全 文 ：收稿日期:2012-02-27
作者简介:杨 慧(1987—) ，女，湖南人，硕士研究生，Email:hnc-
dhui_19@ 163. com。* 通信作者:liucl100@ 126. com。
基金项目:国家 973 项目(2006CB101603)。
碎米荠 CarKCS基因全长 CDS克隆、
序列分析及表达载体构建
杨 慧1，2，魏解冰1，2，阮 颖1，3，刘春林1，2*
(1 作物种质资源创新与利用国家重点实验室培育基地，长沙 410128;
2 湖南农业大学农学院;3 湖南农业大学生物科学与技术学院，长沙 410128)
摘 要:根据 KCS基因的保守性设计引物，以高神经酸含量的碎米荠叶片 DNA为模板(KCS基因无内含子) ，克
隆碎米荠超长链脂肪酸合成的限速酶 β －酮脂酰 － CoA 合酶(KCS)基因全长 CDS 序列，命名为 CarKCS。Blast
比对及序列分析表明，目的片段序列和 GenBank上报道的拟南芥 KCS18序列同源性达到 87%。CarKCS全长 1 518
bp，不含内含子，编码 505 个氨基酸。生物信息学分析表明，所有的酶功能活性位点的氨基酸都存在，在 N端都有
两个，C端有一个高度疏水的跨膜结构域;CarKCS与 KCS18 同属于 KCS基因家族的 FAE1 － like亚家族。将目的
片段连接到 pFGC － 5941. nap表达载体，经 PCR和酶切检测，证明已成功构建了 pNapin － CarKCS载体。
关键词:碎米荠;β －酮脂酰 － CoA合酶(KCS)基因;序列分析;表达载体构建
中图分类号:Q78 文献标识码:A
文章编号:1001-5280(2012)03-0213-06 DOI:10. 3969 / j. issn. 1001-5280. 2012. 03. 03
Clone，Sequence Analysis and Expression Vector Construction
of CarKCS Gene Full － length CDS in Cardamine hirsute
YANG Hui1，2，WEI Jie-bing1，2，RUAN Ying1，3，LIU Chun-lin1，2*
(1 Pre － State Key Laboratory of Crop Germplasm Innovation and Utilization，Hunan Agricultural University，Changsha，
Hunan 410128，China;2 College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China;
3 College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China)
Abstract:In this study，according to the conservative sequence of β － ketoacyl － CoA synthase (KCS)genes，we de-
signed the primers and cloned a full － length CDS of KCS gene from Cardamine hirsute，named CarKCS . Blast analysis
showed that the homology between the cloned sequence and Arabidopsis thaliana KCS18 sequence in GenBank was up to
87%. The CarKCS contained 1518 bp and coded 505 amino acids. Bioinformatic analysis showed that CarKCS gene in-
cluded all amino － acid residues of the enzyme active site and there were two in the N － terminal and one in the C － termi-
nal highly hydrophobic transmembrane domains. CarKCS liked KCS18 belonged to FAE1 － like subfamily of KCS gene fami-
ly. PCR and restriction enzyme digestion demonstrated that we had successfully constructed pNapin － CarKCS vector，
which provided good foundation for further study of CarKCS gene function.
Key words:Cardamine hirsute;β － ketoacyl － CoA synthase (KCS)gene;Sequence analysis;Construction of expres-
sion vector
神经酸，化学名为顺 － 15 －二十四碳烯酸(24:
1) ，是一种超长链单不饱和脂肪酸(VLCMFA) ，存在
于蒜头果、碎米荠、银扇草、大麻、鸡爪槭、旱金莲、遏
蓝菜、盾叶木、元宝枫等植物的种子油中［1，2］。有研
究表明，神经酸是大脑神经细胞和神经组织的核心天
3122012 年 第 26 卷 第 3 期 作 物 研 究
然成分，是迄今为止世界上发现的能促进受损神经组
织修复和再生的特效物质，是神经细胞特别是大脑细
胞、视神经细胞、周围神经细胞生长、再发育和维持的
“必需高级营养素”，对提高脑神经的活跃程度，防止
脑神经衰老有很大作用［3］。但人体自身很难生成神
经酸，只能靠体外摄取来补充。目前人们正致力于生
产天然的神经酸油用于医药、营养制品和工业应用。
自然界中含神经酸植物的果实含油量、神经酸含量差
异较大，开发成本高，要开发神经酸产品，需要低成本
地获得天然高含神经酸的资源。
神经酸的合成过程主要涉及到 β － 酮脂酰 －
CoA合酶(3 － ketoacyl － CoA synthase，KCS)、β －酮
脂酰 － CoA 还原酶 (3 － ketoacyl － CoA reductase，
KCR)、β －羟脂酰 － CoA 脱水酶(3 － hydroxacyl －
CoA dehydratase，HCD)和反式烯脂酰 － CoA还原酶
(trans － 2，3 － enoyl － CoA reductase，ECR) ，这 4 种
酶协同作用形成功能复合体，称为脂肪酸延长
酶［4］。其中 β －酮脂酰 － CoA合酶又称为脂肪酸延
长酶 1(Fae1)或简称 KCS。有研究显示，虽然所有
植物及微生物体的脂肪酸延长酶系统中都普遍存在
着这 4 种酶，但除第一个酶 β －酮脂酰 － CoA 合酶
(KCS)起着关键作用外，其它 3 种酶的作用处于次
要地位，因此 KCS酶的活性高低成为制约超长链脂
肪酸合成的重要因素［5］，是超长链脂肪酸合成反应
的限速酶［6］。目前许多低芥酸油菜品种的育种原
理都是通过该酶的突变完成的。Millar 和 Kunst 在
酵母中成功地利用强半乳糖诱导型启动子表达了拟
南芥的 fae1 基因，并且在转化株中积累了 20:1，22:
1 以及 24:1 这些在非转化酵母培养物中不存在的
脂肪酸［7］。Fae1 基因是 β －酮脂酰 － CoA合酶的编
码基因，也是控制芥酸等超长链脂肪酸合成的关键
基因［8］。Elzbieta Mietkiewska 等人克隆了银扇草的
KCS基因，将其转入野生型拟南芥中，种子油脂肪酸
成分分析表明神经酸的含量增长了 30 倍，转入埃塞
俄比亚芥也使其种子油中神经酸含量增长了 7 至
10 倍［9］。GenBank 中尚无碎米荠 (Cardamine
hirsuta L. )KCS基因 cDNA序列的记录。本实验根
据 KCS基因的保守性，设计引物，通过 PCR 克隆神
经酸含量较高的碎米荠的 KCS 基因，并将其连接到
种子特异性启动子 NapinA 上，构建成过表达载体，
用来转化高芥酸含量的甘蓝型油菜，希望通过生产
油菜来获得神经酸产品。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 供试品种
碎米荠，采于湖南农业大学校内路旁;高芥酸含
量的甘蓝型油菜品种 GX － 29，为湖南农业大学植
物代谢调控研究组提供。
1. 1. 2 菌株
DH5α，LBA4404，为湖南农业大学植物代谢调
控研究组保存。
1. 1. 3 载体与质粒
pMD19 － T 载体购自 TaKaRa 公司。pFGC －
5941. nap［10］表达载体为本实验室以 NapinA 启动子
置换 pFGC －5941 质粒 35S启动子改造而成。
1. 1. 4 分子生物学试剂
TaqTM DNA 聚合酶购自东盛生物;LongAmp
TaqDNA Polymerase购自 BioLabs 公司;限制性内切
酶，DNA T4 Ligation Kit购自晶美公司;质粒 DNA小
量纯化 Kit，DNA 凝胶回收 kit 购自安比奥公司;
DNA Marker 购自北京天根;CTAB，Tris base，EDTA
均购自欧迈生物;琼脂糖:西班牙产;酵母提取物、
蛋白胨购自 OXOID. L TD;抗生素购自北京鼎国生
物技术发展中心。
1. 2 方法
1. 2. 1 碎米荠总 DNA的制备
以碎米荠幼叶为材料，参照 CTAB法制备［11］。
1. 2. 2 引物设计及目的基因的全长 CDS克隆
登 陆 NCBI 网 站 (http:/ /www. ncbi. nlm.
nih. gov /) ，未找到碎米荠 KCS 基因的相关信息，但
找到碎米荠属 Cardamine graeca L. 的 KCS 基因
mRNA全长序列(EU871788)。下载后利用 DNAS
TAR软件进行序列编辑和分析，该 KCS 基因全序
列，不含内含子，总长度为 1 521 bp，共编码 506 个
氨基酸。而 KCS 基因在不同的种间都具有很大的
保守性，因此可以根据该序列用 Primer Premier 5. 0
软件设计引物扩增碎米荠的 KCS 基因全序列。并
根据质粒载体 pFGC5941. nap 的限制性酶切位点，
在正反向引物的 5端分别加入 AscI 和 BamHI 位
点。引物由南京金斯瑞(Genscript)生物科技有限公
司合成。引物序列如下:
412 CROP RESEARCH 2012，26(3)
KCSSF:5 － GGCGCGCCATGACGTCCATTAACG
TAAAGCTC －3
KCSSR:5 － GGATCCTTAGGACCGACCGTTT
TGGGCA －3
高保真 LongAmp TaqDNA 聚合酶 PCR 扩增的
反应体系为 50 μL，反应条件:94℃预变性 3 min;
94℃变性 30 s;70℃退火 10 s;72℃延伸 80 s;72℃延
伸 7 min;16℃保存。扩增 28 个循环。PCR 产物经
琼脂糖凝胶电泳检测，然后用安比奥公司 DNA凝胶
回收 kit 进行回收纯化后，连接到载体 pMD19 － T
构建成 T 载体，命名为 T － CarKCS。热激法将此连
接质粒转化到大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中，取
100 μL涂到 LB固体培养基(含氨苄青霉素 50 μg /
mL)上，于 37℃过夜培养，重组子经鉴定后送南京
金斯瑞生物科技有限公司测序。
1. 2. 3 序列的生物信息学分析
可在 NCBI站点上进行氨基酸序列推导及结构
域分 析，通 过 EXPASY 的 ProtParam (http:/ /
us. expasy. org / tools /protparam. html)分析 CarKCS
基因编码蛋白的理化性质，应用 SMART(http:/ /
smart. embl － heidelberg. de /)在线预测 CarKCS 基因
编码蛋白的结构域，用 Clustal W软件进行氨基酸序
列同源性比对，再用 MEGA 4. 1 做系统进化树分析。
1. 2. 4 种子特异表达载体的构建
用限制性内切酶 AscI 和 BamHI 分别对 T －
CarKCS载体和 pFGC － 5941. nap 质粒进行双酶切。
酶切得到的目的片段和载体均用凝胶回收 kit 回
收，再按3∶ 1的连接体系进行连接。将切下的 T －
CarKCS片段插入 pFGC － 5941. nap 质粒的相应位
点，构建成 pNapin － CarKCS载体。将连接产物转化
大肠杆菌 DH5α感受态细胞，再涂布于 LB 平板(含
卡那霉素 50 μg /mL)上筛选阳性克隆，通过菌落
PCR 检测阳性克隆。按常规方法提取质粒，进行
PCR反应及酶切验证获得带有目的基因的植物过
表达载体。
2 结果与分析
2. 1 目的片段的克隆和测序
根据合成引物的退火温度，设计温度梯度
PCR，确定最佳的退火温度为 53℃，然后以 53℃为
退火温度做 PCR 扩增，扩增结果如图 1。从电泳图
可以发现扩增条带大小约为 1 500 bp，扩增片段的
大小与预期的一致。回收 PCR 产物，连接到 pMD19
－ T 载体上，用热激法转化大肠杆菌 DH5α 的感受
态细胞，取 100 μL涂布到含 50 μg /mL 氨苄青霉素
的 LB 固体培养基上，于 37℃过夜培养，挑单菌落做
菌落 PCR，如图 2 所示。图中 4、5、7 号泳道都为阳
性克隆，选取 7 号泳道的阳性克隆送公司测序。测
序结果表明，去掉载体及酶切位点后扩增产物的大
小为 1 518 bp。将测序结果在 NCBI上进行 Blast 同
源分析比对，此序列与碎米荠属 Cardamine graeca
L. 的 KCS 基因的 mRNA 全长序列(EU871788)同
源性达到 88%。由此表明，所克隆的片段为
CarKCS基因的全长序列。
图 1 CarKCS目标片段的 PCR产物
Fig. 1 PCR test of CarKCS fragment
M. Trans15K DNA Marker;1. 阴性对照;2. DNA PCR产物
图 2 菌落 PCR检测结果
Fig. 2 Results of PCR test of colonies
M. Trans15K DNA Marker;1. 阴性对照;2. 阳性对照(ge-
nomic DNA) ;4，5，7. 阳性菌落
2. 2 序列及蛋白质的理化性质分析
将测序的 CarKCS 基因 CDS 序列在 NCBI 上进
行翻译，发现该基因编码 505 个氨基酸，不含内含
子，全长为 1 518 bp的完整开放阅读框，相对分子质
量为 56 346. 0，等电点为 9. 41。而碎米荠属
Cardamine graeca L. 的 KCS基因(EU871788)编码
506 个氨基酸，相对分子质量为 56 465. 1，等电点为
9. 25。进一步将在 NCBI 上翻译得到的氨基酸序列
用 SMART在线进行蛋白质结构预测及分析，结果
表明，其在第 9 至第 31 位氨基酸、第 51 至第 70 位
氨基酸及第 342 至第 364 位氨基酸分别构成了 3 个
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跨膜结构域。
许多科学家都对甘蓝型油菜中 KCS 活性丧失
的原因进行了大量研究。Han 等发现，在所有有功
能的 KCS蛋白中第 282 位氨基酸都为丝氨酸残基，
而无功能的蛋白在该位都为苯丙氨酸残基［12］，
CarKCS基因在第 282 位氨基酸都为丝氨酸残基。
Ghanevati等利用酵母表达系统，进行定点突变研
究，还证实了 Cys223，His302，His387，His391 和
His420 都是组成 β －酮酯酰 － CoA合酶的活性位点
的氨基酸残基，这些氨基酸任何一个发生突变都会
导致酶活性的丧失［13，14］。
将 CarKCS基因氨基酸序列与拟南芥中同源性
最高的 KCS18 氨基酸序列进行 ClustalW分析，再用
MEGA做系统进化树图谱如图 3，结果表明该基因
有 Ser282，Cys223，His302，His387，His391 和 His420
这些活性位点的氨基酸都存在，据此可以推测该基
因具有正常的催化功能。
图 3 CarKCS与 KCS18 酶活性位点分析图
Fig. 3 Analysis on enzyme active site
between CarKCS and KCS18
2. 3 CarKCS基因的系统进化树分析
KCS基因家族主要存在于植物界，拟南芥脂基
因数据库中揭示了 21 个 KCS 相关基因的存在［15］。
Lessire 等人根据氨基酸序列同源性进行 ClustalW
比对，可将其划分为 4 个亚组:FAE1 － like，KCS1 －
like，FDH － like，CER6 － like［16］。这些 KCS 基因存
在组织、器官的特异性表达和底物特异性。它们对
饱和的及单不饱和的 C16 和 C18 脂肪酰 － CoA 具
有较高的活性，其中 7 个基因 (FAE1，KCS1，KCS2，
At5g43760，Atlg04220，CER60，At2g16280)在酵母中
异源表达后可催化 VLCEAs 合成，不同程度的积累
C20 ～ C30 脂肪酸［17，18］。碎米荠与拟南芥同属于十
字花科植物，本实验通过 Clustal W 将 CarKCS 与拟
南芥 KCS 基因家族成员的氨基酸序列进行同源性
比对分析，发现 CarKCS 基因与 KCS18 的亲缘关系
最近，同属于 FAE1 － like亚家族。
图 4 CarKCS与拟南芥 KCS基因家族蛋白的进化树
Fig. 4 A phylogenetic tree of family proteins
of CarKCS and KCS gene
2. 4 CarKCS基因种子特异表达载体的构建
用 AscI 和 BamHI 分别双酶切 T － CarKCS 和
pFGC －5941. nap质粒，切胶回收目的片段，并用 T4
连接酶将 T － CarKCS片段和 pFGC － 5941. nap 载体
目的片段连接，根据 pFGC － 5941. nap 载体序列和
目的片段序列设计一对引物用来检测载体是否插入
目的片段，引物序列如下:
NAP － F:5 － GCTTCTCTCTCACAGCACACA
CATAC －3
KCS － R:5 － TGAACATGCAACAAGTCTTTAG
CCAGATC －3
从图 5 中分析，2 号和 3 号泳道均以 pNapin －
CarKCS质粒为模板，2 号泳道为检测引物所扩增出
的条带，大小为 848 bp 左右，与所设计的大小相符。
3 号泳道为 KCS基因引物所扩增出的条带，大小为
1. 5 kb左右。说明 CarKCS 片段已成功插入 pFGC
－5941. nap 表达载体中，已成功构建好 pNapin －
612 CROP RESEARCH 2012，26(3)
CarKCS过表达载体。
图 5 pNapin － CarKCS过表达载体的 PCR检测
Fig. 5 PCR detection of pNapin － CarKCS
overexpression vector
M. 100 bp plus DNA Ladder;1. 阴性对照;2. pNapin －
CarKCS质粒 PCR检测;3. CarKCS PCR检测
2. 5 种子特有表达载体的酶切验证
用 AscI 和 BamHI 双酶切所提的 pNapin －
CarKCS 质粒，如图 6 所示。泳道 2 为 pNapin －
CarKCS质粒双酶切后得到的片段长度与目的片段
的大小刚好相符，证明目的基因碎米荠 β －酮脂酰
－ CoA 合酶 (KCS)基 因 已 成 功 连 接 到 pF-
GC5941. nap质粒为载体的植物表达载体中。进一
步验证了 CarKCS 片段已成功插入 pFGC －
5941. nap 表达载体中，已成功构建好 pNapin －
CarKCS过表达载体。
图 6 pNapin － CarKCS过表达载体的酶切检测
Fig. 6 Enzyme detection of overexpression
vector of pNapin － CarKCS
M. 100 bp plus DNA Ladder;1. 阴性对照;2. AscI和 BamHI
双酶切 pNapin － CarKCS 过表达载体
3 讨论
拟南芥是一种良好的十字花科模式植物。
Rosska等以拟南芥为材料，分别对 40 粒开花后 3 ～
15 d 的未成熟种子和第 17 d 的成熟种子进行了脂
肪酸成分分析，结果发现超长链脂肪酸从第 7 d 才
开始出现，然后迅速积累直至第 13 d，到第 15 d 种
子接近成熟时超长链脂肪酸的合成也随之基本完
成［19］。Tumham和 Northocet 通过实验发现甘蓝型
油菜中储存脂也在胚发育中期合成速率最大［20］。
本实验构建的 pNapin － CarKCS 过表达载体启动子
来源于甘蓝型油菜种子储藏蛋白 Napin A基因的启
动子，具有种子特异、高效表达的特性，能够满足
超长链脂肪酸合成的限速酶基因 (KCS 基因)在油
菜种子中特异表达与调控。
图 7 CarKCS基因过表达载体构建示意图
Fig. 7 Construction of the overexpression
vector of CarKCS gene
芥酸是形成神经酸的原料，通过 KCS 的延长催
化作用，加入 2 个碳原子后就能合成 24:1 的神经
酸。以往通过基因工程的方法获得能产生神经酸的
转基因植株，基本上是将克隆的 KCS 转到拟南芥或
其它植物中，如埃塞俄比亚芥。但这些植物往往不
是大田作物，且芥酸(22:1)含量极低。油菜作为主
要的油料作物之一，广泛种植于中国、加拿大、澳大
利亚及北欧国家，已成为第三大经济作物，菜子油已
经成为第三大植物油［21］;而且在油菜的一些材料中
芥酸含量很高。所以，在成功构建了碎米荠 CarKCS
基因的种子特异表达载体基础之上，我们将进一步
通过农杆菌介导的转化法转化高芥酸含量的甘蓝型
油菜品种 GX － 29，以期获得 pNapin － CarKCS 表达
的稳定转基因植株，筛选出神经酸含量高、产量高的
稳定转基因油菜植株，以为获得廉价的神经酸产品
来满足社会需求奠定基础。
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