三个蛋白，泳道从左至右依次是 Ｈｉｓ－ＡｔＤ－
ＷＤ，ＧＳＴ－ＲＡＣＲ１、ＧＳＴ，这三个蛋白的大小分别
是４４ｋＤ、４９ｋＤ、２５ｋＤ，其他条带为非特异性条
带（图３）．
３．３　体外验证ＲＣＡＲ１与ＡｔＤＷＤ的相互作用
用 Ｈｉｓ－Ｔａｇ特异性抗体作为 Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ实
验的检测抗体，经过 ＤＡＢ显色实验，可以看到
Ｉｎｐｕｔ泳道有较浓的明显的单一条带，此条带大小
为４４ｋＤ，是 Ｈｉｓ－Ｔａｇ特异性抗体检测出的 Ｈｉｓ－
ＡｔＤＷＤ的条带，ＧＳＴ负对照泳道见一条亮度很
弱的带，ＧＳＴ－ＲＣＡＲ１泳道有明显的单一的且大
小也为４４ｋＤ 的 Ｈｉｓ－ＡｔＤＷＤ 条带，此条带比
ＧＳＴ泳道的条带浓度高且更清晰，这个实验结果
说明ＧＳＴ－ＲＣＡＲ１与 Ｈｉｓ－ＡｔＤＷＤ之间有明显的
相互作用（图４－Ａ）；用软件 Ｂａｎｄｓｃａｎ 定量分析
ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ实验结果，将Ｉｎｐｕｔ泳道的Ｈｉｓ－ＡｔＤ－
ＷＤ相对含量设置为１００，则得到：ＧＳＴ泳道的
Ｈｉｓ－ＡｔＤＷＤ相对含量为６，ＧＳＴ－ＲＣＡＲ１泳道的
Ｈｉｓ－ＡｔＤＷＤ相对含量为４０，此结果更加肯定了
ＧＳＴ－ＲＣＡＲ１与 Ｈｉｓ－ＡｔＤＷＤ之间有明显的相互
作用（图４－Ｂ）．
３．４　酵母共转化检测ＲＣＡＲ１与ＡｔＤＷＤ相互作
用部位
分析菌落在缺陷型培养基平板的生长结果发
现，所有转化子在培养基ＳＤ／Ｌｅｕ－／Ｔｒｐ－平板上均
长出白色光滑、丘状隆起状的菌落，说明酵母转化
成功．ＷＤ１、ＷＤ２、ＷＤ３三个转化子未在培养基
ＳＤ／Ｌｅｕ－／Ｔｒｐ－／Ｈｉｓ－／Ａｄｅ－ 平板上长出菌落，说明
４０４
第２期 　　 姜欣等，拟南芥ＡｔＤＷＤ与ＲＣＡＲ１相互作用的初步研究 　
图２　不同物种中ＤＷＤ氨基酸序列比对和进化树分析
Ａ：序列比对；Ｂ：进化树分析
Ｆｉｇ．２　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ＤＷＤ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ
Ａ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ；Ｂ：ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ
图３　ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳
Ｆｉｇ．３　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｒｅｓｕｌｔ　ｍａｐ
ＷＤ１、ＷＤ２、ＷＤ３与ＲＣＡＲ１没有相互作用，而片
段转化子在培养基ＳＤ／Ｌｅｕ－／Ｔｒｐ－／Ｈｉｓ－／Ａｄｅ－ 平
板上长出较少的小点菌落，说明 ＷＤ４、ＷＤ５与
ＲＣＡＲ１的相互作用非常微弱（结果此处未给出）．
根据以上实验结果，进一步设计和操作了以
下实验，实验结果发现：所有转化子均能在培养基
ＳＤ／Ｌｅｕ－／Ｔｒｐ－平板上的平板上长出白色光滑、丘
状隆起状的菌落，而只有ＷＤ４５、ＷＤ３４５及全长
ＡｔＤＷＤ转化子也可以在培养基ＳＤ／Ｌｅｕ－／Ｔｒｐ－／
Ｈｉｓ－／Ａｄｅ－ 平板上长出白色光滑、丘状隆起状的菌
落（图５），由此表明在这三个转化子的ＡｔＤＷＤ截
断片段氨基酸序列中包含有与ＲＣＡＲ１相互作用
的功能域．
５０４
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５１卷
图４　ＧＳＴ　Ｐｕｌ　ｄｏｗｎ体外检测ＲＣＡＲ１与ＡｔＤＷＤ之间的相互作用
Ａ：Ｈｉｓ抗体检测ＧＳＴ－ＲＣＡＲ１与 Ｈｉｓ－ＡｔＤＷＤ之间的相互作用；Ｂ：Ｂａｎｄｓｃａｎ检测 ＡｔＤＷＤ的相对
含量，将Ｉｎｐｕｔ的值设为１００
Ｆｉｇ．４　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＲＣＡＲ１ａｎｄ　ＡｔＤＷＤ　ｂｙ　ＧＳＴ　Ｐｕｌ　ｄｏｗｎ　ａｓｓａｙ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
Ａ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＲＣＡＲ１ａｎｄ　ＡｔＤＷＤ　ｂｙ　Ｈｉｓ　ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｂ：Ｔｅｓｔｉｎｇ　ＡｔＤＷＤ　ｒｅｌａ－
ｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｂｙ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｂａｎｄｓｃａｎ，ｔｈｅ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　Ｉｎｐｕｔ　ｉｓ　ｓｅｔｔｅｄ　ｔｏ　１００．
图５　ＲＣＡＲ１与ＡｔＤＷＤ不同结构域片段的酵母共转结果
Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＲＣＡＲ１ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ＡｔＤＷＤ
４　讨　论
植物需要演化出各种耐受机制来适应环境压
力，它们主要通过操控能保护支持细胞功能和结
构的基因来增强自身的耐受性，这样的应答过程
是相当复杂的［７］．ＡＢＡ作为植物中一种重要的内
源激素，广泛地参与着植物的生长发育调控，并
在植物对外界胁迫应答中起着非常重要的作用．
比如植物对干旱、低温、高温、盐等多种胁迫的适应
性反应中均发现了ＡＢＡ的参与［８，９］．
我们已知ＲＣＡＲ１是ＡＢＡ信号通路的重要受
体之一［１０］，于是本实验室用ＲＣＡＲ１为诱饵蛋白
通过酵母双杂交系统筛选出了 ＡｔＤＷＤ，它是Ｅ３
连接酶中的家族之一，可能具有Ｅ３泛素连接酶活
性，我们已经知道泛素介导的依赖于２６Ｓ蛋白酶
体的蛋白降解途径几乎在所有的植物激素信号转
导途径中都发挥着重要的作用，植物对激素的应答
会通过泛素降解途径影响下游转录因子的表达调
控，本文研究的蛋白 ＡｔＤＷＤ 含有多个典型的
ＷＤ４０结构域，属于ＣＵＬ４－ＤＤＢ多亚基Ｅ３泛素连
接酶型．Ｃｕｌ４－ＤＤＢ１－ＷＤ４０是最新发现的一种Ｅ３
泛素连接酶，可以调控ＤＮＡ 复制、ＤＮＡ 修复、转
录及病毒感染等多种反应．为了进一步研究ＡｔＤ－
ＷＤ 和 ＡＢＡ 信号通路的关系，本文利用 ｐｕｌ
ｄｏｗｎ和酵母共转化的方法初步考究了它与 ＡＢＡ
受体ＲＣＡＲ１之间的相互作用及其作用机制，得
出结论ＡｔＤＷＤ 的１４５～３５０位氨基酸序列能与
ＲＣＡＲ１的相互作用，说明ＡｔＤＷＤ　Ｃ端的这一段
氨基酸序列中含有与ＲＣＡＲ１相互作用的功能域．
最近有研究表明，一些ＤＷＤ 家族基因的突
变体对ＡＢＡ表现出高敏感的表型，并且利用酵母
双杂交系统证明了ＤＷＤ 家族基因能够和ＤＤＢ１
相互作用，推断它是Ｃｕｌｉｎ－ＲＩＮＧ　４泛素连接酶复
合物 （ＣＲＬ４）的底物受体，在ＣＵＬ４Ｅ３连接酶复
合体中起连接作用［１１，１２］；并且发现在ＤＷＤ 家族
基因突变体中，ＡＢＡ诱导的转录因子 （ＡＢＩ５ａｎｄ
６０４
第２期 　　 姜欣等，拟南芥ＡｔＤＷＤ与ＲＣＡＲ１相互作用的初步研究 　
ＡｔＭＹＣ２）和他们的下游基因的表达被上调，因此
推测ＤＷＤ家族中的相关基因在 ＡＢＡ应答通路
中起负调控因子的作用，并且可能通过ＣＲＬ４参
与底物蛋白的降解［１２］．虽然，Ｅ３泛素连接酶已被
证明参与ＡＢＡ信号转导，一些ＤＷＤ家族基因是
ＡＢＡ信号通路中的负调控因子［１３］，但 ＣＲＬｓ对
ＡＢＡ应答具体有怎样的影响还不清楚，ＤＷＤ 对
植物信号转导和植物生长发育的作用机制还需要
进一步研究和探讨．
参考文献：
［１］　 Ｃｈｒｉｓｔｍａｎｎ　Ａ，Ｍｏｅｓ　Ｄ，Ｈｉｍｍｅｌｂａｃｈ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎ－
ｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎｔｏ　ｐｌａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎ－
ｓｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ（Ｓｔｕｔｔｇ），２００６，８：３１４．
［２］　 Ｉｚａｂｅｌａ　Ｓ，Ｋｌａｕｓ　Ｒ，Ｍｉｃｈａｌ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｌｏｓｅｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｄｉｆｆｅｒ　ｉｎ　ｔｈｅｉｒ　ＡＢＡ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ
ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，２０１０，６１（１）：２５．
［３］　 Ｈｉｒｏａｋｉ　Ｆ，Ｐａｕｌ　Ｅ　Ｖ，Ｚｈｕ　Ｊ　Ｋ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｄｅｃｕｐｌｅ
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ｏｓｍｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｉｎ　ｖｉｖｏ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ
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