全 文 ：第 35 卷 第 3 期
2016 年 5 月
华 中 农 业 大 学 学 报
Journal of Huazhong Agricultural University
Vol． 35 No． 3
May 2016，49 ～ 53
收稿日期:2015-06-02
基金项目:国家重点基础研究发展计划(“973”计划) (2010CB126500) ;国家自然科学基金项目(31371549 和 31460056) ;高等学校博士点
基金专项(20110146110012)
叶竞阳，硕士研究生． 研究方向:根瘤菌共生固氮体系分子机制． E-mail:snowsheep2011@ 163． com
通信作者:李友国，博士，教授． 研究方向:生物固氮、农业环境微生物． E-mail:youguoli@ mail． hzau． edu． cn
紫云英类受体蛋白激酶 Nip43 靶蛋白的
筛选与初步鉴定
叶竞阳 王建云 熊小波 陈大松 谢福莉 李友国
华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070
摘要 以紫云英类受体蛋白激酶 Nip43 的 S-TKs结构域构建诱饵载体，通过酵母双杂交技术，筛选获得 17
个候选的阳性克隆。经过测序分析和 Blast比对，最终确定了 1 个互作蛋白 EPN。EPN 蛋白是网格蛋白聚合反
应中的配体蛋白，可调控网格蛋白的聚合反应。通过实验验证显示，靶蛋白 EPN与 Nip43 蛋白互作最强的区域
为 ENTH/ANTH结构域。Ｒeal-time qPCＲ检测表明，epn基因参与了根瘤菌早期结瘤过程。
关键词 紫云英;共生固氮;酵母双杂交;Nip43;EPN;蛋白互作
中图分类号 S 154． 38 + 1 文献标识码 A 文章编号 1000-2421(2016)03-0049-05
华癸中慢生根瘤菌 7653Ｒ 是我国特有的根瘤
菌共生固氮资源，它通过一系列复杂的分子对话与
紫云英形成专一性强的共生固氮体系［1-2］。华癸中
慢生根瘤菌 7653Ｒ 在侵入线阶段是如何逃逸植物
防御反应、最终形成根瘤原基，一直不为人们所了
解。通过对 7653Ｒ 基因组的测序分析显示，7653Ｒ
可通过Ⅲ型分泌系统(TTSS)分泌一种效应蛋白
NopP。Ⅲ型分泌系统是微生物为适应在宿主细胞
内生存和繁殖而形成的一种特殊机制［3］。Ⅲ型分
泌系统分泌的效应蛋白进入真核生物细胞可产生 2
种效果:一部分效应蛋白可以干扰宿主信号转导途
径，使宿主细胞免疫紊乱或细胞骨架重排，便于细菌
侵入;另一部分效应蛋白则是非致病蛋白，可帮助细
菌适应宿主细胞的胞内环境。
笔者所在实验室前期工作中以 NopP 蛋白为诱
饵，钓取并分离获得了与 NopP 互作的紫云英受体
激酶基因 nip43，编码一个类受体蛋白激酶 Nip43，
分子质量为 96 ku。将其氨基酸序列上传 Pfam数据
库中分析，Nip43 属于 B-lectin结构域型受体蛋白激
酶;同源性分析结果表明，其与苜蓿中的同源蛋白相
似度最高。
笔者根据文献［4］推断紫云英 Nip43 蛋白在侵
入线形成阶段识别根瘤菌效应蛋白 NopP，传递下调
植物防御反应的信号，使根瘤菌逃逸植物防御反应，
进而导致共生体的形成。本研究利用酵母双杂交技
术，筛选鉴定与 Nip43 互作的靶蛋白 EPN，构建 EPN
蛋白的结构域截短突变体，确定 2 个蛋白互作关键
结构域，通过 Ｒeal-time qPCＲ 检测 epn 基因是否参
与根瘤菌早期结瘤和信号转导过程，旨在为探明受
体蛋白激酶 Nip43 的下游蛋白信号传递通路提供科
学依据。
1 材料与方法
1． 1 菌株和质粒
酵母双杂交所用酵母菌株 Y187、AH109 及诱饵
质粒 pGBKT7 均来源于 Clontech公司。用于大肠杆
菌质粒转化的菌株 DH5α 和华癸中慢生根瘤菌
7653Ｒ均为笔者所在实验室保存的菌株。
1． 2 主要仪器和试剂
PCＲ仪(Bio-Ｒad)、实验相关的酶及 DNA 分子
质量标准均为 TaKaＲa公司产品，ＲACE试剂盒购于
Clontech 公司，SYBEＲ Green 试剂为 Ｒoche 公司
产品。
1． 3 诱饵质粒的构建
根据 nip43基因的信息，设计引物:上游 5-GGAAT-
TCCATATGAATTTCAAGACTCTAATTGG; 下 游 5-
DOI:10.13300/j.cnki.hnlkxb.2016.03.008
华 中 农 业 大 学 学 报 第 35 卷
C GGGATCCC TACAAAGATTCAATGCTAGG
(下划线为酶切位点 NdeⅠ和 BamHⅠ)。以紫云英
cDNA为模板进行 PCＲ 扩增:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30
s，5 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环 30 次;72 ℃ 延伸 10
min。将回收的 PCＲ产物和 pGBKT7 载体经过双酶
切和酶连，最终转化入大肠杆菌 DH5α。对大肠杆
菌转化子进行测序分析及双酶切验证，最终确定重
组质粒的正确性。
1． 4 紫云英 cDNA文库的筛选
将诱饵质粒 pGBKT7-nip43-C 转化到酵母菌株
Y187 中，在筛选文库前还应确认诱饵质粒的自激活
活性和毒性。将转化子划线于 SD /-Trp /X-gal、SD /-
Trp-Leu及 SD /-Trp-Leu-His-Ade 平板上培养，30 ℃
培养 2 ～ 4 d 后，观察菌落的生长状况及显蓝情况。
若诱饵 BD-融合蛋白没有激活作用，则酵母菌落为
白色且在 SD /-Trp-Leu及 SD /-Trp-Leu-His-Ade平板
上也不会生长。挑取 SD /-Trp 平板上直径大于 2
mm的白色单菌落接种于 SD /-Trp 培养基中，震荡
培养 24 h，观测培养液的 D600是否大于 0． 8，以确定
诱饵质粒是否具有毒性。将检测无自激活活性与自
毒性的诱饵质粒与 1． 5 mL的文库菌株 AH109 混合
于 50 mL 的2 × YPDA 培养基中，在 30 ℃、50 r /min
的摇床中培养 24 h，涂布于直径 200 mm 的 SD /-
Trp-Leu-His-Ade平板上筛选阳性克隆。
1． 5 阳性克隆的鉴定
挑取可以在筛选培养基 SD /-Trp-Leu-His-Ade
平板上生长的阳性克隆，接种到 SD /-Trp-Leu-His-
Ade + X-gal平板上，30 ℃避光培养2 ～ 3 d，挑选显蓝
色的阳性克隆进一步验证。通过菌落 PCＲ 排除有
空载体及多个插入片段的阳性克隆。将筛选得到的
阳性克隆经过回转验证，点对点杂交等实验再次排
除阳性克隆假阳性的可能。将复筛确定的阳性克隆
进行测序，测序结果通过 Blast进行分析比对。
1． 6 蛋白互作关键结构域的确定
根据 ＲACE试剂盒的操作手册设计一段特异性
引物扩增得到了 epn 基因的全长。根据 epn 基因的
全长信息设计截短突变体的引物，构建 2 个缺失突
变体 epn-1 和 epn-2。将带有 epn-1 和 epn-2 片段的
质粒 pGADT7 分别与诱饵质粒 pGBKT7-nip43-C 进
行点对点杂交，按一定浓度点种于 SD /-Trp-Leu 和
SD /-Trp-Leu-His-Ade + X-gal平板上，30 ℃避光培养
2 ～ 3 d，观察菌落生长与变蓝的情况。通过 ONPG
法测定 β-半乳糖苷酶活性来确定蛋白互作的关键
结构域。
1． 7 epn基因表达量的测定
分别抽提接种 M． huakuii 7653Ｒ(Nod + Fix +)
和未接菌的紫云英根、茎、叶部组织的 ＲNA;分别抽
提接种 M． huakuii 7653Ｒ(Nod + Fix +)的紫云英 6、
12、18 h，1、3、6、9、12 d 时间点根部组织的 ＲNA 纯
化并测定浓度。在反转录时，通过改变各样品的体
积使各样品的 ＲNA 总浓度一致。将反转录产物按
上游引物 0． 5 μL、下游引物 0． 5 μL、模板 2． 0 μL、
ddH2O 7． 0 μL，SYBＲ Green Marster(Ｒox)10． 0 μL
的比例配成 20 μL 的反应体系，进行 Ｒeal-time
qPCＲ:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s;60 ℃ 20 s;72 ℃
20 s;72 ℃ 10 min，40 个循环。采用相对定量
2 －△△Ct法，得到 Ct值。
2 结果与分析
2． 1 诱饵质粒 pGBKT7-nip43-C的构建
根据 nip43 的序列信息设计 nip43 激酶结构域
的引物，通过 PCＲ 技术扩增获得了 nip43 激酶结构
域的 987 bp 片段，由于该基因片段位于 nip43 基因
的 C端，故在本文中将该基因片段称为 nip43-C。将
nip43-C片段通过 NdeⅠ和 BamHⅠ双酶切后，用 T4
连接酶连接到同样经过双酶切的 pGBKT7 载体上，
转入大肠杆菌 DH10B 中，菌落 PCＲ 验证，抽提质
粒，双酶切验证质粒的正确性(图 1) ，测序。
1:pGBKT7-nip43-C双酶切片段:pGBKT7 载体 7． 3 kb，nip43-C
片段 987 bp Double enzyme fragments of vector pGBKT7-nip43-C:7． 3
kb of vector pGBKT7，987 bp of vector nip43-C;M:Marker 12．
图 1 诱饵质粒 pGBKT7-nip43-C的构建
Fig． 1 Construction of bait plasmid pGBKT7-nip43-C
2． 2 诱饵质粒 pGBKT7-nip43-C 自激活活性和毒
性的检测
将带有 pGBKT7-nip43-C 诱饵质粒的酵母菌
Y187 划线于 SD /-Trp + X-gal 、SD /-Trp-Leu 及 SD /-
05
第 3 期 叶竞阳 等:紫云英类受体蛋白激酶 Nip43 靶蛋白的筛选与初步鉴定
Trp-Leu-His-Ade平板上培养。酵母菌无法在 SD /-
Trp-Leu 及 SD /-Trp-Leu-His-Ade 平板上生长，且在
SD /-Trp + X-gal 平 板 及 滤 纸 影 印 都 不 变
蓝，说明诱饵载体没有自激活活性(图2)。在毒性
CK +:正对照;CK －:负对照;pGBKT7-nip43-C 为重组质粒
CK +:Positive control;CK-:Negative control ;pGBKT7-nip43-C is
recombinant plasmid．
图 2 pGBKT7-nip43-C/Y187 平板影印法自激活性检测
Fig． 2 Testing the BD-nip43-C bait for
auto-transcriptional activation
检测中，菌液 24 h后培养液的 D600值为 3． 466，明显
大于 0． 8，说明诱饵载体没有自激活活性和自毒性。
2． 3 阳性克隆的筛选与验证
经过与紫云英 cDNA 文库的杂交，从筛选平板
SD /-Trp-Leu-His-Ade 上获得了 136 个初始克隆。
挑取平板上大于 2 mm 的单菌落划线到 SD /-Leu-
Trp-His-Ade + X-gal平板上，通过检测报告基因 lacZ
的表达进行复筛。在 48 h 内变蓝的菌落初步确定
为阳性克隆，总共有 17 个。挑取 17 个阳性克隆为
模板、AD通用引物为引物进行菌落 PCＲ，PCＲ 产物
进行 0． 8%的琼脂糖凝胶电泳，检测筛选克隆是否
有空载体及插入片段的大小(图 3)。
2． 4 阳性克隆插入片段的序列分析
对这 17 个阳性克隆的测序结果进行 Blast分析
(表 1) ，可将阳性克隆分为 2 类:一类是带有 EN-
TH /ANTH结构域的网格蛋白聚合反应配体蛋白
EPN;另一类是植物抗逆结构域 LEA14。由于 EPN
蛋白定位于细胞膜，除了参与了网格蛋白的聚合反
应，还参与细胞信号转导和肌动蛋白的调节过程。
因此，本文着重于 EPN蛋白的研究。
A1-B8:阳性克隆菌落 PCＲ产物的片段 Fragments of PCＲ products of positive clones;M:Marker 12．
图 3 阳性克隆的菌落 PCＲ鉴定
Fig． 3 Check the positive colonies by PCＲ
表 1 Nip43 诱饵筛选紫云英 AD-cDNA文库阳性克隆测序及对比结果
Table 1 The results of positive clones after sequencing and Blast
编号 Code 名称 Name 数量 Number 同源基因 /蛋白 Homologous gene(protein)
A1，A8，A9，B1，B2 脱水保护蛋白
Desiccation protectant protein
5 大豆
(Glycine max)脱水保护蛋白 Lea14 Desiccation pro-
tectant protein Lea14 homolog
A2，A3，A4，A5，
A7，B3，B4，B6 衔接蛋白
Epsin 8 苜蓿
(Medicago truncatula)衔接蛋白 Epsin N-terminal ho-
mology (ENTH)domain containing protein
2． 5 EPN 蛋白与 Nip43 蛋白关键互作结构域的
确定
根据 epn基因的全长信息设计截短突变体的引
物，构建 2 个缺失突变体 epn-1(1 ～ 720 bp)和 epn-2
(721 ～ 1 479 bp)。将经过自激活和毒性检测的带
有 epn-1、epn-2 全长的质粒 pGADT7，分别与诱饵质
粒 pGBKT7-nip43-C 进行“点对点”杂交，点种于
SD /-Trp-Leu 和 SD /-Trp-Leu-His-Ade + X-gal 平板
上，30 ℃避光培养 2 ～ 3 d，观察菌落，发现质粒在二
缺平板上都能生长，但只有带全长和epn-1片段的质
粒能在四缺平板上生长。通过 ONPG 法测定 β-半
乳糖苷酶活性，确定了蛋白互作的关键结构域为
EPN蛋白的 N端，即 ENTH /ANTH结构域(图 4)。
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华 中 农 业 大 学 学 报 第 35 卷
图 4 Nip43 与 EPN 在酵母细胞中相互作用
Fig． 4 Interaction of Nip43 with EPN in the yeast
2． 6 epn基因的时空表达分析
在紫云英接种根瘤菌第 6 天时，分别收取接种
根瘤菌的植株的根、茎、叶组织和未接种根瘤菌的植
株的根、茎、叶组织，抽提 ＲNA并反转录得到cDNA，
分别扩增紫云英 actin 确定 cDNA 质量。之后，利用
Ｒeal-time PCＲ定量分析 epn 的组织表达特异性(图
5)。结果显示，epn 基因在紫云英中呈组织型表达，
但在接种根中的表达量是其他组织的表达量的 5 倍，
这说明 epn 基因参与了根瘤菌早期结瘤过程，为
Nip43与 EPN蛋白互作在空间上提供了证据。
IＲ，IS，IL分别为接种根瘤菌 7653Ｒ 植株的根茎叶;UＲ，US，UL
分别为未接种根瘤菌 7653Ｒ 植株的根茎叶。IＲ，IS，IL show root，
stem and leaf inoculated with Mesorhizobium huakuii 7653Ｒ;UＲ，US，
UL show root，stem and leaf un-inoculated with Mesorhizobium huakuii
7653Ｒ．
图 5 epn基因在植物组织中的表达
Fig． 5 Expression of epn in plant tissue
选择 6、12、18 h、1、3、6、9、12 d共 8 个时间点的
紫云英感染根部组织的 ＲNA 样品，经过 Ｒeal-time
PCＲ检测分析(图 6)可以看出，在 12 d 中，epn 在感
染根部的表达呈倒 U形变化，在第 6 天的表达量达
到最高峰。通过与前期发现的 nip43 基因时序表达
结果(nip43 表达最高峰在第 7 天)比较发现，epn 和
nip43 的表达高峰时期及动态特征高度吻合。综上，
epn确实参与了早期根瘤形成阶段的信号转导过程，
且 2个基因的表达在时间上也呈现相关性，为 Nip43
与 EPN的互作在时间上提供了证据。
图 6 epn 基因在感染根部不同时期的表达水平
Fig． 6 Expression level of epn gene in
inoculated root at different stage
3 讨 论
Nip43 蛋白属于类受体蛋白激酶，其 B-lectin 结
构域参与调节细胞与细胞、宿主和病原之间的互作
及免疫反应［5］，在植物中呈组成型表达。通过对拟
南芥中 Nip43 同源蛋白的研究发现 B-lectin 结构域
参与糖信号的识别和传递。在豆科植物与根瘤菌早
期共生信息交流中涉及到多糖物质的识别和反应，
如结瘤因子和表面多糖［6］。表面多糖主要包括胞
外多糖、脂多糖、荚膜多糖及其小分子衍生物等，这
类多糖物质都在信号传递方面起作用，并且有助于
细菌侵入［7］。
EPN蛋白含有一个 ENTH /ANTH 结构域，含有
该结构域的蛋白大都可与磷脂酰肌醇(Ptdlns(4，5)
P2)特异性结合，使细胞膜产生极大程度的弯曲和
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第 3 期 叶竞阳 等:紫云英类受体蛋白激酶 Nip43 靶蛋白的筛选与初步鉴定
液泡化，在胞吞作用的过程中作为网格蛋白组装蛋
白的配体蛋白发挥作用［8］。EPN 蛋白可能作为一
种荷载特异性配体蛋白(cargo-specific adaptor)参与
网格蛋白介导的病原微生物的入侵。Chen 等［9］通
过随机光学显微重建法(STOＲM)发现 EPN 的人体
同源蛋白 epsin1 会在流感病毒的细胞膜结合位点
附近聚集，通过 epsin1 基因敲除实验证明，流感病毒
无法通过网格蛋白介导的内吞作用侵入缺乏 epsin1
的细胞。
紫云英 EPN 蛋白的表达量在接种根瘤菌后明
显上升，说明 EPN 蛋白的表达是受根瘤菌诱导的。
而 EPN与 Nip43 蛋白在感染的根中的表达量同时
在接种根瘤菌后的第 6 天达到最高峰，说明 EPN 蛋
白参与了 NopP 蛋白对于植物防御反应调节的信号
通路。同时接种根瘤菌的第 6 天也是侵染线形成的
时间点。侵染线是根毛细胞的细胞膜内陷，细胞壁
物质沉积在内陷的质膜处，形成一种管状结构［10］。
在侵入线末端，根瘤菌以胞吞作用的形式进入宿主
植物的皮层细胞［11］。本研究只是初步鉴定了 Nip43
蛋白与 EPN蛋白在体外的相互作用，其具体的分子
机制还有待进一步的研究。
参 考 文 献
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Screening and identification of the interacting protein with a ＲLKs
protein Nip43 in Astragalus sinicus
YE Jingyang WANG Jianyun XIONG Xiaobo CHEN Dasong XIE Fuli LI Youguo
State Key Laboratory of Agricultural Microbiology，Huazhong Agricultural
University，Wuhan 430070，China
Abstract The S-TKs domain of Astragalus sinicus gene nip43 was cloned into pGBKT7 and used as a bait
plasmid． 17 original positive candidate clones were obtained with yeast two-hybrid screening method． One positive
clone encoding an EPN protein out of importance was identified through sequencing the cDNA inserts． EPN is an
adaptor in the polymerization of clathrins． The critical interaction domain of EPN with Nip43 was determined as
ENTH/ANTH domain． Ｒesults of real-time qPCＲ showed that epn gene was involved in the early process of root
nodulation．
Keywords Astragalus sinicus;symbiotic nitrogen fixation;yeast two-hybrid;Nip43;EPN;protein-protein
interactions
(责任编辑:张志钰)
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