全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 7期, 2010年 7月 693
收稿 2010-04-20 修定 　2010-05-14
* 通讯作者(E-mail: bkkuai@fudan.edu.cn; Tel: 021-65642648)。
人工microRNA干扰拟南芥AtCDKC;1和AtCDKC;2基因表达的初步研究
赵臻, 邱凯, 蒯本科*
复旦大学生命科学学院, 遗传工程国家重点实验室和植物科学研究所, 上海 200433
提要: 以来源于拟南芥的microRNA序列为骨架, 构建抑制AtCDKC;1和AtCDKC;2基因的人工microRNAs载体, 研究其对
目的基因表达的抑制效果。选择AtCDKCs基因的特异性序列, 通过重叠PCR的方法改造拟南芥microRNA164a骨架序列,
连接到双元载体pPZPY122, 在农杆菌介导下转化拟南芥。RT-PCR分析表明, 人工microRNA能够显著抑制目的基因的表
达, 获得了抑制效果明显的转基因植株, 并且对AtCDKCs在拟南芥生长发育中的作用进行了初步的研究。
关键词: 周期蛋白依赖性激酶; 人工microRNA; RNA干扰; 基因表达; 拟南芥发育
A Preliminary Analysis of Artificial MicroRNAs-Mediated Interference of
AtCDKC;1 and AtCDKC;2 Expression in Arabidopsis
ZHAO Zhen, QIU Kai, KUAI Ben-Ke*
State Key Laboratory of Genetic Engineering and Institute of Plant Biology, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai
200433, China
Abstract: By using Arabidopsis endogenous microRNA sequences, artificial microRNAs (amiRNAs) were
generated to knock down the expressions of AtCDKCs. To construct plasmids, oligonucleotide sequences tar-
geting AtCDKCs-specific locus were used to engineer microRNA164a by overlapping PCR and the resultant
sequence was inserted into the binary vector pPZPY122. Arabidopsis of wild type (Col-0) was transformed by
the Agrobacterium-mediated approach. RT-PCR analysis showed that the target genes were both specifically
and efficiently silenced in transgenic lines. The roles of AtCDKCs in the growth and development of Arabidopsis
was analyzed based on the transgenic plants.
Key words: AtCDKC; artificial microRNA; RNA interference; gene expression; Arabidopsis development
转录循环(transcription cycle)是一个受到高度
调控的动态过程, 多种调节因子在转录阶段起着重
要作用。RNA聚合酶 II (RNA polymerase II,
RNAPII)是参与真核生物基因转录循环的重要分子
之一。mRNA前体分子的加帽、剪接、3端加工
等多个步骤都与RNAPII转录延伸复合物(transcript
elongation complex, TEC)密切相关(Sim等 2004)。
近年来的研究表明细胞周期蛋白依赖性激酶复合物
不仅是细胞周期运转的重要调控因子, 而且可以通
过磷酸化RNAPII及相关分子参与转录循环的正向
调节和负向调节, 是动植物细胞基因表达调控中极
其重要的分子。正向转录延伸因子b (positive tran-
scription elongation factor b, p-TEFb)是一类由周期
蛋白依赖性激酶 CDK9和周期蛋白组成的复合物,
调控基因转录的起始过程(Garriga和Grana 2004;
Peterlin和Price 2006)。p-TEFb通过磷酸化RNAPII
大亚基C端结构域(C terminal domain, CTD)中的丝
氨酸残基, 激活RNAPII的转录活性。同时p-TEFb
还可以使负向转录延伸因子(negative transcription
elongation factor, NELF)从转录复合物上解离下来,
消除其对 RNAPII的抑制作用, 从而使转录循环得
以继续进行(Hirose和Ohkuma 2007)。
拟南芥 RNAPII 的 CTD 含有 42 次重复的
YSPTSPS序列, 受到多种分子的调控。CDKD;2/
CYCH1可以磷酸化RNAPII CTD, 并且该过程依赖
CDKF;1的激酶活性(Shimotohno等 2003)。CDKE;1
在雄蕊和心皮的发育过程中起着重要作用, 推测与
细胞分化有关(Wang和Chen 2004)。AtCDKC;1和
AtCDKC;2可以与CYCT结合形成p-TEFb, 磷酸化
RNAPII CTD, 调控基因的转录循环。在番茄、紫
花苜蓿、拟南芥和水稻中先后找到了CDK9的同源
DOI:10.13592/j.cnki.ppj.2010.07.007
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物, 在转录过程中起着与p-TEFb相似的功能(Joubes
等2001; Fulop等2005; Cui等2007; Huang等2008)。
人工microRNA技术利用内源性microRNA前
体产生 21 bp miRNA引起基因沉默。除了改变
miRNA-miRNA*的序列, amiRNA保留了原有序列
的结构特征, 在CaMV 35S启动子的驱使下可以在
植物体内得到较高水平的表达。基因表达分析表
明amiRNA可以像内源性microRNA一样特异地抑
制目的基因的表达(Alvarez等 2006; Schwab等
2006)。拟南芥microRNA164家族由microRNA-
164a、microRNA164b和microRNA164c组成, 是
最早被发现和研究的微小RNA之一, 也是能够应用
于人工microRNA技术的候选分子之一。它们主
要作用于具有NAC结构域的转录因子, 在植物胚胎
的发育、叶片和花器官边界的形成过程中起着重
要作用。研究发现microRNA164a通过调节CUC2
基因的表达参与叶片边缘形态的建成过程(Krisztina
等 2006)。
本研究针对双子叶模式植物——拟南芥基因
组中高度同源的CDKC;1和CDKC;2基因T-DNA插
入突变体较难筛选得到纯合体的情况, 利用基因沉
默技术——人工microRNA, 选择microRNA164a前
体分子作为骨架, 改变miRNA序列, 构建相应载体
单独抑制和共同抑制AtCDKC;1和AtCDKC;2, 旨在
揭示两者在拟南芥生长发育过程中各自所起的作
用, 以便探讨两者在物种进化过程中发生基因重复
的意义。
材料与方法
1 材料与试剂
1.1 菌株和质粒 根癌农杆菌(Agrobacterium tume-
faciens) LBA4404、GV3101和大肠杆菌(Escherichia
coli) Top10由本实验室保存。双元载体pPZPY122
由本实验室保存。中间载体 pART7和双元载体
pART27 simpler由以色列Weizmann研究院Eshed
教授惠赠。
1.2 酶和主要试剂 限制性内切酶BamHI、NotI、
HindIII、SalI、XbaI、碱性磷酸酶和 T4 DNA连
接酶均购于 TaKaRa公司。PCR试剂(Pfu聚合酶、
Taq聚合酶)、胶回收试剂盒和 cDNA第一链合成
试剂盒均购自上海捷瑞公司。引物由上海塞百盛
公司合成。氨苄青霉素、氯霉素、壮观霉素、
链霉素、利福平、庆大霉素和卡那霉素均购于上
海生工公司。序列测定主要在北京华大和上海联
合基因公司。
1.3 植物、培养基及培养条件 生态型Columbia
(Col-0)拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)置于长日照
光周期为 16 h光照 /8 h黑暗、光照强度为 130
mmol·m-2·s-1、相对湿度为 70% (白天)~85% (夜间)
和温度为(22±2) ℃的培养室内生长。播种和开花
时各浇一次 PNS营养液。
2 方法
2.1 人工microRNA表达载体的构建
2.1.1 人工microRNA骨架的构建与改造 选择拟
南芥miRNA164a序列, 针对序列两端上下游46 bp
和 63 bp的位置设计引物, 引入酶切位点 XbaI和
SalI。将扩增获得的 PCR产物克隆到 pMD19-T质
粒, 得到重组质粒 pMD19-T-miRNA164a。PCR法
鉴定, 选取酶切片段大小正确的质粒送去测序。
以测序正确的 pMD19-T-miRNA164a质粒为
模板, 根据特异抑制CDKC;1和CDKC;2及共同抑
制CDKC;1和CDKC;2的 21 bp的小片段序列设计
各 2对引物(表 1)。通过重叠 PCR (overlapping
PCR)反应, 置换掉miRNA164a骨架中的相应序列
(图 1 )。用胶回收试剂盒回收扩增片段 , 连接
pMD19-T载体, 转化感受态 E. coli Top10。挑取
阳性克隆送去测序, 分别命名为pMD19-T-miRNA-
164a-C1 (C2, Cb)。
2.1.2 植物表达载体pPZPY122-miRNA的构建
BamHI和SalI双酶切经测序正确质粒和pPZPY122
载体, 回收目的片段, 用T4 DNA连接酶连接, 转化
感受态 E. coli Top10, 挑选阳性克隆, 酶切鉴定, 分
别命名为 pPZPY122-miRNA164a-C1 (C2, Cb)。
2.2 拟南芥转基因植株的获得
2.2.1 感受态农杆菌LBA4404的转化 采用液氮冻
融法将pPZPY122-miRNA164a-C1 (C2, Cb)质粒转
入农杆菌 LBA4404, 在含(Rif 40 mg·L-1, Str 100
mg·L-1, Chl 10 mg·L-1)抗性的YEB固体培养基上筛
选阳性克隆, 并用 PCR法鉴定。
2.2.2 花苞浸染法转化拟南芥植株 取2 mL菌液接
种于加有相同抗性的YEB培养基中, 相同培养条件
下培养至 OD600=1.2。离心后, 去上清, 重悬浮于
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表 1 引物序列
Table 1 The sequence of primers
引物名称 引物序列(5→ 3)
1-in-5 TTAGTGGGATGGTTTGGACCTAACCAACAAACACGAAATCC
1-in-3 TTTAGTGGGTAGGTATGGACCTAATAAGCAAATGAGACGGATTT
1-out-f AGGTCCAAACCATCCCACTAAACATGGAGATTCTCACCCGC
1-out-r TTAGGTCCATACCTACCCACTAAACATGAGCTCTTCACCCATTGA
2-in-5 TCTAGCACCACCCATAGGGTTAACCAACAAACACGAAATCC
2-in-3 GTTCTAGCACTTCCCTTAGGGTTAATAAGCAAATGAGACGGATTT
2-out-f AACCCTATGGGTGGTGCTAGAACATGGAGATTCTCACCCGC
2-out-r AACCCTAAGGGAAGTGCTAGAACATGAGCTCTTCACCCATTGA
b-in-5 TCACATGACAATAGTGAAGCCAACCAACAAACACGAAATCC
b-in-3 GTTCACATGATTATATTGAAGCCAATAAGCAAATGAGACGGATTT
b-out-f TTGGCTTCAATATAATCATGTGAACATGAGCTCTTCACCCATTGA
b-out-r TTGGCTTCACTATTGTCATGTGAACATGGAGATTCTCACCCGC
图 1 人工microRNA和RNA干扰序列的构建策略和鉴定
Fig.1 Constructing strategies and sequencing confirmations of artificial microRNAs and RNA interference
A: 重叠 PCR法置换 miRNA序列构建人工 microRNAs (通过两对引物 1-2、3-4置换 microRNA的miRNA序列以及与之不完
全配对的miRNA*序列); B: 拟南芥microRNA164a基因序列模拟的二级结构(斜体序列是miRNA, 下划线标记序列是miRNA*); C~E:
单独抑制 AtCDKC;1、AtCDKC;2和共抑制 AtCDKCs所用miRNA序列的测序结果; F: 共抑制 AtCDKCs基因 RNAi发卡结构的构
建策略。
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5%蔗糖溶液, 加入 Silwet L-77, 至终浓度 0.03%。
将生长状况良好的拟南芥培养至茎高约3 cm时, 去
顶生花序。在去顶后 4 d进行转化。转化前使拟
南芥吸足营养液, 去除开花的花苞和果荚。倒浸在
菌液中 10 s。将材料用保鲜膜覆盖以保持湿度, 暗
处隐蔽过夜。第 2天放回培养室内正常条件下培
养直到成熟收种。
2.2.3 转基因拟南芥的筛选和鉴定 用70%乙醇浸
泡种子表面消毒 1 min。用 10%次氯酸钠溶液消
毒 8 min。用无菌水洗涤 4~6次后, 均匀涂播于含
有 75 mg·L-1庆大霉素的MS固体培养基平板上。4
℃春化 2~3 d, 移入培养室。两周后将平板上正常
生长的幼苗移入土中, 覆膜保湿一周。CTAB法抽
提候选转基因植株DNA, 以横跨载体的序列设计引
物, PCR法鉴定阳性转化子, 所得植株分别命名为
miR-cdkc;1、miR-cdkc;2和 miR-cb。
TRIzol法抽提转基因植株总 RNA, 溶解于
DEPC处理过的无菌水中。紫外分光光度计测定
RNA的浓度。用 cDNA第一链合成试剂盒逆转录
得到的 cDNA, 进行PCR反应扩增,鉴定AtCDKC;1
和AtCDKC;2的表达情况, 并以UBQ-10作为内参。
PCR反应程序为先94 ℃ 5 min; 然后94 ℃ 40 s, 57
℃ 40 s, 72 ℃ 40 s总共进行 30个循环; 最后 72 ℃
延伸 5 min。
2.3 抑制AtCDKCs的pART27-RNAi-b转基因植
株的获得 选取 AtCDKC;1和AtCDKC;2 cDNA序
列上各 193 bp和 353 bp的短片段, 构建 35S启动
子驱动下的双插入反向重复序列的表达载体
pART27-RNAi (图 1)。选取蓖麻过氧化氢酶基因
的内含子插入载体pBlueScript KS+, 作为反向重复
序列的环结构, 然后依次插入AtCDKC;2和AtCDKC;1
的短序列。测序正确后, 将整个发卡结构插入载
体 pART7。NotI酶切后, 连接双元载体 pART27
simpler。按前述相同方法进行植物转化和鉴定, 所
得植株命名为 RNAi-cb。
2.4 AtCDKCs序列的进化分析 通过从 TAIR和
NCBI等公共数据库获得AtCDKCs基因和蛋白质序
列, 搜索紫花苜蓿(CAA65979), 豌豆(CAA39904), 水
稻(CAD92448, XP_475182)等多个物种中具有较高
同源性的序列。应用Mega4.0软件, 采用N-J法和
M-P法, 重复次数(replicate)分别为500和1 000, 其
他均为软件默认设置, 构建系统发生树。
实验结果
1 人工microRNA的构建
从野生型拟南芥基因组 DNA中克隆到包含
miRNA164a序列的片断, 经过酶切和测序鉴定, 构
建 pMD19-T-miRNA164a质粒。通过重叠 PCR的
方法以miRNA164a为骨架构建特异抑制AtCDKC;1
和 AtCDKC;2以及共同抑制 AtCDKCs的人工
microRNAs, 测序验证(图 1)。将测序正确的人工
microRNAs片段插入双元载体 pPZPY122。
2 转基因植株及其表型的鉴定
将构建的pPZPY122-miRNA164a-C1 (C2, Cb)
质粒转化农杆菌LBA4404 (以pPZPY122空载体作
为对照), 用花苞浸染法转化野生型拟南芥。通过抗
性筛选, 分别得到单独抑制AtCDKC;1和AtCDKC;2
的转基因植株。RT-PCR检测抑制效果, 发现转基
因植株中目的基因的表达水平降低(图 2)。
单独抑制AtCDKC;1和AtCDKC;2的转基因植
株在叶片形态、抽苔时间、果荚长度和种子数量
等 4个方面表现出明显差异(图 3)。miR-cdkc;2转
基因植株表现出莲座叶生长速度减慢, 失去部分极
性, 抽苔时间延迟。在生命周期的后期, 莲座叶的
长度和宽度明显大于野生型, 叶片呈深绿色, 开在
茎干顶端的花朵往往出现5片花瓣, 表现出失去花
器官特征的现象。miR-cdkc;1转基因植株的叶片
形态和抽苔时间正常, 但生成果荚的长度和种子的
数量均有所下降, 这与miR-cdkc;2转基因植株的表
型是相似的。共抑制AtCDKC;1和AtCDKC;2的转
基因幼苗, 约有 80% (25/31)在移入土中后 2周内
死亡, 存活下来的植株没有表现出明显的抑制效果,
形态与野生型植株相似。而获得的 24株 RNAi转
基因植株都能够存活下来。有部分植株表现出类
似于AtCDKC;2突变体的表型, 例如莲座叶变大, 晚
花(图 4 )。
3 AtCDKCs生物信息学分析
AtCDKC;1和 AtCDKC;2的基因结构相似, 氨
基酸序列的同源性高达 92%。在人、小鼠和酵母
等动物基因组中只存在单拷贝的 CDK9, 而紫花苜
蓿和番茄中也只有单个 CDKC基因。通过蛋白序
列同源性比对(BLASTP)分析AtCDKCs和芸苔的两
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图 2 miR-cdkc;1&2转基因植株的鉴定
Fig.2 Identification of miR-cdkc;1&2 transgenic lines
A~D: 对照、miR-cdkc;1、miR-cdkc;2和 cdkc;2-2 (CDKC;2 T-DNA插入突变体)的植株表型(4 周), bar=1 cm; E~G: 对照、
miR-cdkc;1、miR-cdkc;2的植株表型(6 周); H: 特异引物扩增转基因株系的基因组 DNA (从左至右依次是Marker、野生型(col-0)
阴性对照、转基因株系 1~5); I: 对照、miR-cdkc;1和 miR-cdkc;2的植株表型(8 周); J: RT-PCR检测转基因植株 miR-cdkc;2 (1和 2
列)和 miR-cdkc;1 (3 和 4列)中 AtCDKC;1 和 AtCDKC;2的表达情况。UBQ-10 作为内参。
图 3 miR-cdkc;1&2转基因植株的表型鉴定
Fig.3 Phenotypes of reproductive organs of miR-cdkc;1&2 transgenic lines
A~D: miR-cdkc;1、cdkc;2-2、miR-cdkc;2和对照的主茎; E~G: 对照、miR-cdkc;2和 cdkc;2-2的花器官; H、I: 对照和 miR-
cdkc;1的果荚; J : 对照(左)和 miR-cdkc;2的果荚。
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图 5 AtCDKCs及其同源序列的系统发生树
Fig.5 Phylogenetic tree of AtCDKCs and homologous sequences
所用序列的 GenBank登录号(按从上向下顺序): Arabidopsis, NP_196589; Brassica, AAZ67608; Arabidopsis, NP_201301; Brassica,
AAZ41831; Tomato, CAC5139; Alfalfa, CAA65980; Pea, CAA39904; Rice, NP_001045450, NP_001055436; Human, AAF72183;
Drosophila , NP_477226; Yeast, NP_595616。
图 4 miR-cb和 RNAi-cb转基因植株的鉴定
Fig.4 Identification of miR-cb and RNAi-cb transgenic lines
A: 从抗性平板上移出的 miR-cb转基因植株(从左至右, 1~4均为转基因植株(抑制效果依次增强), 5为空载体对照); B: 移入土壤
1周后 miR-cb 转基因植株的表型(3 周); C: 从抗性平板上移出的空载体(左)和 RNAi-cb转基因植株(5 周)。
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条序列(Brassica, AAZ67608, AAZ41831)在进化上
非常接近, 暗示了它们功能上的相似性, 可能是拟
南芥和芸苔分化之前基因重复的结果(图 5)。
讨　　论
基因沉默是生物界广泛存在的一种现象, 已经
发展成为基础研究和应用研究的主流技术之一
(Zhou等2006)。siRNA和miRNA是动植物体内执
行基因沉默过程的主要分子, 由RNA外切酶切割完
全互补或不完全互补的发卡结构而产生的一类小片
段分子。RNAi技术通过导入与目的基因互补的双
链分子产生多个siRNAs, 作用于目的基因而抑制其
表达。这种技术的主要不足在于导入的分子较长,
抑制具有较高同源性的序列十分困难。同时, 导入
双链分子对于编码在同一基因座正链和负链上的基
因没有特异的抑制作用, 无法避免会产生非特异的
抑制效果。
人工microRNA技术利用内源性microRNA前
体产生 21 bp miRNA, 作用于靶序列的特定位点,
引起目的基因沉默。该技术的优势之一, 在于其作
用的特异性, 这表现在植物miRNA与mRNA序列
是完全互补或者几乎完全互补。通过改变miRNA
序列, 可以非常容易地抑制任意单个基因或者高度
同源的多个基因的表达。本研究根据AtCDKCs序
列5端同源性较高和3端序列略有差异的特点, 在
设计特异性抑制单个基因的miRNA序列时, 除了考
虑miRNA自身的序列特点之外, 还要选择两者差异
较大的区域作为候选序列。在设计共同抑制上述
基因表达的miRNA序列和RNAi的目标序列时, 需
要选择同源性较高的区域作为候选, 尽可能选择完
全相同的序列。
从双抑制AtCDKCs的实验结果来看, amiRNA
的抑制效果比RNAi更为强烈。本研究采用的双元
载体pPZPY122和pART27均为CaMV 35S启动子
控制下的过量表达体系。有研究表明, p-TEFb与
CaMV等病毒在拟南芥体内表达有着密切的联系,
抑制AtCDKCs会极大降低CaMV 35S启动子的转
录效率(Cui等 2007)。相对于 amiRNA, 在本研究
中 RNAi受到的影响更为明显一些。从miRNA和
siRNA的生物发生过程来看, RNA干扰更依赖转录
这个过程, 不仅需要RNAPII转录产生双链RNA, 而
且需要 RNA依赖的 RNA聚合酶(RNA dependent
RNA polymerase, RdRP)来放大 RNA干扰的作用。
miRNA执行基因沉默的过程主要通过RNAPII的转
录调控, 而不需要 RdRP。
基因重复是物种进化的主要动力, 也是基因功
能多样化的前提。随着基因组研究的不断深入, 多
个物种基因组测序项目相继完成, 人们发现重复基
因普遍存在于原核生物和真核生物中。大部分重
复基因会在进化过程中丢失, 只有小部分基因能被
保留下来。通过进化选择, 保留下来的基因可能被
假基因化、亚功能化和新功能化。双抑制AtCDKCs
导致致死的结果表明, 它们对于拟南芥的生长发育是
必不可少的, 推测 AtCDKC;1和 AtCDKC;2保留了
与母基因相似的功能。Cui等(2007)利用AtCDKC;1
和AtCDKC;2的启动子连接GUS系统, 检测它们在
拟南芥各个组织中的表达情况, 发现它们在花器官
中存在差异性表达, AtCDKC;1在雄蕊和花粉囊中
有高表达, 而AtCDKC;2在柱头和心皮中表达较强
烈。本研究中miR-cdkc;2转基因植株表现出开花
时间延迟, 叶片变大, 而miR-cdkc;1转基因植株几
乎没有明显的表型, 这表现出AtCDKCs功能分化的
趋势, AtCDKC;2保留了更多母基因的功能, 而
AtCDKC;1的功能有了更多的分化。AtCDKCs这
种功能部分冗余、部分分化的现象显示了重复基
因在物种进化上的演变过程。
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