全 文 ：植物生理学报
跨膜 和 离子流参与里那醇诱导旳拟南芥中抗虫防御反应
张瑞鑫 高海波 ， 闫 素丽 “ 张婷 “ ， 刘 蕾 沈应柏
北京林业大学 生物科学与技术学院 ， 林木育种 国家工程实验室 ， 北京 临沂大学生命科学学院 ， 山东临沂
摘要 ： 里那醇可诱导植物产生 防御物质从而阻止昆 虫及病原 菌的 伤害 。 本文以 拟南 芥植株为材料 ， 研究 了里 那醇对小菜蛾
取食选择性的影 响 ， 测定 了里那醇处理下小菜蛾生长量及存活率 。 釆用 非损伤微测技术分别检测 了 里那 醇熏蒸及未熏 蒸
拟南芥对 小 菜蛾 口腔分泌物及里那醇瞬 时处理的植株叶 片跨膜 和矿流的变化 。 结果表明 ， 小 菜蛾幼 虫对里 那醇 熏蒸处
理的植株选择性较差 ， 用 里那醇熏蒸后 的拟南芥植株嚷养小 菜蛾幼 虫 ， 幼 虫 的生长量及存活率均低于对照组 。 小 菜蛾 口腔
分泌物和里那醇 熏蒸处理均导致拟 南芥叶组织跨膜 和 离 子迅速外流 ， 且小菜蛾 口 腔分泌物的作 用 更大 。 而对照 中
和 离子流整体均无 明显变化 。 研究结果证明里那醇作 为防御信号参与 了拟 南齐对昆 虫的 防御反应 ， 叶组织跨膜
和 离子流变化可能是拟 南芥识别 昆 虫 口 腔分泌物与里那醇 两种不 同刺 激的初始信号 。
关键词 ： 里那醇 ； 离子流 抗 虫性 ； 小 菜蛾
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陆地植物与昆虫在地球上共存 了 亿多年 。 （ 对烟草 删： 础 的研究表明 ， 植物
在这段时期 ， 它们从生化到基 因水平协同进化 ， 互 能够区别 昆虫取食与机械损伤 ， 且昆虫 口腔分泌
利共生 。 昆虫为植物传粉 ， 植物抵御 昆虫取食 。 物能够引起比普通机械损伤更为强烈 的反应 。
根据协 同进化理论的研究 ， 一种植物被至少一种 里那醇是一种存在于 多种植物中 、 带有芬芳
以上 昆虫取食 的现象非常普遍 和 气味的单萜烯醇 ， 最先从薰衣草和马郁兰散发出
。 故植物如何抵御昆虫取食逐渐成为研究热 的混合气体中分离得到 和 。
点 。 研究表 明 ， 植物釆取多种策略避免被昆虫取 对拟南芥 的研究表明 ， 拟南
食 ， 例如形态特征的 改变和防御物质的产生 。 芥含有蔽稀 、 梓檬稀 、 月桂稀 、 罗勒稀和里那醇
通过这些特性的改变 ， 影响 昆虫取食行为 昆虫取
食选择性和取食行为等 和昆虫生长特性 生长率和 收稿 修 定
粗 资助 国家 自然科学基金 和 和高等学校博士繁殖速率等 ） （ 等 。 学科点专项科研基金 。
等 对百脉根 和 等 通讯作者 。
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等挥发物成分 等 和 示 了跨膜 和 离子流在里那醇诱导的防御反
。 里那醇与其他单萜类物质还广泛存在于真 应中的作用 。
菌 、 桧桕或刺柏属植物 、 双子叶植物及单子 叶植
物 中 ， 在花 、 树皮 、 叶片等器官 中均有分布 。 里
那醇不仅可以 吸引 昆虫授粉 ， 还可以诱导植株产 材料准备
生 防御物质抵 御 昆虫 的取食 及病原 菌 的 侵 染 拟南芥培养
等 ， 并作为植株间信号物质参与 了植 取野生型 拟南芥
物个体间 的信号传递 等 等 种子于离心管中 ， 加入适量水放置于 ° 冰箱中
。 但里那醇作为信号分子在植物防御反应中 萌发春化 。 将培养土 、 蛭石、 珍珠岩按
的作用机理还缺乏深入研究 。 的量混匀 ， 置于高压灭菌锅 中 ， 温度 为 ° 、 压
植物被 昆虫取食后 的早期信号事件包括 ： 细 力为 条件下灭菌 。 把萌发后的种子播
胞质膜 电势改变 、 胞 内 浓度改变和 产生 种在分装好的培养土中 ， 置 于拟南芥培养箱 。 培
和 。 植物细胞通过膜系统上 养条件为温度 ° 、 湿度 、 光周 期 。
的各种离子通道 、 离子载体和离子泵等实现对离 培养 周后分株移栽于大花盆中 。
子的吸收与运转 。 实验证明 ， 银杏 小菜蛾 口腔分泌物提取
通过细胞质膜电位变化和 等早期信号感知虫 在冰浴上用毛细管吸取小菜蛾
害 等 。 马铃薯 口腔分泌物后 ， 于低温高速离心机 ° 、
对周 围环境中 挥发物的感知与细胞质膜 电位和胞 条件下离心 离心后取上清液 ， 每
质 流相关 等 。 通道被证明在 进行分装 。 分装后 的 昆虫 口 腔分泌物保存在
高等植物的多种信号传递过程中起重要作用 ， 参 ° 超低温冰箱 中待用 。
与芽的形成 、 极性生长 、 气体交换调控 、 与光和 实验处理
激素调 控的生长发育等过程 。 作为第二信使 拟南芥熏蒸处理
分子 ， 参与植物抗逆、 抗病及生长发育等多种信 在容积为 的玻璃罩 中安装一只小风扇 ， 底
号转导过程 。 胞质内游离 的分布及转移是产 部扣置于毛玻璃板上 。 量取 里那醇溶解
生细胞 信号的基础 。 从胞外或胞内 “钙库” 于 酒精 ， 放置于 玻璃罩 中 ， 终浓度为
流入细胞质是通过细胞膜系统上多种类型钙通道 。 打开风扇让其完全挥发 ， 保证玻璃罩 内
活性的调控来实现 。 已经证 明蒙古沙冬青 里那醇浓度均一 。 挑选长势一致的拟南芥 株 ，
细胞经 瞬时处理后 胞 放在玻璃罩 中 ， 熏蒸处理 。
内 库中 释放和 内流是沙冬青细胞产生防 昆虫选择性实验
御反应的早期信号事件 高海波 。 转运体 实验分为 组 ， 分别剪取 片大小相 同 的 、 经
是一种在膜上以多种形式存在的转运蛋白 ， 如 里那醇熏蒸的拟南芥叶片 ， 和同样数量的未经那
逆向转运体、 酶和 逆 向转运体等 醇熏蒸的拟南芥叶片 对照 ， 交叉对称放置于同一
黄萍等 。 对细胞质膜动作电位的产生及其下 培养皿正中 为第 组 。 为排除里那醇熏蒸 的 叶片
游信号的激活 以及胞内 外各离子交换等起着至关 挥发物对小菜蛾幼虫取食行为 的影 响 ， 另 取均未
重要的作用 。 这些信号事件通过与下游的激酶及 熏蒸的不 同对照植株叶片交叉对称放置于 另一培
植物激素信号相互作用 ， 调节相应防御基因 的表 养皿正中 为第 组 。 每组 个重复 ， 进行小菜蛾取
达 最终导致植物产生防御反应 等 。 食选择性试验 。
非损伤微测技术 具体方法为在直径为 的培养皿 中放 片
是一种可以无损伤实时监测跨膜离子 滤纸 ， 用水将滤纸湿润 。 将各组拟南芥叶片展平
浓度 、 流速等信息的生物活体检测技术 。 本实验 放置于滤纸上 。 每个培养皿正 中放 条小菜蛾幼
利用该项技术活体监测了里那醇熏蒸和 昆虫 口腔 虫 ， 放置于培养箱中 ， 观察每个叶片上聚集的小菜
分泌物处理后 ， 拟南芥叶片 和 流的变化 ， 揭 蛾数量 。
张瑞鑫等 跨膜 和 离子流参与里那醇诱导的拟南芥中抗虫防 御反应
昆虫生长量 、 取食量与存活率测定 数据分析
小菜蛾卵购于河南省济源 白云实业有限公司 。 数据用美国扬格公司与旭 月 北京 科技有限
把虫卵放在洗净瞭干后的新鲜结球甘蓝 公司 联合开发设计的数据分析软件 进行
叶片上 ， 放置于昆虫培 换算 ， 然后用 软件的积分工具进行整合
养箱中 ± ° 、 湿度 、 光周期 孵 离子流的计算及统计分析 。 并计算瞬时处理前后
化 、 培养 。 分别选取里那醇熏蒸后与未熏蒸 对照 ） 整合离子流差值 ， 用 以 反映处理前后整体离子流
的拟南芥各 棵 ， 每棵植株放 只刚孵化的幼虫 ， 饲 量变化 。
养 。 分别称量拟南芥饲养前后 、 共 只幼虫的
体重 ， 取平均值 在坐标纸上量取幼虫长度 取平均 头 如
值 ； 统计饲养前后小菜蛾幼虫数量 计算成活率 。 里那醇熏蒸对小菜蛾取食选择性 、 生长量 、 取
离子流测定 食量与存活率的影响
用非损伤微测技术 美 国杨格公 司 测定 将未经任何处理的 对照拟南芥叶片分成 组
和 离子流 。 在经过硅烷化处理 、 尖端直径 进行小菜蛾取食选择实验 ， 发现小菜蛾选择率无
的玻璃微 电极 旭 月科技有 限公司 ， 北京 尖端 明显差异 。 用里那醇熏蒸 与对照拟南芥叶 片
灌入约 的相应离子的灌充液 进行选择实验 ， 发现 的小菜蛾选择取食未经里
那醇熏蒸处理的拟南芥植株 ， 仅有 的小菜蛾选
然后利用 离子选择微 电极制作装置在 电 择取食里那醇熏蒸处理的植株 图 。 小菜蛾幼虫
极尖端灌入相应离子的选择交换剂 更偏 向取食未经里那醇熏蒸处理的拟南芥植株 。
制作好 的 电极用 氯化的
电极固 定架与前置放大器连接。 测定前 ■ 对照 □里那醇
先校正电极 。 校正液为 ： 和
校正液为 ： 和 的蒸馆水 用 容
— 和 — 的 调节 。 测试液成分
均为 ： 、 、
。 吣里那麵 叫乙醇溶解
后 ， 用 测试液稀释为 ； 备用 。
植物 叶组织赚带固定于塑料培养皿 中 直
径 生友生物技术公 司 。 加入 测试液 一
平衡 后测定 。 把固好植物材料 的培养皿放 图 〗 小菜蛾对不 同处理翻芥的取食选择
入非损伤微测系统固 定平 台 ， 调节 电极与叶 肉 细
胞之间 的距离 为 采集频率 。 取
小菜蛾 口腔分泌物稀释成 备用 。 首先进行
叶 肉细 胞 背景电位测量 ， 然后分别进行不 同 用 各处理拟南芥叶片 饲养小菜蛾 后发现 ，
处理后 ， 继续测定 。 对照组处理为 ： 加入空 对照拟南芥饲养的 小菜蛾幼虫身长和体重 的增长
白 测试液 ； 里那醇处理组为 ： 加入 率 、 存活率分别为 、 和 而用里
— 里那醇 ， 使测试液中里那醇终浓度为 那醇熏蒸处理 的拟南芥饲养 的小菜蛾幼虫各指标
昆虫 口腔分泌物处理为 ： 加入 稀 依次为 、 和 图 。 对照组拟南
释备用 的 小菜蛾 口腔分泌物 ； 乙醇对照组为 ： 加入 芥饲养的小菜蛾幼虫各指标显著高于里那醇处理
乙醇测试液 ； 里那醇熏蒸组为 ： 加入小菜蛾 口腔分 组 ， 差异达到显著水平 。
泌物 。 除里那醇熏蒸组以里那醇熏蒸处理后 的拟 里那 醇与 小菜蛾 口 腔分泌物对拟南芥叶组织
南 芥叶 肉 为样 品 ， 其余均 以未经熏蒸 的野生型拟 流的影响
南芥叶 肉 细胞为样品 。 在测试液中加入小菜蛾 口腔分泌物 ， 导致拟
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里那醇 对照 里那醇 对照 里那醇 对照
图 小菜蛾取食里那醇熏蒸植株后的变化
南芥叶组织跨膜 流瞬时急剧外流 ， 且流速持续 整合离子流也有类似规律 图 昆虫 口腔分
升高 图 。 里那醇熏蒸 之后 的拟南芥叶组织 泌物处理的 外流量最大 ， 里那醇熏蒸的 夕卜
跨膜 也有一个迅速流外流的过程 ， 但外流速度 流量次之 里那醇熏蒸 后再加入昆虫 口 腔分泌
较 昆虫 口腔分泌物处理 的低 。 而里那醇熏蒸 物处理组 外流量仅高于对照组 ， 对照组和 乙醇
之后 ， 在测试液中 加入 昆虫 口腔分泌物瞬时处理 测试液组 外流量最小 。
只 引 发 轻微外流 。 对照和加入乙醇测试液 的
流抝没有 显荖夺仆 ■ 网 。 □ 对照 里那醇侃 业者文 叫知 □ 昆虫 口腔分泌物 里那醇熏蒸
關 乙醇
「
一 — 对照 —— 里那醇 °
“
昆虫 口 腔分泌物 里那醇熏蒸 土
、 — 乙醇
“
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— 图 不同 处理对拟南芥叶片 流量的影响
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时间
图 不 同处理对拟南芥叶组织 流速 的影响 里那醇与 昆虫 口 腔分泌物对拟南芥叶肉 细胞
流的影响
正常生理条件下 拟南芥叶组织跨膜 流表箭头指示不同处理试剂加 入时间 。 在所有离子流测量的实验
、… ，十 、 一二 、 。二 、 ，
中 ， 离子 内流为负值 ， 外流为正值 。 对照 在未熏難南芥叶片中 现为 内流 。 对照和加入乙醇测试液的 为稳定
加入空 白测试液 。 丨七 里那醇 在 未熏蒸拟南芥叶片 中加入 内 流 （ 图 。 其它处理都导致 离子 内流速度下
。 丨 里那醇 ’ 终 浓度为 昆虫 口腔分泌物 在未 降 ， 这可能是各种处理引起 离子不 同程度外流 ’熏蒸拟南芥叶片 中加入 小菜蛾 口腔分泌物 ； 里那醇熏蒸 ：在里那醇 山 、’上 《 仏
熏蒸 的拟南芥叶片中 加入小繼 口腔分泌物 乙醇 在未熏蒸 但外 汝 速度没有 内 闻 ， 总体上表现 出 离子 内
拟南芥 叶片中加入 乙醇测试液 。 下 图同此 流下降 。 里那醇熏蒸 后 ， 加入 昆虫 口 腔分泌
张瑞鑫等 跨膜 和 离子流参与里那醇诱导的拟南芥中抗虫防御反应
物 ， 诱导 瞬时快速外流 ， 后外流减少 ， 内流快 讨 论
速增加 ， 很快达到对照水平 。 在测试液 中加入 口
腔分泌物 ， 表现为短时间的外流增加 ， 总体表现 ，化 ， 与环境 ；
为 内 流减少 。 与加■如赚灘处麵狐 ， 植物 」》之 丨 关 系中扮
里那醇熏蒸 后 ， 也导致 离子短暂外流 ，胁 演 重要的 角色 丨 和
龍 为 内 流略高 图 。 从『离子整体变化来看 ，
里那醇及 昆虫 口 腔分泌物均能引起 外流 ， 昆虫 ：
口腔分泌物与里那醇熏蒸共 同处理侧最明显 。 』
从整合离子流来看 图 种处理均麵为『 来头现諭的直接或间接 防御供 也等‘
。 里那醇作为 植物花器官产生 的挥发性物
质 ， 具有吸 引 昆虫传粉 的作用 。 但作为 植物体外
‘ 种信号物质具是否具有诱导植物抗虫 的作用 ，
肖未通道 。 本实验細 ， 卿醇舰 影响 昆虫
对植物本身 取食的选择 ， “驱逐 ”昆虫 ， 从而达到保
「 —— 对照 一° 里那醉
昆虫 口 腔分泌物 里那 醇熏蒸 护 自 身 良好生长的 目 的 。 另 外 ， 里那 醇还通过降
、 低 昆虫的 生长速度 、 提高昆虫死亡率和抑制 昆虫
体积和体重增长等方式 ， 抑制天敌生长 ， 间接减少
昆虫对植株本身 的损害 。 里那醇的确可 以作为 一
种 昆虫侵害后的防御诱导物质 ， 参与拟 南芥对 小
菜蛾虫害的防御反应 。
外 植物识别并响应昆虫伤害 的能力构成 了植物
一 的免疫系统 。 不 同于其它高等生物特异适应性 免
疫系统 ， 植物对 昆虫的免疫依赖于植物细胞先天
息
■
■ ■ ■ 霞 ■ 多
的感知“危险”信号的 能力 ， 植物传递危险信号并能
够减弱下次伤害 和 。 作为
图 不 同处理对拟南芥叶组织 流速 的影响 细 胞 内 的第 二信使稳定地存在于植物细 胞 内 ， 可
以传 递植物感受到 的外界刺激 ， 并引 起下游信号
过程 的 响应 ， 胞 内 游离钙离子的增 加是植物防御
反应 的早期关键信号 等 。 本实验
口腔分泌物
里騎 中 在受到 昆虫 口 腔分泌物和里那醇刺激后均
， 表现 出 短暂迅速 内流 ， 传递给下游信号系统 以后
外流 ， 使细胞 内外 浓度趋于正常水平 ， 从而保■ 证细胞正常 的生命活性 。 而经过里那醇提前预处■ 雜卿抚 日月 觀糊 ’ 藤 予员讀■ ■ 后引起植物 响应胁迫信号 ’ 已启动 植物体 内 防御咖 ■ 論 反应 ’ 因此当再次受到 昆虫 口 腔分泌物刺 激后无■ 明显变化 。參 毫 是质膜上多重离子交换通道的 离子交换■ 质 ， 对维持质膜内 正外负 的膜 电位起至关 紧要的
图 不 同处理对拟南芥叶娜 流量的影响 作用 。 叶霉菌 腫 —能够增强质膜
活 卜 ， 依赖于 蛋 丨勺 导与质 丨 结 蛋
曰 的 去憐酸化 為 。 本文实验结果说明 ，
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昆虫 口 腔分泌物能触发拟南芥叶片细胞产生 持
续外流 ， 可能对细胞质膜系统上 多种离子通道和
、 — 、 、 、 丄离子栗 的活性产生影响 ， 从而启动下游相关彳目 号
系统 。 然而经过里那醇预处理植株发生了更为迅 。 。 。
速的 外流和恢复 ， 使 内 外质子浓度差迅速恢复 ，
正常 ， 最终 内 外 流量接近平衡
：
细胞质膜■
极化与超极化均能激活 离子通道向胞内 转运
通过 逆 向转运体或 向胞 。 ，
夕 卜转运 产生细胞 内 外 浓度差 ， 启动 信
、 ，号途径 和 ， 触发下游 的
，
防御反应 。 本实 验中 ， 昆虫 口 腔分泌物剌激和里 ，
醇熏蒸后数秒钟 ， 与 流就发生 了迅速变
化 ， 两种朿 激方式 和 流反应不同 。 与
流 的快速响应证明跨质膜 与 流是拟南芥识
别里那醇刺激和启动抗虫防御反应的初始信号 。
参考文献
髙海波 沙冬青细胞对 处理的初始生理响应 林业科 、 ，
、 ，学 ， 、
士 人 碰》 从 、 泣 二黄萍 ， 张 富春 ， 王瑜 ， 李金耀 跨膜离子转 蛋 白与植物耐盐 二
■上 、 …的分子生物学 生物技木通报 ，
‘ ” … ▲
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