全 文 ：分子植物育种，2013年，第11卷，第3期，第365-370页
MolecularPlantBreeding,2013,Vol.11,No.3,365-370
研究报告
ResearchReport
‘阿蒂擎天’凤梨谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆与乙烯诱导表达特性
的初步分析
丛汉卿 1,2信彩云 3 张银东 1 李志英 2,3徐立 2*
1海南大学农学院,海口,570228;2中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,农业部热带作物种质资源利用重点开放实验室,儋州,
571737;3山东省花生研究所,青岛,266100
*通讯作者,xllzy@263.net
摘 要 以阿蒂擎天凤梨乙烯处理和不处理的植株为材料建立的抑制性差减杂交文库中，筛选到的一个被
乙烯诱导并与已知植物谷胱甘肽-S-转移酶(GST)同源的cDNA片段，通过RACE技术得到该基因的全长
cDNA序列。序列分析表明，该基因可能属于thioredoxin-likesuperfamily和GSTC_familysuperfamily两个
超家族中的成员。利用半定量RT-PCR检测该基因的表达量在乙烯处理后先会在1h显著升高，然后随时间
逐步降低，说明乙烯作为一种逆境胁迫相关激素，可在短时间内诱导凤梨中GST的表达。推测其在受到外源
乙烯信号诱导后，一方面可能参与了植物体内的解毒作用，另一方面可能参与了花青素的合成调控和运输。
本实验中的GST作为观赏凤梨中一个新发现的GSTs家族成员，对于研究热带花卉中GSTs家族的特点和
提高其抗逆性和品质具有重要的理论意义和实用价值。
关键词 谷胱甘肽-S-转移酶,阿蒂擎天凤梨,乙烯,表达分析
CloningofGlutathione-s-transferaseGeneandPrimaryExpressionAnalysis
inGuzmania wittmackii‘Attila’InducedbyEthylene
CongHanqing1,2XinCaiyun3 ZhangYindong1 LiZhiying2,3XuLi2*
1 Bioscience and Agriculture College, Hainan University, Haikou, 570228; 2 Institute of Tropical Crop Genetic Resources, Chinese Academy of
Tropical Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Danzhou, 571737; 3
ShandongPeanutResearchInstitute,Qingdao,266100
*Correspondingauthor,xllzy@263.net
DOI:10.3969/mpb.011.000365
Abstract AnethyleneinduciblecDNAfragmentbeinghomologywiththeknownglutathione-s-transferase(GST)
inplantswasscreenedinthesuppressionsubtractivehybridization(SSH)libraryconstructedwiththematerialsof
Guzmania wittmackii‘Attila’p nttreatedanduntreatedbyethylene.RapidAmplificationofcDNAEnds(RACE)
wasusedtoobtainthefulllengthcDNA.Sequenceanalysissuggestedthatthegeneshouldbelongtothioredoxin-
likesuperfamilyandGSTC_familysuperfamily.Semi-quantitativeRT-PCRresultsexhibitedthat the expre ssion
ofthisgene significantlyincreased with the treatment ofethylene in one hour, and then decreased graduallywith
time,whichsuggestedthattheethyleneasanadversitystress-relatedhormonecould induce GST gene expression
in a short time. We hypothesized that GST, on the one hand, might be involved in detoxification in vivo, on the
otherhand,mightbeinvolvedinregulationandtransportofanthocyaninafterethyleneinduction.Inourresearch,
thisGSTasonenewmemberofGSTsfamilyinbromeliads,hastheessentialtheoreticalsignificanceandapplied
valuetostudyGSTsfamilycharacteristicsandimprovestressresistanceandqualitymodificationintropicalflowers.
Keywords Glutathione-s-transferase,Guzmaniaattila,Ethylene,Expressionanalysis
收稿日期：2012-10-12 接受日期：2012-11-29 网络出版日期：2013-03-15
URL:http://5th.sophiapublisher.com/abstract-1488-mp opa
基金项目：本研究由海南省自然科学基金(808191)及博士启动基金(PZSb0806,PZSb0604)资助
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
谷胱甘肽 -S- 转移酶(glutathione-S-transferase,
GSTs)广泛存在于植物体中，是一个二聚体蛋白酶的
超家族，主要起催化三肽的还原型谷胱甘肽和各种
亲电化合物的亲电取代反应的作用(Armstrong,1997)，
然后通过选择性ABC转运蛋白将结合有谷胱甘肽
的产物运输到液泡内，达到植物体内的去毒效果(伍
忠銮等, 2004)。多种外界信号可诱导刺激GSTs的
合成，如氧化胁迫、机械损伤、高温、除草剂等外界逆
境(Fluryetal.,1995)。同时植物体内GSTs的合成还
能受细胞分裂素、生长素、乙烯等植物激素的影响
(廖祥儒等, 1996,生命的化学, 16(6): 22-24; Marrs,
1996)。GSTs主要具有三方面的功能：(1)催化各种谷
胱甘肽(GSH)依赖的生物转化反应；(2)催化类似于异
源产物的自然产物的结合反应；(3)在细胞间结合和
运输植物化合物(Edwardsetal.,2000)。
乙烯(ethylene)是植物组织或细胞中合成的一种
重要的植物激素，分子结构为H2C=CH2，因其能够微
溶于水，故可通过溶解于水或气体扩散形式在植物
体内运输。乙烯广泛参与了调控植物的生长和发育
过程，如：根叶茎花的发育、种子的萌发、偏上生长、
器官衰老与脱落、果实成熟以及对环境胁迫的反应
等。实验发现，受乙烯调控的启动元件广泛存在于伤
害诱导的防御反应蛋白以及能促进器官衰老和脱
落、调控果实后熟的多种酶的基因上(Bleeckerand
Kende, 2000)。阿蒂擎天(Attila)属凤梨科(Bromeli-
aceae)果子蔓属(Guzmania)植物，是常见的观赏凤梨，
因生长缓慢，营养生长期长，为适应市场需求，利用
乙烯及其衍生物进行人工诱导开花，已经成为凤梨
科植物栽培中普遍采用的方法(Bernieretal.,1993)。
实验证明使用乙烯利对凤梨科植物进行灌心处理，
能够使其提前开花，花期也呈现一致性(梁东成和黄
万和,2005)。
前期工作中，课题组曾以阿蒂擎天凤梨乙烯处
理后植株和未处理的植株为实验组和对照，构建了
抑制差减杂交(SSH)文库(信彩云等,2010)。本研究从
文库中筛选到了一个编号为A263长度为264bp的
GST基因片段，旨在对其进行克隆和分析乙烯处理
后的表达变化，并初步探索乙烯信号与谷胱甘肽-S-
转移酶表达变化之间的关系，为更深入地研究GST
如何在凤梨植物开花过程中发挥作用奠定了基础。
1结果与分析
1.1谷胱甘肽-S-转移酶基因的获取
本研究提取的乙烯处理后0、1h、6h和24h的
样品总RNA，经核酸蛋白仪检测，其A260/280在
1.8~2.0之间；用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，结
果显示总RNA的完整性较好(图1)，能够满足后续
实验的需要。
以 SSH文库筛选的序列 A263为基础，通过
RACE延伸在400bp处获得与5端片段预测大小相
符的条带(图2A)，500bp处获得与3端片段预测大
小相符的条带(图2B)，回收产物后连接转化测序。经
序列拼接，得到长度为945bp的序列。
1.2谷胱甘肽-S-转移酶基因序列分析
通过RACE结果拼接获得基因全长为945 bp，
编码215个氨基酸，分别通过NCBI的BLASTn和
BLASTp同源性比对，分析表明该序列与其它物种
的谷胱甘肽-S-转移酶基因有较高的同源性，因此
推断该cDNA序列为编码阿蒂擎天谷胱甘肽-S-转
移酶的全长cDNA序列。其氨基酸序列与玉米、小麦
的谷胱甘肽 -S- 转移酶的同源性比对如图3。用
ProtParam预测其蛋白分子量是24134.8Da，理论等
电点PI为6.08。亲水/疏水性分析显示此蛋白可能
存在三个疏水区，三维结构预测显示此蛋白有一个
用红色标示的活性部位(图4)。同时亚细胞定位显
示，此GST最有可能存在于细胞质中。
1.3乙烯诱导谷胱甘肽-S-转移酶表达水平变化
半定量RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测
图2谷胱甘肽-S-转移酶基因(A263)克隆
注:A:5RACE;B:3RACE
Figure2AgarosegelelectrophoresisofGST(A263)RACE
Note:A:5RACE;B:3RACE
366
图3GST(A263)与玉米和小麦GST基因氨基酸编码同源性比较
注:Os:水稻;Zm:玉米;Ta:小麦
Figure3ThecomparisonofA263withtheGSTaminoacidsequencesamongrice,cornandwheat
Note:Os:Oryza sativa;Zm:Zea mays;Ta:Triticum aestivum
显示出表达水平的变化(图5A)。为更直观反映表达
差异，本研究利用ImageJ软件结合电泳条带面积，算
出其平均灰度值，并最终转化为总光密度(OD)；使用
内参Actin总光密度值对GST的相关数值进行归一
和量化，结果表明谷胱甘肽-S-转移酶基因在0h的
材料中略低，而在1h的处理材料中升高，然后逐渐
降低(图5B)。
2讨论
张鲲等(2011)证实在乙烯利处理蜻蜓凤梨1h
后，AfMKK1基因表达量就开始出现升高，然后持续
处于高表达水平。本实验中，GST表达量1h后即开
始增加，印证了凤梨如同其它多种植物一样，乙烯可
刺激其GST的生成，同时从侧面说明了乙烯信号的
传递的速度是十分迅速的。
植物中GSTs的表达可受多种逆境胁迫相关激
素的影响，如脱落酸(ABA)、乙烯(ET)、水杨酸(SA)
和茉莉酸(JA)等(Zhouand Goldsbrough, 1993; Dixon
etal.,1998;Wagneretal.,2002;Tsuchiyaetal.,2004)。
植物在受到这类激素处理后会加强细胞内活性氧
物质(ROS)的产生和积累。乙烯作为一种植物激素，
能够引起植物对环境胁迫的反应，可受乙烯信号调
控的启动元件存在于多种可受伤害诱导的防御反
图5GST(谷胱甘肽-S-转移酶)半定量PCR检测结果(A),GST
的光密度比值结果(B)
Figure5TheresultofGSTsemi-quantityRT-PCR(A)andRatio
oflightdensityofGST(B)
‘阿蒂擎天’凤梨谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆与乙烯诱导表达特性的初步分析
CloningofGlutathione-s-transferaseGeneGuzmania wittmackii‘Attil’InducedbyEthylene367
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
应蛋白基因上(BleeckerandKende,2000)。根据“诱导
愈伤反应的假说”：一般植物在遇到不良环境或受到
伤害时，便会增加体内乙烯，这种乙烯被称为创伤乙
烯或应激诱导乙烯，它作为动员贮备物质的化学信
号向周围组织传递，引起愈伤反应。本实验中筛选到
的编码谷胱甘肽-S-转移酶，其功能可能是解除外
源底物的毒性所必需的(Muelleretal.,2000)。
GSTs家族成员除了具有催化活性外，还可以作
为转运蛋白使用(Sheehanetal.,2001)，已经有实验揭
示拟南芥中GSTs成员At5g17200(AtGSTF12;或称
TRANSPARENT TESTA19)是向液泡中转运花青素
所需要的，谷胱甘肽-S-交联结合泵式结合ATP的
运输转运器，通过输水基间的交互作用结合花青
素苷，然后运送到液泡膜上(Kitamura et al., 2004;
Grotewold,2004)。此外欧芹细胞培养物的研究数据
表明，谷胱甘肽-S-转移酶基因在UV诱导花青素
合成关键基因CHS表达的早期信号传导中是必需
的(Loyalletal.,2000)。在观赏凤梨在栽培中发现植
株在开花前叶杯基部有变红的迹象，说明乙烯在诱
导凤梨开花的可能同时促进花青素的合成，而且在
SSH文库中筛选到谷胱甘肽-S-转移酶基因，有可
能参与了这些花青素的合成。另有研究发现，一种
GSTs基因At1g78730(AtGSTU20)能够与光受体Far-
RedInsensitive219(FIN219)发生互作，从而对光信号
产生响应并在细胞延长和植株发育过程起到重要的
信号传导作用(Chenetal.,2007)。
综上所述，可以推测出在凤梨用乙烯利灌心处
理后，外源乙烯进入到凤梨体内，生成大量的内源
乙烯，产生人为诱导的愈伤反应，随后，GST作为多
种植物体内的主要解毒系统，同时诱导了具有抗氧
化作用的花青素的生成，共同参加了植物体的这种
抗逆反应机制。当然其详细过程，还需要进一步的
深入探索。
本研究所获得的阿蒂擎天凤梨的GST基因，经
生物信息学分析，可以认定为在凤梨科植物中新克
隆到的一个谷胱甘肽-S-转移酶家族成员，并明显
受乙烯信号影响。但其在乙烯处理后凤梨植株的一
系列反应变化中具体发挥什么作用还不清楚。GSTs
类基因在多种模式植物上研究得已经比较深入，但
在热带花卉中，几乎无人涉足，在观赏凤梨中对
GSTs基因的深入研究，对提高热带花卉的抗逆和品
质具有重要价值，而且其功能在热带植物与多数模
式植物是否有不同之处，也值得进一步探索。
3材料与方法
3.1材料
阿蒂擎天凤梨(Guzmania wittmackii‘Attila’)，来
自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所的
实验基地大棚。挑选生长良好、发育成熟、大小一致
的植株(具有20片叶龄以上)，用400ppm的乙烯利
10mL对植株叶心位置进行灌心处理；实验对照采
用以清水灌心植株。本研究剥取对照植株和乙烯利
分别处理1h、6h、24h后的植株心叶(分别命名为0,
1h,6h,24h)，液氮冷冻后-80℃保存。
3.2总 RNA的提取及 cDNA第一链的合成
总RNA的提取使用CTAB法，使用 DNaseⅠ
(Takara)去除RNA中残留DNA，cDNA第一链合成使
用SuperScriptTMⅢReverseTranscriptase(Invitrogen)，
步骤按说明书操作。
3.3 5RACE和 3RACE
以总RNA为材料，利用SMARTTMPCRcDNA
AmplificationKit(Clontech)合成5RACE和3RACE
的模板，按试剂盒操作说明书扩增基因的5和3端
序列。PCR扩增产物使用1%的琼脂糖凝胶电泳检
测，特异扩增条带经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒
(Tiangen)回收纯化后克隆到PMD-18T克隆载体(Ta-
kara)上，进行测序。用Primerpremier5.0软件设计GST
基因5RACE和3RACE的各两对巢式引物如下：
3RACE外侧引物：5-GTAGCCTCAAGGAGT-
CGGCGATGGT-3；3RACE内侧引物：5-TACAAC-
CCTGTGGTCTCCCCCATCATCT-3；5RACE外侧
引物：5-CTGGTCACAGACACCCCCGAAGAAC-3；
5RACE内侧引物：5-ATCGCCGACTCCTTGAGG-
CTACTATC-3。
3.4基因序列分析
使用ORFFinder在线工具(http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/gorf/orfig.cgi/)预测此基因的阅读框架，使用
BLAST工具对预测的氨基酸序列进行比对分析，用
DNAMAN软件进行氨基酸序列拼接及比对，用Por-
tParam (http://www.expasy.org/tools/protparam.html/)
预测其蛋白分子量和等电点，用PortScaleSever在线
工具(http://www.expasy.org/tools/protscale.html/)进行
疏水性 /亲水性预测，用 WoLF PSORT在线工具
(http://wolfpsort.seq.cbrc.jp/)进行亚细胞定位预测，用
368
SWISS-MODEL在线工具(http://swissmodel.expasy.
org/)进行三维预测，三维模型的查看软件为 RA-
STOP1.3.1。
3.5半定量 RT-PCR
利用半定量RT-PCR检测部分基因在植株中的
表达情况，以对照和不同处理阶段为材料，所有的
RT-PCR反应均来自同一批反转录的cDNA产物且
重复3次，actin为内参，PCR扩增产物使用1%的琼
脂糖凝胶电泳检测。所用GST基因及actin的引物为
Primerpremier5.0软件设计，序列如下：GST正向引
物：5-CGACCTTCTGGTCACAGACA-3；GST反向
引物：5-AAGCACAAGTCGGACCTCTT-3；actin正
向引物：5-CATGAAGATCAAGGTCGTCG-3；actin
反向引物：5-ACTTCCGGTGAACAATGGAC-3。
作者贡献
丛汉卿和信彩云是本研究的实验设计和实验研
究的执行人；丛汉卿完成数据分析，论文初稿的写
作；徐立负责本研究的实验设计；张银东和李志英参
与实验设计；李志英是项目的构思者及负责人，指导
实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都
阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由海南省自然科学基金(808191)及博士
启动基金(PZSb0806,PZSb0604)共同资助。
参考文献
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