全 文 ：⒇文章编号: 1008 3464 ( 2006) 03 0185 05
一个与拟南芥 RNA病毒寄主因子同源的水稻基因
OsTOM 3的克隆与序列分析
蒙姣荣1, 2 , 彭靖茹3 , 陈保善1, 3
(广西大学　 1　广西亚热带生物资源保护利用重点实验室 ; 2　农学院
3　生命科学与技术学院 , 广西 南宁 530005)
摘要: 从水稻品种桂 99中克隆了参与烟草花叶病毒的复制的拟南芥 AtTOM 3的同源基因Os TOM 3。该
基 因全长 cDNA共有 1 300个核苷酸 ,包含一个含 885个核苷酸的编码区 、 177个核苷酸的 5′非编码区和
239个核苷酸的 3′非编码区 ,编码一个含 294个氨基酸的蛋白质 ,分子质量为 34. 0 ku,等电点为 9. 51。OsTOM 3
的氨基酸序列包含多个高疏水性区域 , 推测是一种 8次跨膜蛋白。 Os TOM3与 At TOM 3的同源性为 74. 9%。
用 PCR的方法克隆了 OsTOM 3基因的全长转录区 , 共 3 885 bp, 包含 11个外显子和 10个内含子。
关键词: 水稻 ; 寄主因子 ; 基因克隆 ; OsTOM3
中图分类号: Q78　　　文献标识码: A
Cloning and sequence analysis of rice gene OsTOM3 homologue to
RNA virus host factor inArabidopsis
M ENG Jiao rong
1, 2 , PENG Jing ru
3 , CHEN Baoshan
1, 3
( 1　 Guangx i Key Labo rato r y of Subtr opical Bio r esource Conserv ation and U tiliza tion; 2　 Co lleg e of Ag riculture;
3　 Colleg e o f Life Science and Techno lo g y, Guangx i Univ e rsity , Nanning 530005, China)
Abstract: A homologous gene o f At TOM3 of Arabdopsis thaliania, designedOsTOM3, wa s cloned
from rice (Oryza sativa L. ) cultiv ar Gui 99 by RT-PCR and RACE. OsTOM3 wi th 1 300 nt full-leng th
cDN A contains an O RF of 8 8 5 nt encoding a 2 9 4 aa pro tein w ith a calculated molecula r mass of
34. 0 ku and an iso elect ric point o f 9. 51, a 177 nt 5′- and a 239 nt 3′-untransla ted regions. The
deduced amino acid sequence of the Os TOM 3 pro tein contains several highly hydrophobic reg ions and
is presumed to have eigh t t ransmembrane domains. Os TOM 3 shares 74. 9% homo logy wi th AtTOM3,
w hich supports the replica tion of TMV in Arabidopsis . A genomic f ragment of 3885 bp in leng th that
contains the full-leng th t ranscribed region o fOsTOM3 was cloned by PCR. OsTOM3 is composed o f 11
exons and 10 introns.
Key words: rice; host facto r; g ene cloning; OsTOM3
病毒病是水稻的一类重要病害 , 遍布于世界各地的水稻产区。据报道 , 在我国有 11种病毒能侵染
水稻 ,并造成不同程度的危害 [1 ]。植物病毒侵入寄主细胞后 ,在其内进行系统侵染要经历以下几个过程:
第 25卷　第 3期
Vol. 25, No . 3
广 西 农 业 生 物 科 学
Journal o f Guangx i Ag ric. and Bio l. Science
2006年 9月　
Sept. , 2006　
⒇ 收稿日期: 2006 05 24; 　　　修回日期: 2006 06 06。
基金项目: 国家转基因植物研究与产业化专项 ( J00-A-002) ; 广西科技攻关项目 (桂科攻 0228019-1) ; 广西十百千
人才计划 ( 2000201, 2005-32)。
作者简介: 蒙姣荣 ( 1971 ) , 女 , 广西忻城人 , 广西大学讲师 , 博士 ; E-mail: meng jiao rong@ 163. com。
通讯作者: 陈保善 , 教授 , 博士生导师 ; E-mail: chenyaoj@ gxu. edu. cn。
病毒的脱衣壳、 病毒的基因组复制及蛋白质的合成、 新的病毒颗粒的组装及病毒细胞间的运输和长距
离运输等 [ 2]。由于病毒结构简单 , 不能独立完成复制和体内运输 , 而必须依赖寄主提供某些因子 (如蛋
白质 )、某些结构等才能完成整个生命循环。这些支持病毒的复制及其在植物体内运输的寄主蛋白和结
构统称为寄主因子 [3, 4 ]。目前 ,已从拟南芥中克隆和鉴定了 3种与烟草花叶病毒 ( Tobacco mosaic v irus,
TMV ) 的高效复制有关的寄主因子基因 AtTOM1、 At TOM2和 AtTOM3[5～ 9 ] , 其中 At TOM3基因编码
六次或七次跨膜蛋白 , 与 At TOM 1有 56%同源性 , 在酵母双杂交系统中 , 该基因编码的蛋白与 TMV
的 RdRp的解旋酶功能域相互作用。 TMV在 AtTOM 1突变的拟南芥中还能进行低水平的复制 , 但在
At TOM1和 At TOM3双突变的拟南芥中检测不到 TMV, 说明 At TOM 3在 TMV的复制过程中具有重
要的作用 [7 ]。
目前 ,在主要农作物中尚未有病毒寄主因子的报道。笔者在 GenBank中进行同源序列搜索时发现 ,
水稻 (Oryza sativa L. ) 表达序列标签 ( expressed sequence tag s, EST ) 序列 AU164690 ( gi:
11173257)与 AtTOM3在核苷酸水平上有一定的同源性。为了研究水稻中与 AtTOM3同源的基因在水
稻病毒复制中的功能 ,笔者利用快速扩增 cDN A末端 ( rapid amplica tion of cDN A Ends, RACE)方法 ,
从水稻中克隆了该基因 (命名为 OsTOM3) 的全长 cDN A序列 , 用 PCR方法克隆了其基因组序列 , 并
对其结构和同源性进行了分析。
1　材料与方法
1. 1　材料
本研究中所用水稻品种为桂 99。播种前 , 用 50°C温水浸泡种子 10 min, 自然冷却至室温后再浸泡
8 h。水稻秧苗种植在 25～ 30°C、 日照 12～ 14 h的条件下 , 采集苗期叶片提取总 RNA和总 DNA。
1. 2　酶和试剂盒
T4 DNA连接酶、 3′RACE试剂盒和 pCR 2. 1-TO PO T A-Cloning Ki t购自 Inv it rog en公司 , cDN A
合成试剂盒 ( SM ARTTM RACE cDNA Amplification Ki t ) 购自 BD Bio sciences Clontech公司 , 各种限
制性内切酶购自 TaKaRa公司 , 质粒提取试剂盒购自上海开瑞公司 , 常用化学试剂均为国产分析纯试
剂。
1. 3　核酸的提取
参照 Sambrook等 [10 ]的方法 , 用异硫氰酸胍法提取水稻总 RNA。参照 Clark [11 ]的方法 , 用 CT AB
( Cetyl trimethyl Ammonium Bromide, 溴代十六烷基三甲胺 ) 法提取水稻总 DNA。
1. 4　 PCR引物设计
根据水稻 EST 序列 AU164690 ( gi: 11173257) , 设计两条正向引物 rtom3-1 ( 5′-CT AT
T GGATCAATGCTGTGATC -3′)和 rtom3-3( 5′-TCTA TGCAATTCAGAT AAT ATT ATGG -3′) ,两
条反向引物 rtom3-2 ( 5′-CCTCCTGCAATT TCT TGCGCCG-3′) 和 rtom3-4 ( 5′-TCCTT TCGAT
TCAACTGGGAAACGT -3′) , 分别用于 3′RACE和 5′RACE。
根 据本研 究获得的 cDN A序列 , 设 计两对引物 rtom3-A ( 5′-CTCGAACCTCCACGCG
AGT TCGCG-3′, 1～ 24 nt ) /rtom3-C( 5′-AA TT TCT TGCGCCG TCCTT TCGA T T-3′, 830～ 806 nt )和
rtom3-B( 5′-TT ATGGATGGTTCTATGGTGGAAAC-3′, 661～ 685 nt ) /rtom3-D ( 5′-CTGT AACAA
CACCAGATTGC-3′, 1 245～ 1 226 nt ) , 用于 OsTOM3全长基因的 PCR克隆。引物由上海生工生物
工程有限公司合成。
1. 5　水稻 OsTOM 3基因 cDNA片段的 3′RACE和 5′RACE PCR扩增
用 3′RACE试剂盒合成 OsTOM 3基因 3′端的 cDN A。以获得的第一链 cDN A为模板 ,用
rtom3-1 /AUAP ( 5′-GGCCACGCGTCGACT AGT AC-3′)为引物进行第一次 PCR, 再以第一次 PCR产
物为模板 , 以 rtom3-3 /AU AP为引物进行第二次 PCR, 扩增特异性带。用 cDN A合成试剂盒合成
OsTOM3 基 因 5′端 的 cDN A, 以 获 得 的 反 应 物 为 模 板 , 用 rtom3-2 和 U PM ( 5′-
CT AATACGACTCACT ATAGGGCA AGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′) 为引物 , 进行第一次
186 广 西 农 业 生 物 科 学 第 25卷　
PCR反应 ,再以第一次 PCR产物 (稀释 100倍 )为模板 , rtom3-4和 NU P ( 5′-AAG CAGTGG TATCA
ACGCAGAGT-3′) 为引物 , 进行第二次 PCR反应。
1. 6　水稻 OsTOM 3基因全长 DNA的 PCR扩增
PCR反应体系总体积为 2 5μL: DN A模板 (约 1 0 ng ) 1. 0μL, 1 0× Ex Taq Buf fer 2. 5μL,
2. 5 mmo l /L dN TP 1. 0μL,引物 rtom3-A和 rtom3-C或 rtom3-B和 rtom3-D各 1μL, Ex Taq 0. 1μL,
适当的 ddH2O补足至 25μL。反应条件为: 95°C预变性 3 min; 94°C变性 30 s, 64°C退火 30 s, 72°C延
伸 180 s, 循环 30次 ; 最后 72°C延伸 10 min。
1. 7　 PCR产物的克隆与重组质粒的鉴定
用 TOPO TA Cloning Ki ts直接克隆 PCR产物。连接反应体系总体积为 3μL: 2 μL PCR产物 ,
0. 5μL Sal t So lution和 0. 5μL pCR 2. 1-TOPO Vecto r。连接在室温下反应 30 min后用于转化大肠杆
菌菌株 TO PO 10。 在 X-gal / IPTG /Amp+ Kan琼脂平板 ( LBA) 上挑选白色菌落培养。用碱性裂解
法提取质粒。 用 EcoRⅠ进行酶切筛选阳性克隆。
1. 8　序列测定与比较分析
选取含有外源片段的阳性克隆 ,在 DNA自动测序仪 ABI377上进行测序。序列测定结果采用N CBI-
Blast程序 ( ht tp: / /www . ncbi. nlm. nih. gov /Pblast ) 进行同源性搜索 , 用在线软件 ProtScale
( ht tp: / / www. expasy. org /tool /pro tscale. h tml ) 和 TM Pred ( h t tp: / /www . ch. embnet. org /cgi-
bin / TM PREN-FORM-PARSER)分别进行蛋白质的疏水性和跨膜区分析 ,利用 Vecto r N TI 6. 0软件
进行 DNA序列拼接、 核酸及推导的氨基酸序列的同源性分析和等电点的计算等。
2　结果与分析
2. 1　OsTOM3基因全长 cDNA的克隆与序列分析
图 1　OsTOM3 RACE产物的电泳分析
Fig. 1　 Electrophoretic analysis of RACE products
M. Gene Rule r 100 bp DN A Ladder;
1. 5′RACE产物 ; 2. 3′RACE产物
M. Gene Ruler 100 bp DNA ladder;
1. 5′RACE produc ts; 2. 3′RACE products
以水稻总 RNA为模板 ,利用 3′RACE方法获得 1条
约 700 bp特异性带 ,利用 5′RACE方法获得 1条约850 bp
的特异性带 (图 1)。将获得的 PCR产物纯化后分别克隆
到 pCR2. 1-TO PO10 V ector上进行序列测定。测序结果
显示 , 前者由自 3′端 poly ( A) 起共 678个核苷酸组成 ,
末端带有含 18个 “ A” 的 po ly ( A)尾巴 ; 后者由自 5′端
起共 816个核苷酸组成 , 二者有 176个核苷酸的重叠区 ,
拼接后获得完整的 OsTOM3基因全长 cDN A序列 , 共有
1300个核苷酸 [poly ( A) 除外 ] (图 2)。用 Vector N TI
6. 0软件分析表明 ,该 cDN A由 177个核苷酸的 5′非编码
区和 238个核苷酸的 3′非编码区以及 1个包含 885 nt的
图 2　OsTOM3基因 cDNA的核苷酸和演绎氨基酸序列
Fig. 2　 Nucleotide and deduced amino acid sequences of OsTOM3
下画线部分表示跨膜区域 Puta tiv e membrane-spanning r eg ions a re under lined
187第 3期 蒙姣荣等: 一个与拟南芥 RN A病毒寄主因子同源的水稻基因 OsTOM 3的克隆与序列分析
编码区组成 , 演绎的蛋白质含 294个氨基酸残基 , 其分子量为 34. 0 ku, 等电点为 9. 51。
用在线软件 Prot Scale对Os TOM3基因所编码蛋白质的疏水性进行分析 ,结果表明 , OsTOM3基因
所编码蛋白质包含多个高疏水性的区域。 用在线软件 TMPred进行跨膜结构区预测 , 结果显示 ,
Os TOM 3有 8个跨膜区域 (图 2)。
2. 2　OsTOM3基因的同源性分析
将 OsTOM3基因的演绎氨基酸序列在 NCBI上进行 BlastX搜索 , 发现该基因编码的蛋白与
AtTOM 3和 At TOM 1的同源性分别为 74. 9%和 58. 2% , 相似性分别为 83. 8%和 71. 1% (图 3)。
图 3　OsTOM3演绎的氨基酸序列与来自拟南芥的 AtTOM1和 AtTOM3的同源性比较
Fig. 3　 Alingnment of deduced amino acid sequence of OsTOM3 with AtTOM1 ( gi: 9967413)
and AtTOM3 ( gi: 15425641) fromArabidopsis thaliana.
相同的氨基酸残基用黑色背景标注
Identica l amino acid residues a re marked with bla ck backg round
2. 3　OsTOM3全长 DNA基因的克隆与序列分析
图 4　OsTOM3基因组片段的 PCR扩增
Fig. 4　 PCR products of genomic f ragment of OsTOM3
M. GeneRuler 1 kb DN A marker;
1. A片段 ( A fra gment w ith primer s rtom3-A /r tom3-C) ;
2. B片段 ( B fr agment with primer s rtom3-B /r tom3-D)
根据本研究获得的 OsTOM3 cDN A序列
设计两对引物: r tom3-A ( 1～ 24 nt ) / rtom3-C
( 830～ 806 nt ) 和 rtom3-B ( 661～ 685 nt ) /
rtom3-D ( 1 245～ 1 226 nt ) , 以水稻总 DNA为
模板进行 PCR扩增 ,分别获得 1条约 2. 8 kb的
特异性带 ( A片段 ) 和 1条约 2. 0 kb的特异性
带 ( B片段 ) (图 4)。
将 A片段和 B片段分别克隆到 pCR2. 1-
TO PO V ecto r后进行序列测定 , 结果表明 , A
片段全长 2 846 bp, B片段全长 2 015 bp, 两者
有 1 03 7 bp的重叠区 。通过序列拼接 ,获得
3 823 bp的序列 , 再与全长 cDN A的 3′末端序
列 ( 1 246～ 1 300,共 55 bp)拼接 ,获得OsTOM3
基因转录区全长序列共 3 878 bp。 将获得
OsTOM3的转录区序列与全长 cDN A序列进行对比 ,结果表明 , Os TOM3基因包含 11个外显子和 10个
内含子。外显子的长度依次为 345、 91、 53、 93、 72、 73、 46、 64、 54、 78和 331 bp; 内含子的长度依
次为 251、 103、 86、 86、 621、 383、 485、 92、 88和 383 bp, 外显子和内含子交接处的边界序列遵循
“ GT /AG” 规则。
用 Blast程序对 GenBank数据库进行同源性搜索 ,发现 OsTOM3基因位于已测序的粳稻品种
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( japonica cultiva r-g roup)第十染色体 ,与 20428657～ 20432522位的 DNA序列有 99. 1%的同源性 ,仅有
16个碱基发生改变 ,其中与 OsTOM 3的 cDN A序列对应的有 5个碱基 ,非编码区 2个 ( 101位 , A→ G;
105位 , T→ C) , 编码区 3个 ( 237位 A→ G及 543位 T→ C均为无义突变 , 904位 A→ G使相应氨基酸
从苏氨酸变为苯丙氨酸 )。 在 OsTOM3基因组序列的 2923位 (即位于第八个内含子上 ) 后有 8个碱基
( ATCATGT A) 插入 , 3849位 (与 cDN A序列 3′端的非编码区 1279位对应 ) 后有 6个碱基
( TAT ATA) 插入。
3　讨论
在拟南芥中 , At TOM1和 At TOM3基因突变后使 TMV的复制受抑制 , 但突变株在常规的栽培管
理条件下仍能正常生长 [5, 7 ]。这些研究结果表明 ,通过抑制寄主因子的表达来获得抗病毒新种质是有可
能的。 这一策略能否在农作物抗病毒中应用 , 很大程度上取决于发现并克隆更多来源于农作物的寄主
因子基因。水稻基因组测序工作的完成 , 为研究水稻相关基因的功能提供了便利条件。本研究通过同
源序列搜索和 cDN A克隆方法 , 首次从水稻中克隆了拟南芥 AtTOM3的同源基因 OsTOM3。 OsTOM 3
编码的蛋白在成分和结构上与拟南芥的 AtTOM 3有较高的同源性 , 暗示二者可能具有相似的功能 , 即
参与植物 RNA病毒的复制过程。
本研究首次获得了水稻 OsTOM3基因全长 cDN A序列和基因结构的信息 , 为进一步研究该基因的
功能打下了基础。 目前 , 对 OsTOM3基因与水稻病毒复制的关系的研究正在进行中。
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(责任编辑　裴润梅 )
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