全 文 ：农业生物技术学报 JoUrn a lo fAg h cu lto t a1i B o te co ho lo留 2 01 0,9 (:1) 62~ 64
·研究报告 ·
花药特异嵌合启动子的构建及雄性不育转基因拟南芥的获得 *
陈 潜 汪迎春 张利明 李文彬 * 孙勇如
(中国科学院遗传学研究所 , 北京 10 01 01 )
摘要 : 为了克服 T A 29旧
~
转基因雄性不育植物的温度敏感性 , 在 T A 29 启动子上游申联 T C川绒v 35 s 启动子 。 同时
在 C田竹V 35 S 启动子上游串联一个调节序列 助山 e bor x , 构建成嵌合启动子 助 t h e br o -x C司叭V 35 S一 PT A 2 9 。 该启动元件调控的
GU
s 蒸因瞬间表达实验表明它是花药绒毡层特异的启动子 。 这个启动元件及其调控下的 b山 m as e 墓因构建植物表达载体转化
拟南芥菜 , 获得了雄性不育的转基因植株 。
关健词 : 嵌合启动子 ; 雄性不育 ; 拟南养菜; 转基因植物
C on s tr u c t i o n
o f A ln 由e r S P e e i if e hC im ier e P or m o橄 an d F u rt h er E s t a b li s hm e in o f
rT an s g e in
e A rt iif e i a l M ia e Setr i l
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( I n st iot t e o f eG
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A b s t ar e t : hT
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as as 丫 we fu rt h e r Por v ed th a t t be a ln由e d幻 x
.
C a M V 35 S
.
P勺公 g er gU laet s G U S e x P比 s i o n in an an htL e r st lP . ot m s Pe c iif c 们口a n n eL .r hT e n ,
by tr a n s fo mr i gn A用西汤争痴 ht a ljJ 幼 a w i ht an ht e此旧 x 一 C aM y 3 5S一 P飞A 2 9 idr v e n b a r o a` e g e n e , w e s cu e e s s fu l ly ge t ht e t件 nL罗 n ic art iif e iia
m a le s t e ir lo h n e s
.
旋尹拍r ds : ch im e ir c Por m o t e r ; m a le set ilr iyt ; 月翔抓肉脚店 功叔池朋 ; tar n s ge n ic P】an t
杂种优势利用的基因工程是植物基因工程中一
个重要的研究领域 , 目前已取得突破性进展 。 利用
TA 29山am as e 系统 已获得了烟草 、 油菜 、 花椰菜 、
菌首等多种植物的转基因雄性不育系 〔1] 。 但有报道
认为由该系统获得的转基因植物的雄性不育性状不
稳定 , 易受温度影响 。 在环境温度较高的情况下 ,
转基因植株会发生育性恢复的情况 , 产生正常的花
粉 阴 。 由于对温度敏感的材料在育种实践中很难控
制 , 因此这种现象的发生有可能为利用人工雄性不
育植株进行杂交制种带来不便。
我们对嵌合启动子的设计构想来源于两个研究
结果 。 ① 35 5 启动子串联后的启动效率大大高于单
个启动子 [’] , ②来源于矮牵牛的 C IH B (类黄酮合
成酶 ) 基因启动子 巧 中的 助比 e r b o x 序列可以调节
*
86 3计划资助项 目 (863 一 101 一01 一04 一2 ) * 申联系作者
陈 潜: 男 , 2s 岁, 硕士 , E -1 n a il : li w e n b inj . col . ~
.
cn
收稿日期: 2 00 一 0 5 一 2 9
35 5 启动子的花药特异性表达 l’ 。 因此我们设计了
这个嵌合启动子 助比 e此沁 x ~ C al 收v 3 5 s ~ T A 2 9 。
本研究报道我们对嵌合启动子的构建和表达特
性的检测 , 并利用嵌合启动子调控 b田力a s e 基因 , 获
得稳定表达的拟南芥菜转基因雄性不育植株 。
1 材料和方法
L l 植物材料 拟南芥菜 (C ol um ib -a O ) 为本所李
家洋先生惠赠 。 表面灭菌的种子在 12/ M s 固体培养
基上发芽。 1周后转到含 s o m创L M E S ( 2一M o rp ho 卜
协叱血阶 e sul fo n i c ac id) 的 M S 液体培养基中悬浮培
养 ( 12 0 r/ m i n ) 。 l 周后将增殖的根剪成 0 . 5~ l . o t o r n
左右的小段 。 并在含 500 m gL/ M E s 和 0
.
5 m
gL/
Z
,
4
-
D 的固体 M S 培养墓上预培养 3 do
L Z 载体构建
1 .2 1 花药盒 (明 th e br o x) 的人工合成 根据已发
表的序列, 设计如下序列的花药盒 , 由赛百盛公司
合成 :
第 1 期 陈 潜等: 花药特异嵌合启动子的构建及雄性不育转基因拟南芥的获得
5
,一
G A户LT T C C A C A A A A A工A A G A G A A G C I , 1, 一3 ,
3
,一
C T T A A G C T G T T T r n即汀T C T C I ,1, C G A A 一 5 ,
五沁。 RI H加 d 111
L乞2 构建嵌合启动子载体 用 石沁。 R l 和月勿 d m
酶切合成的 a n t h e ht ox 片段 ; 用 月功d m 和 J如 l a l 从
质粒 BP 2I 21 切下 C a M V 35 S 启动子片段 ; 从以前构
建的表达载体上用 月驹刀 I 和 刀司刃 H l 切下 p T A 2 9 片
段 ;`s] 把这 3 个元件插到 p G EM 一4 2 质粒上 , 构建
成嵌合启动子 。 在嵌合启动子后插入 B am as e 基因
和 N os 终止子 , 构建成 a n t h e br ox 一35 5 一T A 2 9一B a r n a s e -
N os 表达载体 , 其中筛选标记基 因为 加 r , 简称
PG T B 3 5 SB O X
。
1 .2 3 构建瞬时表达载体 以 g 璐 基因替换表达载
体中的 B~ se
, 构建成瞬时表达载体 p G T 一 G U S 。
1 3 基因枪转化及转化体筛选 为分析检测嵌合启
动子的花药绒毡层表达特异性 , 用瞬时表达载体
pGT
一
G U S通过基因枪法转化横切成薄片的百合花药,
以百合鳞茎为阴性对照 。 用 pG珊35 S B O X 质粒通
过基因枪转化经预培养的拟南芥菜的根段 , 经轰击
的根段置于含 3 m g几 除草剂 B a sat , l m g/ L 6一 B A 和
0
.
l m叭 N A A 的固体 M S 培养基中进行转化体的筛选 。 培养条件为 30 ℃ 2/ 5℃ , 日光灯光照 , 每 2 周继
代 1次 。 获得的芽转到无除草剂并含 .0 5 m g几 N A A
的固体 M S 培养基上生根 。
1
.
4 分子生物学及生物学检测
L .4 1 百合花药瞬间表达检测 经基因枪转化的百
合花药切片在无激素的 M S 培养基上培养 2 4 h 后 ,
用 x 一G luc 染色液染色 24 h 。 将花药切片置于解剖镜
下观察并照相 。
L .4 2 转基因植株的 P CR 检测 以 C TA B 法提取转
基因拟南芥菜叶片总 D N A , 以 B am as e 基因两端序
列作引物做 P CR 检测 , 引物序列如下 :
5
,一
A C T G C
,
A G G A I几C C户口{G , G CA C A , G G彩’T, C A A C A , C G T 一3 ,
5
,一
C C CC T, C G A G C
,
T C G T T, AI
,
C T G
,
A l
,
C T I ’, T G T A一 3,
反应程序为变性 9 4 ℃ 3 m in , 然后 9 4 ℃ 4 5 5 ,
5 5 oC 1m in
,
7 2℃ Z m in , 共 3 0 个循环 , 延伸 7 2 ℃ 8
m in
。 以载体质粒为正对照 , 未转化植株总 D N A 为
负对照 。
1 .4 3 转基因植株的生物学检测 分别取转基因植
株和对照植株刚刚绽开的花 , 用解剖针剖开花瓣在
解剖镜下观察花药和花丝形态 。 取下花药在载片上
剖开 , 并用 I一KI 液染色 , 在解剖镜下观察花粉粒形
成情况 。
2 结果和讨论
.2 1 载体构建 用阴 t h e br ox 的一条片段和 pTA 29
的 3’ 端引物为引物 , 进行 P C R 扩增 。 扩增出的片段
大小与 35 5 和 p T A 2 9 所得的大小相同 , 说明嵌合启
动子的构建正确 。 再把 pG BT 35 S 一B ox 的各元件用
内切酶切下后 , 电泳结果表明各元件连接正确 。
.2 2 嵌合启动子表达特性的瞬间检测 经瞬时表达
质粒 pGT . G U S 用基因枪转化的百合花药横切片 , 经
x
一
lG u 。 染色后 , 在解剖镜下观察到花粉囊周围绒毡
层的位置被染成蓝色 (图 l) , 而花药的其它部位和
用百合鳞茎所作的对照中没有蓝色出现 。 证明了所
构建的嵌合启动子 a n th e br o x 一 35 5 一p T A 2 9 所调控的
G U S 基因的表达是花药绒毡层特异性的。
2 .3 雄性不育转基因拟南芥菜的获得 基因枪轰击
后的根段在含 B as at , 6 一B A 和 N A A 的M S 培养基上
培养 4 周 (2 次继代培养) 后 , 在根段的两端分别发
育成 2一 3 m m 的愈伤组织 。 大部分愈伤组织 呈白色 ,
少量为绿色 (图 2 ) 。 绿色愈伤组 织转移到仍含 B as at
而激素改为 Z IP 5 m g/ L 和 IA A 0 .巧 m叭 的M s 固
体培养基上培养 l 个月左右 (每 2 周继代 1 次 ) 。 愈
伤组织仍保持绿色并有小芽分化出来 。 待小芽长到
2一 3片叶时 , 转到无 B as at 而含 .0 5 m g/ L N A A 的M s
培养基上 。 1 个月后发育成带根的完整小植株并可
在培养瓶中开花结实 。
.2 4 转基因植株的 p C R 检测 转化植株的总 D N A
为模板的 P C R 获得了与正对照大小相同的扩增片
段 , 表明转基因植株的基因组整合了 bam as e 基因 。
未转化植株的负对照没有 P C R 产物的产生 (图 3 ) 。
.2 5 转基因植株的生物学检测 解剖镜观察发现 ,
转基因植株的花丝明显地比对照短 , 转基因植株的
花药低于柱头 (图 4 ) , 而对照植株的花药高于柱头
(图 5 ) 。 花粉粒的染色观察发现 , 转基因植株的花
药中无花粉粒形成 (图 6 ) , 而对照植株的花药中则
布满了正常的花粉粒 (图 7 ) , 并能被 I一KJ 染成蓝褐
色。 表明我们所构建的嵌合启动子在转基因植株中
能正确地调控 B am as e 基因的表达 , 使花药绒毡层
受到破坏 , 而导致花粉粒不能形成 , 获得表现为完
全雄性不育的拟南芥菜个体 。 而且和正常的未转化
植株相比 , 转化个体在高度 , 大小和生活周期上均
无明显差异 。
本研究所报道的花药绒毡层特异嵌合启动子的
构建和转化工作 , 是我们克服 TA 29 七am as e 人工雄性不育系统温度敏感性的一个尝试 。 虽然我们尚未
获得进一步的实验数据来证明我们最初的设想 。 但
是 , 由于我们是在 30℃ 2/ 5 ℃培养条件下获得雄性不
农 业 生 物 技 术 学 报 20 0 1 年
育的拟南芥菜转基因个体 , 而且同样的载体用于转
化木豆 , 所获得的雄性不育的转基因大豆在大田培
育的条件下 , 在花期温度超过 30 ℃ , 也表现为完全
雄性不育 (文章另发 ) 。 因此我们的工作至少部分证
明了嵌合启动子可以克服原单一启动子对温度的敏
感性 。 同时 , 本工作对以后在植物基因工程中嵌合
启动子的应用提供了一个很好的实例 。
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.
1 从飞 e n c h e c kign ht e G U S tr an s ient e xP er s s i o n as s盯 o f P GT -
G U S tr 田” 允 n n e d l ly an htL e r by x ~ G l u c s at in in g , it w a s 。 ” y ot 拓
te c t ht at ht e r e g ion o f t a pe tU m 鹿r o un d po l le n s ac 15 s at i n e d b l u e
图 2 墓因枪轰击后的拟南芥根段的两端分别发育成 2一 3 mm
的愈伤组织 。 大部分愈伤组织呈白色 , 少 t 为绿色
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2 A fet r lt妞 n s fo mr ign 户` ab i d o P s ia t h a li an a or ot ti s su e w iht
P art i e le b om b ar dm
e n仁 -2 3 r 以n以 e ia lu s e ou ld be d e t e c te d , m o st
o f w h lch aer w h iet an d
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参 考 文 献
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,
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, 以 a l . I n d u e t io n fo
m a le s t e ir liyt in P laJ 吐s妙 a eh i m e ir c ir bo n u e l e as e g e n e . N石tu r e ,
199 0
,
347 : 73 7一 74 1
2 李胜国 , 刘玉乐 , 朱锋, 等. 基因工程雄性不育烟草及其温
度敏感性 . 植物学报, 19 9 7 , 3 9 ( 3 ) : 2 32砚 35
3 L陌n i s M, eD lo umr
e .R G o u r e n t J P, et al
.
E x p er s is on of egn i
-
ne
er d nu e l ear m al e set ir liyt i
n Basr
s i e a n aP
u s
.
Plant Phy
s io
,
199 3
,
10 1: 12 95一13 04
4 、 ar n d e r M eer IM , S ta l l l M E . A n t is e n s e ihn ib it io n o f if va o no id
b i 0 yS n ht e s is i n pe tnU i a 助hlt e r s er s u lt s i n m a le s et ir li.yt P lant
C e ll
,
199 2
,
4 (3 )
: 25 3~2 62
5 曹光诚 , 孙勇如 , 陈占宽 , 等. 人工雄性不育和恢复基因的
克隆及构建研究 . 中国农业科学 , 19 6 , 29 (3 ) : 2 0~ 26
6 H i at A
,
M a J K
,
C
.
M o n o cl iao an t ibo 勿 c n g 止eL e n n g in P lan ts .
FBE S L et
e sr
,
1 992
,
307 (1) : 7 1一 7 5
图 3 转化植株的总 D N A 为模板的 P C R 的电泳结果表明转墓
因植株的基因组整合了 b田爪 a名e 基 因
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3 eR
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Pl耐 5 s h o w s ht at th e b田爪 a s e g e en s uc e e s s ful ly ient gr a t ed int o het
g e on m e o f atr g
e t PI川吐 S
A : 分子t M山火e r, B , C , F, :G 转化植株的 PC R产物 ; :D 未转化
植株的 Pc R产物; :E 质粒冈 , 35 sb xo (正对照 ) 的 CP R产物
A: m田服 e几 B, C , F, G: PC R 茂 su lt s 如m t住口 s g en i e Plant s: D: PC R
r . s u lt五” m u n廿 a n s罗 n . c e m劝 or l
图 4 转基因植株的花丝明显地比对照短 , 转墓因植株
的花药低于柱头
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4 T h e ifl am
e n t s fr om
tr an s g e n ic P lan ts aer m
u e h s h o 川七 r
ht an e o n t r 0 1s an d t h e an ht e r 15 l o we
r ht an st ig n l a s
图 5 正常植株的花药高于柱头
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e s t lg m a s o f no mr
a 1ly gr o w in g co n tr o 1P 1ant
s
圈版说明 (见附页 )
图 6 转墓因植株的花药中无花粉粒形成
6 N O OP l le n c o u dl b e d rt e e te d in ht e 别吐he r s o f
t ra n s ge
n i e P lant
s
图 l 经瞬时表达质粒 p G T ~ G U s 用墓因枪转化的百合花药横
切片 , 经 X- G lu c 染色后 , 在解剖镜下观察到花粉囊周围绒毡
层的位里被染成蓝色
图 7 正常植株的花药中布满了正常的花粉粒
iF g
.
7 八刀 t h e邝 丘o m n o n n a lly g or w n c o n tr o l P l别吐s
aer fu l l
o f P o l le n