全 文 ：基金项目：国家自然科学基金项目(No.30871575)和农业部现代农业产业技术体系建设专项资金(No.CARS-20-4-4)
收稿日期：2011-10-10 接受日期：2011-11-21
研究报告
Letter
甘蔗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGPase)转化拟南芥及
转基因植株的生理特性分析
连玲 1,2 叶冰莹 3,4 陈如凯 4 谢华安 1,2 张建福 1,2* 陈由强 3,4 *
1农业部华南杂交水稻种质创新与分子育种重点实验室 /福州国家水稻改良分中心 /福建省作物分子育种工程实验室 /福建省水稻分子
育种重点实验室 /福建省农业科学院水稻研究所，福州 350003；2福建省作物种质创新与分子育种省部共建国家重点实验室培育基地，福
州 350003；3福建师范大学生命科学学院，福州 350108；4农业部甘蔗遗传改良重点实验室，福州 350108
*通讯作者，jianfzhang@163.com；yqchen@fjnu.edu.cn
摘 要 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase，UGPase)是植物糖代谢的主要
参与酶之一，在植物的生长发育过程中起着重要作用。本研究将甘蔗(Saccharum officinarum)UGPase基因
cDNA片段连接至载体 pBI121，通过 BamHⅠ和 SacⅠ酶切鉴定及测序验证，结果表明，植物表达载体成
功构建；通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的介导，采用浸花法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)。结
合卡那霉素抗性筛选和 PCR 检测，获得了 5 株 T0代转基因植株。对 T1代转基因植株进行 PCR 及
Southern blot分析，结果表明，目的基因已成功转入拟南芥中，并且不同的转化植株含有目的基因的拷贝
数不同。对 T2代转基因植株进行 PCR和 RT-PCR检测，结果表明，目的基因不仅能在自交系后代中稳定
遗传，而且在 RNA水平也有表达。同时，对 T2代转基因植株的可溶性总糖、蔗糖及淀粉含量进行测定，结
果表明，与野生型相比，转基因植株中可溶性总糖含量没有明显的变化，但蔗糖含量有所提高，并且差异
明显，比野生型植株提高了 50.85%~96.99%，而淀粉含量都较野生型植株的低，降低了 9.69%~36.76%。说
明 UGPase在蔗糖与淀粉的转换过程中起着较为重要的作用，其催化的反应方向影响着组织中这两种产
物(蔗糖和淀粉)的分配。
关键词 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)，载体构建，转化，糖含量测定
Transformation of UDP-glucose Pyrophosphorylase Gene (UGPase) from
Saccharum officinarum into Arabidopsis thaliana and Analysis of
Physiological Characteristics of Transgenic Plants
LIAN Ling1,2 YE Bing-Ying3,4 CHEN Ru-Kai4 XIE Hua-An1,2 ZHANG Jian-Fu1,2 * CHEN You-Qiang3,4*
1 Key Laboratory of Hybrid Rice Germplasm Innovation and Molecular Breeding of South China, Ministry of Agriculture/Fuzhou Branch, National
Rice Improvement Center of China/Fujian Engineering Laboratory of Crop Molecular Breeding/Fujian Key Laboratory of Rice Molecular
Breeding/Rice Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China; 2 Incubator of National Key Laboratory of
Fujian Germplasm Innovation and Molecular Breeding between Fujian and Ministry of Sciences & Technology, Fuzhou 350003, China; 3 College
of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, China; 4 Key Laboratory of Sugarcane Genetics and Breeding, Ministry of
Agriculture, Fuzhou 350108, China
* Corresponding author, jianfzhang@163.com; yqchen@fjnu.edu.cn
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2012, 20(5): 481~488
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2012.05.003
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
甘蔗(Saccharum officinarum)是禾本科甘蔗属
植物，为 C4作物，其光合作用强，CO2补偿点低，光
饱和点高，净光合效率高，适应性强，生物学产量
高，是最重要的糖料作物，也是具潜力的能源作物。
研发燃料乙醇是许多国家石油替代计划的重要内
容之一，甘蔗则是制造燃料乙醇的最佳原料，因为
提取燃料乙醇可以和原有的生产糖工艺结合，从而
可大幅度地降低生产成本(曾麟等, 2006)。因此，提
高甘蔗中的糖含量，培育优良的品种具有重大的意
义。但甘蔗的糖代谢过程复杂，目前许多糖代谢参
与酶的表达与调控机制还不是十分明确，所以，有
必要对甘蔗糖代谢相关酶进行研究。
UGPase参与糖代谢，广泛分布于自然界中，在
微生物及动植物的许多组织中都有 UGPase 的存
在。RNA blot分析表明在马铃薯各种组织中都有
UGPase的表达，并且处于发育阶段的块茎中表达
量最高(Zrenner et al., 1993)；另外，研究发现在转录
水平上黄芪各组织中也均有 UGPase的表达，尤其
是在毛状根和根中表达量最高(Wu, 2002)。在植物
的糖代谢中，UGPase 催化反应 Glc-1-P + UTP
UDPG + PPi。UDPG即尿苷二磷酸葡萄糖是植物活
化糖的主要形式，在高等植物中为各类碳水化合物
包括蔗糖、纤维素、果胶质、糖蛋白等的合成提供葡
萄糖基，并且还是核苷二磷酸单糖如尿苷二磷酸木
糖、尿苷二磷酸半乳糖等合成的前体(祁超, 2004)。
甘蔗茎中积累着大量的蔗糖，但其具体作用机
制至今仍是个谜。UGPase作为主要的参与酶之一，
在甘蔗糖代谢中起着举足轻重的作用。本研究成功
构建了甘蔗 UGPase植物表达载体，并转化拟南芥，
获得了阳性转基因植株，测定了转基因植株中可溶
性总糖、蔗糖及淀粉的含量，期望为进一步在甘蔗中
研究 UGPase的功能及其作用机制提供基础资料。
1 结果与分析
1.1植物表达载体 pBI-UGP的构建
将甘蔗 UGPase cDNA片段(包含完整的 CDS)
构建至 pBI121载体上 (图 1)，重组子 pBI-UGP用
BamHⅠ和 SacⅠ单切，BamHⅠ/SacⅠ双切进行鉴
定(图 2)。重组子 pBI-UGP经 BamHⅠ/SacⅠ双酶切
后，出现两条带，其中较小片段为 1 457 bp，与目的
片段的大小相符，另一条大片段与去除 Gus基因后
的 pBI121质粒的大小相符。将呈阳性克隆的菌液
送测序，确定植物表达载体构建正确(图 3)。
1.2 转基因拟南芥植株的获得及鉴定
采用花序浸染法将构建好的植物表达载体
Abstract UGPase (UDP-glucose pyrophosphorylase) is one of the enzymes which mainly involves in plant
carbohydrate metabolism, and plays an important role in the process of plant growth and development. The
plant expression vector was constructed by ligating the cDNA fragment of UGPase from Saccharum
Officinarum into expression vector pBI121, then the recombinant plasmid pBI-UGP was confirmed by
restriction enzyme digestion analysis with BamHⅠ /SacⅠ , and further verified by DNA sequencing. The
expression vector was introduced into Arabidopsis thaliana by floral-dip method, with Agrobacterium
tumefaciens as media. Five T0 transgenic plants were selected by combining kanamycin screening with PCR
detection. After selecting by kanamycin screening, T1 transgenic plants were identified by PCR and Southern
blot, the results showed that the target gene was transformed into Arabidopsis thaliana successfully, and
different transgenic plants contained various copy numbers of UGPase from Saccharum officinarum. T2
transgenic plants were identified by PCR and RT-PCR, the results indicated that the gene not only inherited
stably in self-progeny, but also expressed at the RNA level. Meanwhile, content of soluble sugar, sucrose and
starch were determinated in T2 transgenic plants and wild plants. Compared to wild plants, the soluble sugar
content of transgenic plants had little change, however, sucrose content of transgenic plants improved
obviously, increased by 50.85%~96.99%. Starch content of transgenic plants was lower than that of wild plants,
decreased by 9.69%~36.76%. The research proved that UGPase plays a critical role in the process of converting
sugar and starch, and the direction of its catalysis influneces distribution of these products in plant organization.
It will lay foundation for further study of UGPase.
Keywords UGPase, Vector construction, Transformation, Sugar content
482
pBI-UGP转化拟南芥，收获种子。灭菌后的拟南芥
种子播于 MS固体培养基(含 50 μg/mL Km)上，进
行光照培养。培养约 20 d后抗性苗正常生长，而非
抗性苗逐渐变黄、腐烂(图 4)。以抗性苗和野生型植
株的基因组 DNA为模板进行 PCR扩增，结果表明
在抗性苗的中可扩增出 1 475 bp的条带，与以重组
质粒 pBI-UGP为模板进行 PCR扩增的结果相同；
而在野生型植株中则未扩增出相应条带 (图 5)，由
于拟南芥 UGPase基因序列与甘蔗的相似性较低，
所以 PCR扩增时不会受同源基因的影响。通过检
测，共获得了 5株 T0代转基因植株，分别命名为
T0a、T0b、T0c、T0d和 T0e。
1.3 T1 代转基因拟南芥植株的 PCR 检测及
Southern blot分析
收获 T0a、T0b、T0c、T0d和 T0e种子分别播种于含
有 50 μg/mL Km 的固体 MS培养基上进行筛选，
相应的 T1代植株分别命名为 T1a、T1b、T1c、T1d和 T1e。
结果表明 T1a、T1c、T1d和 T1e植株中抗性苗与非抗性
苗的比例分别为 54∶10，69∶16，58∶9和 61∶13，即均
不符合 3∶1，而是绝大部分为抗性苗，所以推测 T1a、
T1c、T1d和 T1e含有目的基因的拷贝数有可能不止一
个。而 T1b植株中抗性苗与非抗性苗的比例为 57∶
14，接近 3∶1，所以推测 T1b可能含有单个拷贝的目
的基因。提取部分 T1代拟南芥转基因植株的基因
组 DNA进行 PCR检测，结果都有扩增出单一的条
带，大小为 1 090 bp，与预期的大小相符 (图 6)。
选取部分 T1 代拟南芥转基因植株进行
Southern blot分析。杂交结果如图 7A，样品基因组
DNA用 BamHⅠ/SacⅠ双切，转膜杂交后，样品 T1a-2
和 T1c-1未出现条带，可能是 DNA质量问题或其他
图 4抗性苗(B) 及其筛选(A)
Figure 4 Resistant plants(B) and its selection(A)
红色箭头所示为抗性苗
Resistant plants are indicated by red arrow
A B
图 1载体 pBI121质粒酶切
Figure 1 Restriction enzyme digestion of plasmid pBI121
1：BamHⅠ /SacⅠ双切；M：DNA marker
1: BamHⅠ /SacⅠ digestion; M: DNA Marker
1 M
2500
1000
15000
10000
bp
图 2 重组质粒pBI-UGP酶切鉴定
Figure 2 Restriction enzyme digestion of recombinant
plasmid pBI-UGP
1：BamHⅠ单切；2：SacⅠ单切；3：BamHⅠ /SacⅠ双切；M：
DNA Marker
1: BamHⅠ digestion; 2: SacⅠ digestion; 3: BamHⅠ /SacⅠ
digestion; M: DNA marker
1 2 3 M
2500
1000
15000
10000
bp
图 3植物表达载体示意图
Figure 3 Schematic diagram of plant expression vector
NPTⅢ
oriⅤ
RB
NPTⅡ CDS
HindⅢ
35S prom.
XbaⅠ
UGPas
e
NOS term
LB
BamHⅠEcoRⅠ SacⅠ
甘蔗 UGPase转化拟南芥及转基因植株的生理特性分析
Transformation of UGPase from S. Officinarum into A. thaliana and Analysis of Physiological Characteristics
pBI-UGP
483
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
图 7 转基因拟南芥植株基因组 DNA Southern blot分析
Figure 7 Southern blot of genomic DNA from transgenic plants
A. BamHⅠ /SacⅠ双切；CK.野生型植株。B. BamHⅠ单切；CK.：野生型植株。C.T1b DNA BamHⅠ单切；CK：野生型植株
A. BamHⅠ/SacⅠ digestion; CK:Wild plant. B. BamHⅠdigestion; CK.: Wild plant. C. BamHⅠ digestion of T1b DNA; CK:Wild plant
原因；而另外 4 个样(T1a-1、T1b-1、T1d-1和 T1e-1)杂交条
带与质粒的一致。相应的这 4 个样用 BamHⅠ单
切，如图 7B，杂交结果表明，编号 T1a-1和 T1e-1为双
拷贝，T1b-1为单拷贝，T1e-1多拷贝。为了进一步确认
T1b是否含有单个拷贝的目的基因，选取另外 4株
T1b转基因植株 (T1b-2、T1b-3、T1b-4和 T1b-5)，基因组用
BamHⅠ单切，杂交表明，除了 T1b-3未出现信号外，
其他也均为单拷贝(图 7C)。因此，认为 T1b转基因
植株中应该是含有单个拷贝的目的基因，并选其后
代作为材料进行下一步的研究。
1.4 T2代转基因植株的 PCR、RT-PCR检测及糖含
量的测定
T1b不同单株分别收种，播种于含有 50 μg/mL
Km的固体 MS培养基上；选择相应 T2b均为抗性
植株的 T1b自交系(即为纯合单拷贝植株)作为材料
进行下一步的试验。
选取部分 T2b植株分别提取基因组 DNA，并进
行 PCR检测，结果表明，转基因株系均能扩增出单
一的条带，大小为 1 090 bp，并与预期片段大小一
致(图 8)；提取总 RNA，加入 DNaseⅠ以清除 DNA
污染，并进行 RT-PCR分析，结果也均能扩增出大
小为 1 090 bp的条带(图 9)，说明目的基因在转基
因自交后代植株中不仅有稳定遗传，而且在 RNA
水平上能够表达。
剪取检测呈阳性的 T2b植株及野生型植株的叶
片，分别对野生型植株、转基因植株的可溶性总糖、
蔗糖、淀粉含量进行测定。结果表明，与野生型植株
相比，转基因植株的可溶性总糖含量基本无变化；但
蔗糖含量有所提高，比野生型植株提高了 50.85%
~96.99%，即为野生型植株的 1.5~2.0倍；而淀粉含
量降低，比野生型植株降低了 9.69%~36.76%，差异
较大的，野生型植株含量是转基因植株的 1.6倍(图
10，表 1)。进一步的独立样本 t检验表明，转基因植
株与野生型植株的蔗糖含量存在显著差异(P<0.
05)，转基因植株的蔗糖含量都明显高于野生型植
株；同样其淀粉含量也存在显著差异，但不同的是
转基因植株的淀粉含量都明显低于野生型植株。
图 5 抗性苗的 PCR检测
Figure 5 Identification of the resistant plants by PCR
1：空白对照；2：重组质粒 pBI-UGP；3：野生型植株；4、5：抗
性苗基因组 PCR；M：DNA marker
1: Blank control; 2: Recombinant plasmid; 3: Wild plants; 4, 5:
Resistant plants; M: DNA marker
4 51 2 3 M
2000
1000
1500
500
bp
图 6 T1代转基因拟南芥植株的 PCR检测
Figure 6 Identification of the T1 plants by PCR
1：空白对照；2：野生型植株；3：重组质粒 pBI-UGP；4~15：转
基因植株；M：DNA marker
1: Blank control; 2: Wild plants; 3: Recombinant plasmid;
4~15: T1 transgenic plants; M: DNA marker
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 151 2 3 M
2000
1000
bp
T1a-1 T1a-2 T1b-1 T1c-1 T1d-1 T1e-1 CK Plasmid T1a-1 T1b-1 T1d-1 T1e-1 CK T1b-2 T1b-3 T1b-4 T1b-5 CK
A B C
484
表 1 转基因植株及野生型植株可溶性总糖、蔗糖和淀粉含量
Table1 Soluble sugar, sucrose and starch content of transgenic plants
可溶性总糖含量 /mg·g-1
Content of
soluble sugar
109.25±2.87
108.11±3.48
98.78±1.32
102.90±2.87
116.23±4.70
107.13±2.96
134.95±4.68
提高率 /%
Increasing rate
0
-1.04
-9.58
-5.81
6.39
-1.94
23.52
蔗糖含量 /mg·g-1
Content of
sucrose
14.63±1.46
28.42±0.25
24.70±0.56
22.84±1.17
29.76±0.37
22.07±1.47
28.82±0.13
提高率 /%
Increasing rate
0
94.25
68.83
56.12
103.42
50.85
96.99
淀粉含量 /mg·g-1
Content of
starch
92.89±1.59
67.53±1.89
63.61±1.20
58.74±0.62
60.39±0.88
65.89±0.15
83.89±1.33
提高率 /%
Increasing rate
0
-27.30
-31.52
-36.76
-34.99
-29.07
-9.69
编号
Code
CK
T2b-1
T2b-2
T2b-3
T2b-4
T2b-5
T2b-6
P值
P value
－
0.68
0.01
0.05
0.33
0.42
0.00
P值
P value
－
0.04
0.03
0.03
0.04
0.04
0.04
P值
P value
－
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
2 讨论
UGPase参与植物蔗糖代谢，其催化的反应是
双向的，在不同的组织所催化的反应方向不同。
UGPase在植物叶片中主要参与蔗糖的合成代谢，
以 Glc-1-P 和 UTP 作为底物，催化反应生成
UDPG，并进一步在 SPS(蔗糖磷酸合成酶)的作用
下合成蔗糖 (Kleczkowski et al., 2004)。另外，
UGPase的作用常常与 AGPase(腺苷二磷酸葡萄糖
焦磷酸化酶)相偶联，在水稻胚乳、马铃薯块茎及大
豆豆荚等植物的贮藏组织中，UGPase参与蔗糖的
降解将 UDPG催化生成 Glc-1-P，后者再在 AGPase
的作用下生成 ADPG(腺苷二磷酸葡萄糖)，并参与
造粉体中淀粉的合成 (Hatzfeld and Stitt,1990;
Kleczkowski, 1994; Chopra et al., 2005)；而在萌发
的马铃薯块茎中，淀粉降解生成 Glc-1-P，后经
UGPase 催化生成 UDPG 并进一步转化成蔗糖
(Guptac and Sowokinos, 2003)。
吴晓俊等(2000)的研究表明，在黄芪毛状根的
生长过程中 UGPase 的活性均与总多糖含量有较
强的相关性，黄芪毛状根中的 UGPase活性较高时
其总多糖含量也较多；而黄芪毛状根中水溶性多糖
的含量与 UGPase 活性的相关性更强，说明了
UGPase 在黄芪多糖合成过程中发挥重要作用。
Spychalla等(1994)将 UGPase反义表达载体转化马
铃薯，结果发现 4℃和 12℃下储存，转基因马铃薯
图 10可溶性总糖、蔗糖和淀粉含量的测定
Figure 10 Content of soluble sugar, sucrose and starch
CK：.野生型植株；T2b-1~T2b-6：转基因植株
CK: Wild plant; T2b-1~T2b-6: Transgenic plants
图 9 T2b代转基因拟南芥植株的 RT-PCR 分析
Figure 9 Identification of the T2b transgenic plants by RT-PCR
1：空白对照；2：野生型植株；3：质粒；4~9：转基因植株；M：
DNA marker
1: Blank control; 2: Wild plants; 3: Plasmid; 4~9: T2b transgenic
plants; M: DNA marker
4 5 6 7 8 91 2 3 M
2000
1000
bp
图 8 T2b代转基因拟南芥植株的 PCR检测
Figure 8 Identification of the T2b transgenic plants by PCR
1：空白对照；2：野生型植株；3~8：转基因植株；M：DNA
marker
1: Blank control; 2: Wild plants; 3~8: T2b transgenic plants; M:
DNA marker
4 5 6 7 81 2 3 M
2000
1000
bp
甘蔗 UGPase转化拟南芥及转基因植株的生理特性分析
Transformation of UGPase from S. Officinarum into A. thaliana and Analysis of Physiological Characteristics
样品
Sample
平
均
含
糖
量
/m
g·
g-
1
A
ve
ra
ge
su
ga
rc
on
te
nt
150.00
100.00
50.00
0
CK T2b-1 T2b-2 T2b-3 T2b-4 T2b-5 T2b-6
485
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
块茎中的 UGPase活性都明显低于野生型植株块
茎，虽然转基因马铃薯块茎中 Glc、Fru、Fru-6-P、
Glc-6-P及 Glc-1-P的含量没有明显的变化，但蔗糖
含量急剧减少。刘文哲(2002)研究将两种不同来
源的 UGPase分别转化烟草，结果发现转紫穗槐
UGPase烟草中 UGPase的活性明显提高，与对照
植株相比，茎中纤维素的含量平均增加了 5.04%；
转木醋酸菌 UGPase烟草中 UGPase的活性也显著
高于对照植株，其茎中的纤维素含量增加了
7.29%。梁海泳等 (2006) 的研究也表明将紫穗槐
UGPase基因转入烟草中，转基因烟草纤维素含量
有所增加。在 2×35S的驱动下进行 UGPase与 SPS
的过表达，虽然在不同组织糖含量变化不同，但转
基因植株的株高增加，比对照植株高 23%~31%
(Coleman et al., 2010)。胼胝质是花粉细胞壁的主要
成分，花粉细胞在其细胞壁中缺少胼胝质的情况下
不能够正常地进行发育；采用 RNA干扰技术抑制
水稻中 UGPase的表达导致花粉不育，并使结实率
降低 (Chen et al., 2007; Woo et al., 2008)。Park等
(2010) 研究发现拟南芥 UGPase的 T-DNA插入突
变体生长受阻，同时花粉不育，说明 UGPase 是拟
南芥营养生长和生殖生长都所必需的。而 Okazaki
等(2009)的研究则表明拟南芥 UGPase 的 T-DNA
插入突变体的叶片无硫脂的积累，阐明了 UGPase
在脂类合成过程中的重要作用。以上的研究均说明
了植物中 UGPase是否表达、表达量的多少及其活
性的变化都会对植物的糖代谢，以及植物的生长与
发育造成不同程度的影响。
本研究的结果表明，转甘蔗 UGPase的拟南芥
植株中可溶性总糖含量并没有明显的变化，分析其
中可能的原因，一是糖代谢是一个复杂的过程，有
许多酶参与，本研究只对其中的一个酶进行了过表
达，所以可能无法达到足够大的作用使得可溶性总
糖含量提高；二是如上所述，UGPase催化作用是双
向的，所以在仅有其过表达的情况下，其只改变植
物体内相关糖含量的分配，另外，本研究转基因植
株中蔗糖含量明显提高，而淀粉含量降低，也正说
明了这一点。因此，植株组织中 UGPase的催化方
向会影响其中蔗糖和淀粉的含量，在这两种糖的动
态转换中发挥了重要的作用。
而甘蔗中蔗糖含量高，其中如何使得代谢反应
朝着蔗糖合成的方向进行，其调节机制是什么，都
是值得进一步研究及探讨的问题。
3 材料与方法
3.1材料及试剂
3.1.1植物材料
拟南芥(Ababidopsis thaliana) 种子 (哥伦比亚
型)，由福建农林大学王宗华教授惠赠。
3.1.2载体质粒及菌株
载 体 质 粒 pBI121、 农 杆 菌 (Agrobacterium
tumefaciens) 菌株 GV3101分别由福建农林大学张
木清、王宗华教授惠赠，大肠杆菌(Escherichia coli)
DH5α由甘蔗遗传改良重点实验室保存。
3.1.3试剂
高保真酶 PrimeSTARTM HS DNA 聚合酶、
rTaq 酶、SacⅠ、BamHⅠ、T4 DNA 连接酶购自
TaKaRa (大连 ) 公司；SV Gel and PCR Clean-Up
System 购 自 Promega；RevertAidTM First Strand
cDNA Synthesis Kit 购自 Fermentas (立陶宛 )；
Silwet L-77 Surfactant表面活性剂购自厦门泰京生
物技术有限公司；卡那霉素(Km)、庆大霉素(Gen)、
利福平(Rif)等购自上海生物工程公司。
3.2 甘蔗 UGPase基因植物表达载体的构建
3.2.1目的基因的扩增
根据甘蔗 UGPase基因序列 (GenBank中登录
号为 FJ536261，由本实验室克隆)，设计 PCR 扩增
引物：
UP1: 5-CGGGATCCATGGCCGCCGCTGCTGC-3；
BamHⅠ
UP2: 5-CCGGAGCTCTTAAAGATCCTCAGGGCCATTGACAT-3。
SacⅠ
以含有目的片段的重组质粒 pGM-UGP 为模
板，进行 PCR扩增，反应体系：5×PrimeSTARTM HS
DNA聚合酶 Buffer 10 μL，dNTP (2.5 mmol/ L) 2.4
μL，UP1 (4 μmol/L) 5 μL，UP2 (4 μmol/L) 5 μL，质
粒模板 1.5 μL，5×PrimeSTARTM HS DNA 聚合酶
0.5 μL，ddH2O补足至 50 μL；PCR 扩增程序：94℃
预变性 5 min 后，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1.5
min，30个循环，72℃延伸 7 min。
3.2.2植物表达载体的构建
用 BamHⅠ/SacⅠ将带有酶切位点的 UGPase
cDNA和载体 pBI121分别进行双酶切，回收纯化
相应片段，连接体系按目的片段 3∶载体 l的比例，
486
16℃连接过夜。采用氯化钙法将连接产物转化大肠
杆菌 DH5α，用 Km 筛选后挑取单菌落进行菌液
PCR及质粒 PCR鉴定，用 BamHⅠ和 SacⅠ单切，
BamHⅠ /SacⅠ双切对重组质粒进行酶切鉴定，并
将其命名为 pBI-UGP。为了验证读码框是否正确，
将鉴定正确的阳性菌株送测序。
采用电击法将重组质粒 pBI-UGP转化至农杆
菌 GV3101，培养于含有利福平及卡那霉素的 LB
固体培养基上，并挑取单菌落进行 PCR检测。
3.3 转化拟南芥
3.3.1花序浸染法转化拟南芥
方法参见 Simplified Arabidopsis Transformation
Protocol(Clough et al., 1998)。
3.3.2拟南芥抗性苗的筛选
约 0.04 g拟南芥种子，置于 1.5 mL的 EP管
中，加入 1 mL ddH2O，4℃春化 2 d。离心后吸弃
ddH2O；加入 l mL 70%乙醇灭菌 l min，离心并吸弃
乙醇；用 ddH2O冲洗一遍；再加入 l mL 0.15 % 氯
化汞灭菌 3 min，离心并吸弃氯化汞；用 ddH2O再
冲洗 5~8遍。并于无菌超净工作台将种子播于含
50 μg/mL Km的 MS固体培养基上，进行光照培
养。培养约 30 d后，将抗性苗转移至拟南芥培养土
中(泥土∶草木灰∶木屑 =4∶2∶1)。
3.3.3拟南芥抗性苗的鉴定
用 CTAB 法提取抗性苗及野生苗的基因组
DNA，并进行 PCR检测，检测引物为 UP1和 UP2,
反应体系及程序同 3.2.1。获得 PCR呈阳性的 T0代
转基因植株。
3.3.4 T1代转基因拟南芥植株 PCR检测及 Southern
Blot分析
T1代拟南芥植株经过 Km筛选后，CTAB法提
取 DNA，进行 PCR检测，PCR检测引物：
UG1-1: 5-CCGATGAGGTGGTGGTGCCGT-3；
UG1-2: 5-ATGCTGGGGATAGACTTGAACCGAG-3。
反应体系为：10×PCR Buffer 1 μL，dNTP (2.5
mmol/L) 0.8 μL，UG1-1 (4 μmol/L) 1 μL，UG1-2 (4
μmol/L) 1 μL，DNA 模板 0.5 μL，rTaq 0.1 μL，
ddH2O补足至 10 μL；反应程序为：94℃预变性 5
min 后，94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个循
环，72℃延伸 7 min。
选取部分 PCR阳性植株，提取基因组 DNA，
分别用 SacⅠ/BamHⅠ双酶切、用 BamHⅠ单酶切并
进行 Southern blot分析。具体操作按照 Amersham
Gene Images Alkphos Direct Labelling and Detection
System试剂盒说明书进行。
3.3.5 T2代转基因植株的 PCR、RT-PCR检测
T2代拟南芥植株经过 Km筛选后，CTAB法提
取 DNA，进行 PCR 检测；并用 Trizol 法提取转基
因拟南芥及野生植株的总 RNA，加入 DNaseⅠ以
清除 DNA污染，用 RevertAidTM First Strand cDNA
Synthesis Kit进行反转合成 cDNA一链，以反转录
产物为模板进行 PCR扩增。PCR及 RT-PCR检测
引物均为 UG1-1、UG1-2，反应体系及程序同 3.3.4。
3.3.6相关糖含量测定
剪取检测后的 T2代拟南芥植株及野生型植株
的叶片，放置于 110℃烘箱烘 15 min，然于后 70℃
过夜，干燥过的叶片保存在装有活化硅胶的干燥器
中以备用。样品处理、可溶性总糖含量和蔗糖含量
的测定参见《植物生理学实验指导》(张志良等 ,
2004)，淀粉含量的测定：高氯酸抽提后用蒽酮法测
定，每个样品测 3次重复。并采用 SPSS统计分析
软件处理相关数据。
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