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粘毛黄芩 CHS基因的克隆分析及其
正反义植物表达载体的构建
饶　灿 ,雷　桅 ,李　鹏 ,孙一铭 ,孙　敏＊
(西南大学生命科学学院三峡库区生态环境教育部重点实验室 ,重庆 400715)
　　摘要　目的:获得粘毛黄芩查尔酮合成酶(CHS)基因正反义植物表达载体 , 通过转化粘毛黄芩进一步探讨
CHS在黄酮化合物生物合成途径上的作用机理。方法:通过 RT-PCR从粘毛黄芩总 RNA扩增出 CHS基因目的片
段 , 克隆至 PMD18-T载体 ,测序并进行生物信息学分析。结果:测序证明序列正确 , 同时推测出 CHS氨基酸序列及
三维结构。克隆片段和 pCAMBIA1304 +载体用 BlgII和 BstEII双酶切 , 然后连接 CHS基因目的片段及 pCAM-
BIA1304+载体大骨架片段 , 得到 CHS正反义植物表达载体。结论:成功构建粘毛黄芩 CHS基因正反义植物表达载
体 , 并通过冻融法转化 C58C1和 LBA4404, 为农杆菌介导的粘毛黄芩 CHS基因对植物的遗传转化奠定基础。
关键词　粘毛黄芩;查尔酮合成酶基因;克隆;载体构建
中图分类号:Q785　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2009)11-1661-04
CloningofScutelariaviscidulaCHSGeneandConstruction
ofItsSenseandAntisensePlantExpressionVectors
RAOCan, LEIWei, LIPeng, SUNYi-ming, SUNMin
(KeyLaboratoryofEco-environmentsinThreeGorgesReservoirRegionofMinistryofEducation, CollegeofLifeScience, Southwest
University, Chongqing400715, China)
Abstract　Objective:TogetScutellariaviscidulaCHSgenesenseandantisenseplantexpressionvectors, andexplorethemecha-
nismofCHS′seffectontheflavonoidbiosyntheticpathwaythroughthetransformationofScutellariaviscidula.Methods:CHSgenefrag-
mentwasamplifiedbyReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction(RT-PCR)fromtotalRNAofScutellariaviscidulaandcloned
intoPMD18-Tvector, sequencedandbioinformaticlyanalyzed.Results:TheDNAsequencewascorrectandwesimultaneouslyguessed
theaminoacidsequenceandthethree-dimensionalstructureofCHS.ClonedfragmentsandpCAMBIA1304+vectorweredigestedusing
BlgIIandBstEIIatthesametime, thentheywereconnectedwithCHSgenefragmentandpCAMBIA1304+bigskeletonfragmenttoget
CHSsenseandantisenseplantexpressionvectors.Conclusion:ThesuccessfulconstructionofScutelariaviscidulaCHSgenesenseand
antisenseplantexpressionvectors, andthetransformationintoC58C1andLBA4404throughthefreeze-thawmethod, laythefoundation
forAgrobacterium-mediatedtransformationofScutellariaviscidulaCHSgeneinplantheredity.
Keywords　ScutelariaviscidulaBunge;CHSgene;Cloning;Vectorsconstruction
收稿日期:2009-03-18基金项目:三峡库区生态环境教育部重点实验室开放基金(EF200609)作者简介:饶灿(1985-), 女 , 硕士研究生 ,主要从事药用植物代谢工程研究;E-mail:raocan@swu.edu.cn。＊通讯作者:孙敏 , E-mail:jwcsm@swu.edu.cn。
　　黄酮类化合物是一类重要的植物次级代谢产
物 ,在植物花色形成 、植物育种 、抗紫外线辐射 、防止
病原微生物侵染以及在植物与微生物互相作用中都
发挥了重要作用。具有调节血脂 、抗炎 、抗菌 、抗氧
化 、抗肿瘤等多种生物活性〔1〕 ,是一些药用植物的
主要活性成分。查尔酮合成酶(chalconesynthase,
CHS)是黄酮类化合物生物合成的第一个关键酶 ,也
是限速酶 ,是调控植物黄酮类化合物代谢的关键基
因之一 。目前 ,已从拟南芥〔2〕、百合 〔3〕、矮牵牛 〔4〕等
多种植物中克隆出 CHS基因 ,并对其遗传转化 ,用
于植物花色转基因研究〔5, 6〕。而对 CHS基因调控黄
酮类生物活性物质生物合成的研究很少 。
粘毛黄芩(ScutelariaviscidulaBunge)为唇形科
多年生草本植物 ,是一种常见的中药 ,有效成分主要
是黄酮类化合物黄芩苷 ,由于粘毛黄芩生长周期长 ,
过度采挖 ,野生资源已明显减少 ,使得黄芩苷在数量
和质量上都无法满足药物开发的需要。针对此问
题 ,本实验以 CHS基因为研究对象 ,从粘毛黄芩中
克隆 CHS基因 ,应用基因重组技术将 CHS基因克
隆到表达载体 pCAMBIA1304+中 ,构建 CHS基因正
反义表达载体 ,并通过冻融法将表达载体转入发根
农杆菌 C58C1和根癌农杆菌 LBA4404,得到完整的
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植物表达载体系统 ,为进一步探究 CHS在粘毛黄芩
黄芩苷代谢中的作用机理奠定基础。
1　材料
1.1　来源　粘毛黄芩(ScutelariaviscidulaBunge)
的种子购买于山西绛县远博农副产品公司 。
1.2　质粒及菌种　pCAMBIA1304+、E.coliDH5α、
农杆菌 C58C1及 LBA4404均由西南大学生命科学
学院三峡库区生态环境教育部重点实验室提供;
PMD18-Tvector购自 TaKaRa公司 。
1.3　试剂　RevertAidTM FirstStrandcDNASynthe-
siskit购自 TaKaRa公司;胶回收试剂盒为 BioFlux
的 BiospinGelExtractionkit;质粒提取试剂盒为
E.Z.N.A.TMPlasmidminikitI;DNA聚合酶 、限制性
内切酶和 DNAMarker购自 TaKaRa公司;其他试剂
均为国产分析纯 。人工寡核苷酸引物由大连宝生物
工程有限公司合成。
2　方法
2.1　CHS基因的克隆　根据本实验室已获得的粘
毛黄芩 CHS基因全序列(GeneBank的登录号为:
EU386767)设计正反义引物 ,见表 1。
　表 1　 引物序列及酶切位点
引物名称 引物序列 酶切位点
F-chs CCAGATCTATGGTGACAGTTGAAGAATTCC BlgI
R-chs CGGTTACCATTGAGAGGCACACTATGCA BstEII
F-antichs CGGTTACCTTCATGATGTACCAGCAGGGC BstEII
R-antichs CCAGATCTCTTGGCGGAGGCCTTCCTCA BlgI
　　用 Trizol法提取粘毛黄芩根 、茎 、叶各组织的总
RNA,进行 RT-PCR扩增。 PCR扩增的反应条件为:
94 ℃预变性 3min, 94℃变性 30s,复性 30s(正义:
Tm=65 ℃,反义 Tm=61.5 ℃), 72 ℃延伸 1 min, 34
个循环 ,最后 72℃延伸 10min。PCR产物经 1%琼
脂糖凝胶电泳得目的产物条带 ,约 1 200 bp(正义)
和 540bp(反义),胶回收 , 然后与 pMD18-Tvector
16 ℃过夜连接。接着将连接产物 pMD-chs和 pMD-
antichs转化感受态大肠杆菌 DH5a,在含 Amp(氨苄
青霉素)的 LB培养基平板上筛选阳性克隆 ,并通过
PCR鉴定阳性克隆 ,选择鉴定正确的菌液送上海英
骏生物技术有限公司测序 。
2.2　CHS基因的生物信息学分析　用 NCBI上的
Blast对 CHS基因 ORF核酸序列进行同源性比对 ,
氨基酸序列的翻译使用 VectorNTI8软件 , 将 CHS
氨基酸序列传到 SWISS-MODEL的建模服务器中进
行 CHS结构的三维建模 ,然后在 ViewerLite4.2软
件中进行序列编辑 ,得到粘毛黄芩 CHS的三级结构
模型 。
2.3　CHS正反义表达载体的构建及转入农杆菌　
用 BlgI和 BstEI双酶切重组克隆质粒 pMD-chs、
pMD-antichs和表达质粒载体 pCAMBIA1304+,回收
克隆片段及 pCAMBIA1304+大片段 ,经 T4 DNA连
接酶 16 ℃过夜连接 ,取 10 μL连接产物转化大肠杆
菌 DH5α,在 Km(卡那霉素)抗性平板筛选阳性克
隆 ,通过基因特异引物 PCR检测和酶切分析验证阳
性克隆。 CHS正反义表达载体通过冻融法转化
C58C1和 LBA4404,挑单菌落 PCR鉴定。
3　结果与分析
3.1　CHS基因的克隆　根据 F-chs、R-chs和 F-an-
tichs、R-antichs两对特异引物 , 以反转 cDNA为模
板 ,分别用高保真 DNA聚合酶和普通 DNA聚合酶
进行 PCR扩增 ,获得约 1 200 bp大小的 CHS基因
ORF全长片段(正义片段 chs)和 540bp大小的 CHS
基因核心片段(反义片段 antichs)。将 PCR目的条
带经胶回收后 ,连接到 pMD18-Tvector上 ,转化大肠
杆菌 DH5α, 随机挑取菌落 , 提取克隆重组质粒
pMD-chs和 pMD-antichs进行 PCR鉴定。鉴定质粒
能扩增与阳性对照相同的目的条带 ,表明目的基因
已成功插入到克隆载体 。然后将阳性菌液送去公司
测序 。
3.2　CHS基因序列的测定与生物信息学分析　测
序得到目的基因序列 ,通过 Blast比对 ,克隆的 CHS
基因 ORF序列与 GenBank中所登录的粘毛黄芩
CHS基因序列有很高的同源性 ,初步验证所得到的
目的基因为粘毛黄芩 CHS基因。接着翻译得到
CHS氨基酸序列 ,起始密码子为 ATG,终止密码子
是 TGA。据 CHS氨基酸序列进行 CHS的三维建
模 ,获得 CHS编码蛋白的三级结构模型(图 1),结
构存在催化元件 ,进一步证明所得目的基因即为粘
毛黄芩 CHS基因 ,表达后具有酶的催化功能 。在黄
酮代谢途径中 , CHS以此三级结构行使酶的催化作
用 , 催化 3个分子的丙二酰 -CoA和 1个分子的对香
豆酰 -CoA结合形成一个具有 C15架的黄酮类化合
物———查尔酮 。
3.3　CHS基因正反义表达载体的构建 、鉴定及转
化农杆菌　重组克隆质粒 pMD-chs和 pMD-antichs
均经 BlgI和 BstEII双酶切 ,分别得到 CHS基因
ORF全长 chs和 CHS基因核心片段 antichs。同时用
BlgI和 BstEI双酶切载体 pCAMBIA1304+,切除
GUS-GFP基因片段 ,得到 pCAMBIA1304+载体大骨
架片段(图 2)。
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图 1　粘毛黄芩 CHS编码蛋白的三维结构
图 2　重组质粒酶切图
注: 1.重组质粒 pMD-chs;3.重组质粒 pMD-antichs; 5.λ-EcoT14I
digest; 2, 4.DL2000;6.pCAMBIA1304+
　　然后将 pCAMBIA1304+载体大骨架片段和 CHS
基因目的片段连接 ,转化大肠杆菌 DH5α,挑菌提取
质粒 ,进行 PCR扩增得到预期的目的条带 ,同时质
粒用 BlgI和 BstEI进行双酶切 ,均得到相应的目
的条带(图 3,图 4)。说明目的片段整合到表达载
体上 ,构建的正反义 CHS基因表达载体是成功的 。
CHS正反义植物表达载体分别命名为 pCAM-
BIA1304+-chs和 pCAMBIA1304+-antichs(图 5)。
图 3　pCAMBIA1304+-chs的酶切及 PCR鉴定
注:1.λ-EcoT14Idigest;2.pCAMBIA1304+-chs;3, 4.DL2000;5.chs
的 PCR鉴定
图 4　pCAMBIA1304+-antichs的酶切及 PCR鉴定
注:1.λ-EcoT14 Idigest; 2.pCAMBIA1304+-antichs; 3, 4.DL2000;
5.antichs的 PCR鉴定
图 5　表达载体 pCAMBIA1304+-chs和 pCAMBIA1304+-antichs的示意图
　　用冻融法 ,将表达载体质粒 pCAMBIA1304+-chs
和 pCAMBIA1304+-antichs分别转化农杆菌感受态
LBA4404和 C58C1,从含有相应抗性平板上随机挑
取单菌落培养 ,然后以此为模板进行 PCR扩增 ,结
果均能扩增出相应的目的条带 , 说明 pCAM-
BIA1304+-chs和 pCAMBIA1304+-antichs已转入所
鉴定的农杆菌中。同时对转化的 C58C1也进行
rolB、rolC基因的检测。最后成功得到可用于遗传
转化的工程菌 。
4　讨论
本实验克隆了粘毛黄芩 CHS基因 ,并进行了生
物信息学分析 ,证明构建了 CHS基因正反义表达载
体 ,转化农杆菌得到工程菌 ,为粘毛黄芩的遗传转化
提供了条件 ,最终将有助于通过 CHS基因的调控明
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确黄酮化合物生物合成途径上该关键步骤的反应机
理 ,为黄芩苷的代谢工程提供重要的作用靶点 。
黄酮类化合物在自然界中分布广泛 ,由于其具
有多种的生物活性和药理功能 ,近几年来成为研究
和开发利用的热点。查尔酮合成酶是黄酮类化合物
生物合成调控重要的调控靶点 ,也是植物黄酮化合
物代谢工程领域的研究热点 。通过转 CHS基因来
调控黄酮类化合物的含量 ,是一条可行且十分有效
的方法 。
粘毛黄芩是我国传统的珍贵药用植物 ,黄酮类
化合物是其主要活性成分之一 。因此 ,克隆出粘毛
黄芩 CHS基因及获得 CHS基因正反义植物表达载
体 ,为进一步将 CHS基因导入粘毛黄芩 ,提高粘毛
黄芩的药用价值创造了条件 ,为深入开展植物黄酮
类次生代谢工程研究奠定了一定基础 。
参 考 文 献
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收稿日期:2009-01-04基金项目:盐城市 2008年科技发展计划(社会发展)项目(YK2008081)作者简介:宋建平(1958-),女,副教授 ,主要从事中药品质评价研究;Tel:0515-83012222。＊通讯作者:刘训红 , Tel:025-858411511, E-mail:liuxunh1959@sohu.com。
罗布麻叶挥发性成分分析及其动态变化研究
宋建平1 ,张月婵 2 ,刘训红 2＊ ,王丽娟2
(1.盐城卫生职业技术学院 ,江苏 盐城 224006;2.南京中医药大学 ,江苏 南京 210029)
　　摘要　目的:探讨罗布麻叶挥发性成分的动态积累 , 为确定罗布麻叶的最佳采收期提供依据。方法:采用 HS-
GC-MS法分析不同采收时间罗布麻叶的挥发性成分 ,并用峰面积归一化法确定各成分的相对含量 ,以其中的主要
活性成分指标 , 考察它们的动态变化。结果:初步分离出 39种成分 ,鉴定出 38种成分 ,其中共有成分 21种 , 不同生长
期罗布麻叶中挥发性成分积累具有一定规律。结论:罗布麻叶挥发性成分积累曲线最大峰值与传统采收期基本一
致。
关键词　罗布麻叶;挥发性成分;动态变化
中图分类号:R284.1　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2009)11-1664-04
StudyontheDynamicChangeofEssentialComponentsinFoliumApocyniVeneti
SONGJian-ping1 , ZHANGYue-chan2 , LIUXun-hong2 , WANGLi-juan2
(1.Yanchenghealthvocational＆technicalcollege, Yancheng224006, China;2.NanjingUniversityofTCM, Nanjing210029, China)
Abstract　Objective:TodeterminethedynamicchangeofessentialcomponentsinFoliumApocyniVeneti, andprovidescientfic
basisfordeterminingthebestcolectingtime.Methods:TheessentialcomponentsofFoliumApocyniVenetifromdiferentharvesting
timewereanalyzedbyHSGC-MS.Therelativecontentofthecomponentsweredeterminedwithpeakareanormalizationmethod, and
thedynamicchangesof7mainboiactivecomponentsweredetermined.Results:39 constituetntswereseparatedand38 compoundswere
identified.Therewere21co-containingcompoundsinFoliumApocyniVenetifromdiferentharvestingtime, theaccumulationofwhich
showedaregularpatern.Conclusion:ThemainessentialcomponentsinFoliumApocyniVenetiarethehighestinthetraditionalhar-
vestingtime.
Keywords　FoliumApocyniVeneti;Essentialcomponents;Dynamicchange
·1664· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 11期 2009年 11月