全 文 ：分子植物育种，2015年，第 13卷，第 7期，第 1631-1638页
Molecular Plant Breeding, 2015, Vol.13, No.7, 1631-1638
研究报告
Research Report
中山杉 EST-SSR引物通用性及基因分型检测
王紫阳 1 成彦丽 2 殷云龙 1* 於朝广 1 李火根 2*
1江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园),南京, 210014; 2南京林业大学,南京, 210037
*通讯作者, yinyl066@sina.com; hgli@njfu.edu.cn
摘 要 为分析中山杉 EST-SSR标记的跨科间通用性及其在基因分型中的应用效果，本研究利用从中山
杉 406 EST序列中开发的 503对 SSR引物，以中山杉 302与墨西哥落羽杉 2个亲本及其杂种 F1群体 150
个单株为材料，检测了该批引物在中山杉杂种子代群体基因分型中的应用潜力。同时，以杉科、柏科、松科、
红豆杉科 15属 16种的 DNA样品为材料，根据引物在中山杉中的检测结果，选取 60对引物(15对多态性
扩增, 15对单态扩增, 30对无扩增产物)，检测了该批引物跨科间的通用性。结果表明：503对引物中，17对
(3.38%)引物在落羽杉属中多态性扩增，并能准确鉴别亲本及杂种 F1群体 150个单株的基因型，表明该批
SSR引物可有效用于中山杉基因分型分析。15对多态性引物在杉科、柏科、松科、红豆杉科中的通用率分
别为 60%~73.33%、26.67%~53.33%、46.67%和 40%，其中 10对(83.33%)在杉科扩增出多态，3对(37.5%)在
柏科中扩增出多态。15对无多态性引物在上述 4科中的通用率分别为 20%~40%、0~20%、20%和 0。此外，
30对在中山杉中无扩增产物的 SSR引物中，2对可在其他科属中有效扩增。本研究结果表明，该批 SSR引
物可应用于中山杉群体遗传结构分析，指纹图谱及遗传图谱构建等领域，并进一步讨论了该批引物在其它
针叶树种中的应用潜力。
关键词 中山杉 406, EST-SSR,通用性,基因分型
The Cross-family Transferability of SSR Markers Developed from the
Transcriptome of Taxodium‘Zhongshanshan 406’and Its Application in
Genotypic Assessment
Wang Ziyang 1 Cheng Yanli 2 Yin Yunlong 1* Yu Chaoguang 1 Li Huogen 2*
1 Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences (Nanjing Botanical Garden Mem. Sun Yat-Sen), Nanjing, 210014; 2 Nanjing
Forestry University, Nanjing, 210037
* Corresponding authors, yinyl066@sina.com; hgli@njfu.edu.cn
DOI: 10.13271/j.mpb.013.001631
Abstract To analyze the cross-family transferability of EST-SSR markers of Taxodium‘Zhongshanshan’and its
potential availability in genotypic assessment, the genotypes of Taxodium‘Zhongshanshan 302’and Taxodium
mucronatum along with 150 individuals of their F1 progeny were identified by 503 pairs of EST-SSR markers
developed from Taxodium‘zhongshanshan 406’. And according to the amplified results of these primers in
Taxodium‘Zhongshanshan’, an experiment was conducted to study the cross-family transferability of 60 pairs of
primers (including 15 polymorphic primer pairs, 15 primer pairs without polymorphism, 30 primer pairs without
products) in 16 conifers from 15 genera of Taxodiaceae, Cupressaceae, Pinaceae and Taxaceae. The results showed
that: among 503 pairs of SSR primers, 17(3.38%) markers amplified polymorphism bands in Taxodium and had been
genotyped accurately among the 150 individuals of F1 progeny. Thus, these SSR primers could potentially serve as
收稿日期：2015-01-27 接受日期：2015-03-01 网络出版日期：2015-05-15
URL: http://www.biopublisher.cn/index.php/mpbopa/article/view/2967
基金项目：本研究由江苏省科技公共服务平台项目(BM2012058)、江苏省科技支撑计划(农业)项目(BE2012343)和江苏省农业科技
自主创新资金项目(CX132046)共同资助
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
effective markers for genotypic assessment of Taxodium‘Zhongshanshan’. The transferability of 15 polymorphic
primers in Taxodiaceae, Cupressaceae, Pinaceae and Taxaceae were 60%~73.33%, 26.67%~53.33%, 46.67%, 40%,
respectively.Amongthe15primerpairs,10(83.33%)and3(37.5%)markerswere found tobepolymorphic inTaxodiaceae
and Cupressaceae, respectively. The transferability of 15 primers without polymorphism was 20%~40%, 0~20%,
20%, 0 in the four families above, respectively. Moreover, among the 30 primers without products in Taxodium
‘Zhongshanshan’, 2 pairs of primers were successfully amplified in other families. Overall, these SSR markers
could be applied to population genetic structure analysis, construction of fingerprinting and genetic mapping and
related fields of Taxodium‘Zhongshanshan’. Furthermore, the potential applications of these primers in other conifers
were also discussed.
Keywords Taxodium‘Zhongshanshan 406’, EST-SSR, Transferability, Genotypic assessment
简单序列重复(simple sequence repeats, SSRs)，又
称为微卫星 DNA (microsatellite DNA)，是以 1~6 个
核苷酸为单位多次串联重复的 DNA序列。SSRs具
有重复性好、特异性强、多态性丰富、共显性遗传、基
因组覆盖率高等优点，可用于遗传图谱构建、分子辅
助育种、群体遗传结构分析及比较基因组学研究(胥
猛和李火根, 2008; Wünsch, 2009; Hu et al., 2010; 李
红英等, 2011; Chai et al., 2013)。根据其序列来源不同
可将 SSR标记分为两类：基于基因组序列的Genomic-
SSR (gSSR)和基于表达序列标签(expressed sequence
tags, ESTs)的 EST-SSR (Poncet et al., 2006; Bérubéet
al., 2007)。gSSR来源于基因组非编码区，多态性较
高，但其开发需要已知 DNA序列信息、构建和筛选
DNA文库，因此开发成本高且周期较长(Hu et al., 2010;
Huang et al., 2011; Zhang et al., 2012)。EST-SSR来源
于基因组编码区，可直接或间接反映基因功表达信
息，由于 EST是对 cDNA文库中随机挑选的克隆测
序而得，因而避免了 gSSR需要构建 DNA文库等繁
琐步骤，随着 EST数据的大量积累以及生物信息学的
快速发展，从 EST数据中开发 EST-SSR标记已经成
为一种非常有效的 SSR开发手段(胥猛和李火根, 2008;
Hu et al., 2010; Chai et al., 2013)。
中山杉(Taxodium‘Zhongshanshan’)是落羽杉属
(Taxodium)种间、种内杂交选育得到的优良无性系的
总称，具有耐水湿、耐盐碱、观赏价值高等优点，广泛
应用于我国公路及城乡绿化、沿海滩涂造林等方面
建设(於朝广等, 2011; Qi et al., 2014)。然而，以往对
于落羽杉属杂交优势利用的研究主要依据子代表型
选择，遗传改良周期较长且杂种真实性难以准确鉴
别。本研究利用 503对中山杉 406(Taxodium‘Zhon-
gshanshan 406’) EST-SSR引物，检测了该批引物在
中山杉 302 (Taxodium‘Zhongshanshan 302’)、墨西哥
落羽杉(Taxodium mucronatum)及 150个 F1分离群体
单株的基因分型中的应用效果，为中山杉新品种鉴定
及优良性状早期选择提供了一种有效的研究途径。
针叶树种是现存裸子植物中数目和种类最多的
类群，在森林资源保护、被子植物起源和系统演化中
处于重要的地位(Tsumura et al., 1995; Lu et al., 2013a)。
相对于杨属(Populus)、桉属(Eucalyptus)等阔叶树种
而言，基因组较大、DNA序列缺乏的针叶树种的研
究较为滞后，其原因主要是缺乏有效的分子标记，尤
其是多态性好、通用性高的共显性标记。本研究从
503对中山杉 EST-SSR引物中，根据引物在中山杉
中的检测结果，选取 60对引物(15对多态性扩增, 15
对单态扩增, 30对无扩增产物)，检测了该批引物在
杉科(Taxodiaceae)、柏科(Cupressaceae)、松科(Pinaceae)、
红豆杉科(Taxaceae)的 16个树种中的通用性，以期为
上述针叶树种分子生物学及相关领域研究提供合适
的 DNA分子标记。
1结果与分析
1.1中山杉杂种 F1群体的 SSR基因型检测
503对 EST-SSR引物中，17对(3.37%)引物在 2
个亲本中山杉 302、墨西哥落羽杉及其杂种 F1群体
中扩增出多态(图 1;图 2)。结果表明，位点 TA0158
在两个亲本中呈现相同基因型，由于 SSR标记为共
显性标记，所以理论上 F1群体中可能有 3种基因型：
显性纯合子、隐性纯合子，以及杂合子。由图 1可知，
位点 TA0158成功实现了 150个落羽杉属杂种的基
因型鉴定。同理，标记 TA310在母本中呈现杂合基因
型，在父本中呈现纯合基因型，在 F1群体中可能有两
种基因型：母本基因型和父本基因型。该标记扩增结
果如图 2所示，表明该批 SSR引物可有效用于中山
杉基因分型分析。
1.2中山杉 EST-SSR引物通用性分析
根据引物在中山杉中的检测结果，从 503对中
1632
图 2引物 TA0310在亲本及部分 F1分离群体后代中的扩增
注: M: DL50 DNA marker; 1:母本‘中山杉 302’; 2:父本墨西哥落羽杉; 3~40:杂交 F1子代
Figure 2 The amplification of primer TA0310 among parents and partial individuals of F1 progeny
Note: M: DL50 DNA marker; 1: Female parent Taxodium‘Zhongshanshan 302’; 2: Male parent Taxodium mucronatum; 3~40: F1 hy-
brid progeny of Taxodium‘Zhongshanshan 302’and Taxodium mucronatum
山杉 EST-SSR引物中，选取 60对引物(15对多态性
扩增, 15对单态扩增, 30对无扩增产物)，检测了该批
引物在杉科、柏科、松科、红豆杉科的 16个树种中的
通用性(表 1)，标记预期产物大小为 134~277 bp (表
2)。结果表明，60对 SSR引物中，20对能有效扩增。
15对多态引物中，12对(80%)在杉科中有效扩
增，10对(83.33%)扩增出多态。其中，在日本柳杉、台
湾杉中有效扩增的引物各 9对(60%)，在柳杉、杉木、
水杉中有效扩增的引物各 10对(66.67%)，在水松、北
美红杉中有效扩增的引物各 11对(73.33%)，因此，15
对多态引物在杉科的引物通用率、多态率分别为
60%~73.33%、83.33%。该 15对引物中，4~8对在柏
科不同属种中有效扩增，3对扩增出多态，引物通用
率、多态率分别为 26.67%~53.33%、37.5%；7对在松
科中有效扩增，引物通用率为 46.67%；6对在南方红
豆杉中有效扩增，引物通用率为 40%。
15对无多态引物在杉科、柏科、松科、红豆杉科不
同属种间的引物通用率分别为 20%~40%、0~20%、
20%、0。无多态引物 TA0168在 16种针叶树中的扩增
结果显示，该引物在落羽杉属扩增产物为单一条带，而
在其它科属中表现出了一定的多态性(图 3)。30对无产
物引物中，仅 2对引物能有效扩增，其中，引物 TA037
在杉木中有扩增产物，引物 TA077在除了南方红豆杉
之外的 15个树种中均能扩增出多态性条带(图 4)。
2讨论
2.1中山杉 EST-SSR标记多态性及其应用潜力
503对 EST-SSR引物中，17对在中山杉 302、墨
西哥落羽杉及 F1分离群体中扩增出多态，引物多态
率 3.37%，低于柑橘(Citrus reticulate)×枳(Poncirus tri-
foliate) F1分离群体的 53% (Chai et al., 2013)、尾叶桉
(Eucalyptus urophylla)×细叶桉(Eucalyptus tereticornis)
F1分离群体的 28.65% (王宇, 2009)、美洲黑杨(popul-
us deltoids)×小叶杨(populus simonii) F1分离群体的
44.68% (李旭冉, 2012)。
该批 SSR引物中能有效用于中山杉 302×墨西
哥落羽杉 F1分离群体单株基因型鉴定的标记数量较
少(17个多态性标记)，其原因可能与亲本间较近的
亲缘关系及回交群体可检测的多态性位点数少有关
(蔡娟娟, 2009)。中山杉 302是从落羽杉与墨西哥落
羽杉杂交 F1代选育得到的优良单株(於朝广等, 2011)，
其与墨西哥落羽杉杂交属于种内水平的近缘杂交，
DNA序列差异是基因分型的分子基础，亲本间遗传
差异较小会限制分离群体中多态性标记的数量(王
宇, 2009;贯春雨, 2010)。另外，银染检测分辨率低(郝
晨阳等, 2005) 也是限制分离标记数量的一个重要因
素，当两个等位基因序列大小差异较小时，银染后胶
图上的多态位点便难以准确识别，如图 1显示引物
TA0158在中山杉 302与墨西哥落羽杉 F1分离群体
中的两个分离位点间距较小，使得位点识别及子代
分离类型的判定受到了很大的限制。因此，在利用分
子标记开展基因分型等研究工作时应提高分离群体
中多态位点的检测手段，以提高实验效率及研究结
果的准确性。
落羽杉属植物遗传学研究基础相对较为薄弱，
虽然已有相关研究先后利用 RAPD、SRAP对落羽杉
中山杉 EST-SSR引物通用性及基因分型检测
The Cross-family Transferability of SSR Markers Developed from Zhongshanshan 406 and Its Application
图 1引物 TA0158在亲本及部分 F1分离群体中的扩增
注: M: DL50 DNA marker; 1:母本‘中山杉 302’; 2:父本墨西哥落羽杉; 3~40:杂交 F1子代
Figure 1 The amplification of primer TA0158 among parents and partial individuals of F1 progeny
Note: M: DL50 DNA marker; 1: Female parent Taxodium‘Zhongshanshan 302’; 2: Male parent Taxodium mucronatum; 3~40: F1 hy-
brid progeny of Taxodium‘Zhongshanshan 302’and Taxodium mucronatum
1633
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
表 1中山杉 406 EST-SSR引物的跨科间通用性
Table 1 Cross-family transferability of EST-SSR primers of Taxodium‘Zhongshanshan 406’
编号
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
种
Species
日本柳杉
Cryptomeria japonica
柳杉
Cryptomeria fortunei
水松
Glyptostrobus pensilis
北美红杉
Sequoia sempervirens
台湾杉
Taiwania cryptomerioides
杉木
Cunninghamia lanceolata
水杉
Metasequoia glyptostroboides
日本扁柏
Chamaecyparis obtusa
侧柏
Platycladus orientalis
福建柏
Fokienia hodginsii
北美圆柏
Sabina virginiana
杜松
Juniperus rigida
柏木
Cupressus funebris
南方红豆杉
variety of Taxus wallichiana
雪松
Cedrus deodara
黑松
Pinus thunbergii
15对多态引物
15 pairs of
polymorphic primers
60
66.67
73.33
73.33
60
66.67
66.67
53.33
40
40
26.67
40
53.33
40
46.67
46.67
15对无多态引物
15 pairs of primers
without polymorphism
26.67
20
40
20
20
20
20
20
6.67
13.33
6.67
6.67
0
0
20
20
30对无产物引物
30 pairs of primers
without products
6.67
6.67
6.67
6.67
6.67
13.33
6.67
6.67
6.67
6.67
6.67
6.67
6.67
0
6.67
6.67
通用率(%)
Transferability (%)
属杂交后代亲缘关系进行过探索(陈云鹏等, 2002;李
涵等, 2007;於朝广等, 2009)，但对于其分子生物学
研究进展不大，其原因主要是缺乏多态性和重复性
好的共显性标记。本研究筛选的多态性 SSR引物，能
准确区分种内杂交子代的不同基因型，特异性强且
稳定性较好。可以预计，该批多态引物在落羽杉属种
群遗传结构、品种指纹图谱构建等研究领域中将发
挥重要的作用，尤其对于分析遗传背景较近的资源
意义重大。同时，在进行落羽杉属新品种 DUS (dis-
tinctness, uniformity and stability)测试时，在对测试材
料进行形态鉴别的同时结合 SSR检测，可以大大缩
短测试时间，提高测试的准确性。
此外，本研究报道的中山杉 EST-SSR标记可为
落羽杉属植物遗传图谱构建提供一种较好的分子标
记。在图谱构建时应选择具有一定遗传差异的树种
作为作图亲本，保证作图群体存在较为丰富的多态
1634
图 3引物 TA0186在 16个针叶树种中的扩增
注: M: DL50 DNA marker; 1~3: 日本柳杉; 4~6:柳杉; 7~9:水松; 10~12:北美红杉; 13~15:台湾杉; 16~18:杉木; 19~21:水杉;
22~24:日本扁柏; 25~27:侧柏; 28~30:福建柏; 31~33:北美圆柏; 34~36:杜松; 37~39:柏木; 40~42:南方红豆杉; 43~45:雪松;
46~48:黑松
Figure 3 The amplification of primer TA0186 in 16 conifers
Note: M: DL50 DNAmarker; 1~3: Cryptomeria japonica; 4~6: Cryptomeria fortunei; 7~9: Glyptostrobus pensilis; 10~12: Sequoia sempe-
rvirens; 13~15: Taiwania cryptomerioides; 16~18: Cunninghamia lanceolata; 19~21: Metasequoia glyptostroboides; 22~24: Chamaecyp-
aris obtusa; 25~27: Platycladus orientalis; 28~30: Fokienia hodginsii; 31~33: Sabina virginiana; 34~36: Juniperus rigida; 37~39: Cupre-
ssus funebris; 40~42: Taxus wallichiana; 43~45: Cedrus deodara; 46~48: Pinus thunbergii
表 2 EST-SSR引物序列、退火温度及预期产物长度
Table 2 Primers, annealing temperature, expect product sizes of EST-SSR
引物名称
Primer name
TA037
TA077
TA0106
TA0132
TA0158
TA0186
TA0197
TA0208
TA0210
TA0214
TA0222
TA0231
TA0283
TA0310
TA0386
TA0399
TA0400
TA0443
TA0448
TA0451
正向引物(5-3)
Forward primer (5-3)
CCGAGGAGCTGCACTATGAG
TGGTGTTTGTTAGGAGGGCC
ATCGTCATCGTCATCGTCCG
CACCTTCCAAGCGGAGGATT
GTGCCGGTTTGGGAAATCAC
GGCCGGTCCAAGAGAAAAGA
GGTCAGGGGTTCGATTCTGG
TCTCACTGGTCGAAAGCCAC
GCTTGGAGGTGTTCGAGGAA
AGGGGATTGGAAGGAGACGA
CGTAGGAAGGTGCCGTTTCT
GGTGTTGGAGGAAGGCAAGA
CAAGCAGAGTCCAAGCCAGA
CAGCGGATCCTCTCGATGAC
TTAGCACCTTCACCGCCAAT
ATGGACCCATTTGCGGATGT
GTAAAGGATTGAGCGCAGTGG
AGATTGCTGGTACCTTGGGC
CCATGGCAGGCGCAAATATC
GTTGGGCTTCTTCTCCGACA
反向引物(5-3)
Reverse primer (5-3)
CACGCTCGGCAATAAGCTTC
TGCACAGCAGCCTTTATGGA
TTGTTGAACCGGTGCTGGAT
GAGGTCCTTTATGCGTGGCT
ACCCCAAATCCACCTGCAAA
TTTTCGACACCCTCTGGACG
CCACGTTAGCAGGGTTCGAA
CAGAAGGGCCCAAATTCCGA
GACCCCAGAGTGACAGTTGG
ACGTATGTCACCATCCGCTG
CTCAGCCAAGTAGGTGCTCC
TAATGCCAGATGGTGCTGCA
TGCCTTCACCATGGCCTTAC
ATCTAACCGGCAAACCTGGG
GATTCCCAACAAGAGGGCGA
TGACCCTCCCATATCCACGT
ATGAAGCGCTCTTCCTCTGG
ATTGGGCCCTCAGGATCTGA
TTTTGGATTCAACGCTGCCG
TTGTCCTCTAGGGGCCAGAG
退火温度
Annealing temperature
60.0
60.0
60.1
60.1
60.0
60.0
60.0
60.0
60.0
60.2
60.1
60.0
60.0
60.2
60.0
60.0
60.0
60.0
60.1
60.0
预期产物长度(bp)
Expect product size (bp)
195
275
218
237
252
239
277
173
274
240
277
188
210
230
190
273
262
181
134
224
性位点；另一方面，选择作图标记时，在利用 SSR标
记的同时还应结合 SNP、SRAP、AFLP等其它分子标
记，以获得较多的分离标记。
2.2 中山杉 EST-SSR 引物的跨科属间的通用性及应
用前景
许多研究表明 EST-SSR 在植物种属间具有较
高的通用性(Castillo et al., 2008; Wünsch, 2009; Hu et
al., 2010;李红英等, 2011; Chai et al., 2013; Lu et al.,
2013b)。本研究 15 对落羽杉属多态引物中，12 对
(80%) 在至少 1个树种中有效扩增，部分引物在 16
个树种中均能有效扩增，10对(83.33%)扩增出多态，
表现出较高的通用性和多态性。该 15对引物在杉科
不同属种中的通用率为 60%~73.33%，接近于柑橘属
(Citrus) EST-SSR 引物在山橘(Fortunella hindsii)、枳
(Poncirus trifoliate)中的通用率 74%和 73% (Chai et
al., 2013)，部分或全部高于鹅掌楸属(Liriodendron)
EST-SSR引物在木兰科(Magnoliaceae)各属种中的通
中山杉 EST-SSR引物通用性及基因分型检测
The Cross-family Transferability of SSR Markers Developed from Zhongshanshan 406 and Its Application 1635
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 4引物 TA077在 16个针叶树种中的扩增
注: M: DL50 DNA marker; 1~3: 日本柳杉; 4~6:柳杉; 7~9:水松; 10~12:北美红杉; 13~15:台湾杉; 16~18:杉木; 19~21:水杉;
22~24:日本扁柏; 25~27:侧柏; 28~30:福建柏; 31~33:北美圆柏; 34~36:杜松; 37~39:柏木; 40~42:南方红豆杉; 43~45:雪松;
46~48:黑松
Figure 4 The amplification of primer TA077 in 16 conifers
Note: M: DL50 DNAmarker; 1~3: Cryptomeria japonica; 4~6: Cryptomeria fortunei; 7~9: Glyptostrobus pensilis; 10~12: Sequoia sempe-
rvirens; 13~15: Taiwania cryptomerioides; 16~18: Cunninghamia lanceolata; 19~21: Metasequoia glyptostroboides; 22~24: Chamaecyp-
aris obtusa; 25~27: Platycladus orientalis; 28~30: Fokienia hodginsii; 31~33: Sabina virginiana; 34~36: Juniperus rigida; 37~39: Cupre-
ssus funebris; 40~42: Taxus wallichiana; 43~45: Cedrus deodara; 46~48: Pinus thunbergii
用率 24%~71% (李红英等, 2011)，杨属(Populus) SSR
引物在柳属(Salix)中的通用率为 30%~50% (Tuskan
et al., 2004)，黄瓜(Cucumis sativus) EST-SSR 引物在
西瓜(Citrullus lanatus)、南瓜(Cucurbita moschata)、葫
芦(Lagenaria siceraria)中的通用率为 57.1%、53.6%和
60.7% (Hu et al., 2010)。15对多态性引物在柏科、松
科、红豆杉科的通用率分别为 26.67%~53.33%、
46.67%和 40%，这与杉科、柏科亲缘关系最近，杉科、
松科较近，杉科、红豆杉科亲缘关系较远(Tsumura et
al., 1995; Tsumura et al., 1997)的研究结论相一致。15
对无多态引物中，6对在 1~9个树种中有效扩增，引
物通用率为 40%，其中 4 对(66.67%)引物扩增出多
态，说明在落羽杉属中无多态的 EST-SSR引物，在
其它属种中也可能表现出多态性。30对无产物引物
中，2对在 1~15个树种中有效扩增，引物通用率为
6.67%，可见即使在原种中无扩增产物的 SSR标记
在其它属种中也有潜在的应用价值，这与李红英等
(2011)研究结果一致。本研究中 15对无多态引物和
30对无产物引物均未在红豆杉科有效扩增，而在杉
科、柏科、松科均有部分引物扩增出清晰条带，也为
杉科、红豆杉科亲缘关系较远的普遍认知提供了佐
证。综上可知，较无多态引物和无产物引物而言，在
落羽杉属扩增出多态的 15对引物的通用性较高，在
利用落羽杉属 EST-SSR 引物开展其它针叶树种研
究时应优先选择有多态的引物。
3材料与方法
3.1实验材料
以中山杉 302、墨西哥落羽杉及 150个 F1分离
群体单株作为 EST-SSR 标记在中山杉基因分型中
应用效果的检测材料。以杉科 6属 7种、柏科 6属 6
种、松科 2属 2种、红豆杉科 1属 1种共16个针叶树
种幼嫩叶片作为 EST-SSR 标记通用性的检测材料
(表 3)，每个树种采集 3个基因型。
3.2试验方法
3.2.1 DNA提取
DNA 提取采用改进的 CTAB 裂解——硅珠吸
附法(张博等, 2004)。
3.2.2 PCR反应及结果检测
PCR 反应体系为 10 μL：MgCl2 3.75 mmol/L，
dNTP 0.4 mmol/L，正反向引物各 0.25 μmol/L，TaqE
0.5 U，DNA模板 20 ng，1× PCR Buffer。PCR扩增程
序：94℃预变性 3 min；94℃变性 30 s，59℃退火 45 s，
72℃延伸 45 s，35个循环；最后 72℃延伸 7 min。
扩增产物与 8 μL Load Buffer (0.025%溴酚蓝溶
液)均匀混合，8%的聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离，每
个胶孔上样 1 μL，0.5× TBE缓冲液，DYY-12型电泳
仪稳压 220 V，垂直电泳槽电泳，最后银染、显影、照
相记录。
3.2.3实验设计及数据分析
利用 503对中山杉 406 EST-SSR引物，以中山
杉 302、墨西哥落羽杉及 150个 F1分离群体单株为
材料，检测该批引物在中山杉基因分型中的应用潜
力。再以 16个针叶树种为材料检测该批引物中 15
对多态性引物、15对无多态引物和 30对无产物引物
的通用性和多态性，计算引物通用率及有扩增产物
的引物中多态扩增的引物比率。
引物通用率(%)=有扩增产物的引物对数/通用性
检测的引物对数×100；
多态性引物率(%)=扩增出多态的引物对数/有扩
增产物的引物对数×100。
作者贡献
王紫阳和成彦丽是试验研究的执行人，完成引
1636
表 3通用性检测的各科、属、种及来源
Table 3 Families, genera, species subjected to analysis of trans-
ferability, and their origin
科
Family
杉科
Taxodiaceae
柏科
Cupressaceae
红豆杉科
Taxaceae
松科
Pinaceae
属
Genera
柳杉属
Cryptomeria
柳杉属
Cryptomeria
水松属
Glyptostrobus
北美红杉属
Sequoia
台湾杉属
Taiwania
杉木属
Cunninghamia
水杉属
Metasequoia
扁柏属
Chamaecyparis
侧柏属
Platycladus
福建柏属
Fokienia
圆柏属
Sabina
刺柏属
Juniperus
柏木属
Cupressus
红豆杉属
Taxus
雪松属
Cedrus
松属
Pinus
种
Species
日本柳杉
C. Japonica
柳杉
C. fortunei
水松
G. Pensilis
北美红杉
S. sempervirens
台湾杉
T. cryptomerioides
杉木
C. lanceolata
水杉
M. glyptostroboides
日本扁柏
C. obtuse
侧柏
P. orientalis
福建柏
F. hodginsii
北美圆柏
S. virginiana
杜松
J. Rigida
柏木
C. Funebris
南方红豆杉
Variety of T. wallichiana
雪松
C. deodara
黑松
P. thunbergii
采集地
Source
A
A
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
物设计与检测、数据分析及论文初稿写作；於朝广参
与实验材料准备与数据分析；殷云龙和李火根是本项
目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文
写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由江苏省科技公共服务平台项目(BM20-
12058)、江苏省科技支撑计划(农业)项目(BE2012343)
和江苏省农业科技自主创新资金项目(CX132046)共
同资助。感谢江苏省吴江市苗圃集团有限公司董事
长滕士元在水松材料采集中提供的帮助。
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