全 文 ：第 36 卷　第 9 期 西北农林科技大学学报(自然科学版) Vol.36 No.9
2008 年 9 月 Journal of No rthwest A&F Univer sity(Na t.Sci.Ed.) Sep.2008
拟南芥 AVP2基因转化烟草中吸钾
相关基因的转录分析＊
郭兆奎1 ,杨　谦1 ,颜培强2 ,万秀清2
(1 哈尔滨工业大学生命科学与工程系 ,黑龙江哈尔滨 150001;2黑龙江省烟草科学研究所 ,黑龙江牡丹江 157011)
[ 摘　要] 　【目的】了解无机焦磷酸酶对植物钾吸收和相关基因表达的作用。【方法】反转录克隆拟南芥无机焦
磷酸酶基因(H +-PPase)AVP2 ,构建植物表达载体 , 采用根癌农杆菌介导法将其导入烟草品种 K326 , 经分子鉴定 , 提
取转化烟苗幼根 RNA ,反转录后 , 应用荧光定量 PC R分析外源基因 A VP2 和烟草钾通道基因 NK T1 、钾离子转运体
基因 N tH AK1 、细胞质膜 H +-ATPase基因 N HA1 、液泡膜 H +-ATPase基因 V AG1 和液泡膜 H +-PPase基因 N VP1
的 mRNA 转录水平 ,并测定转化烟草叶片的内在化学成分。【结果】获得了 GUS 染色和 AVP2 序列 PCR 扩增呈阳
性的卡那霉素抗性转化烟草 11 株。经 Southern杂交鉴定 , 证实 AVP2 基因已成功导入烟草 , 在转化烟草幼根中可以
检测到外源基因 A VP2 的 mRNA ,证实该基因已整合到烟草基因组并成功表达;与未转化烟草相比 , 烟草钾离子转运
体基因 N tH AK1 的转录水平显著增加 , 钾通道基因 NK T1 的转录稍有增加 ,而烟草液泡膜 H +-ATPase 基因 VAG1
和液泡膜 H +-PPase 基因 NVP1 的转录有所降低 ,烟草细胞质膜 H +-ATPase基因 N HA1 无显著变化;转化烟草材
料烟叶K +含量较对照显著增加 ,而烟碱 、还原糖等其他内在化学成分无显著变化。【结论】无机焦磷酸酶基因参与植
物的 K+吸收。
[ 关键词] 　拟南芥 AVP2;转基因烟草;吸 K+基因;转录
[ 中图分类号] 　Q78 [ 文献标识码] 　A [ 文章编号] 　1671-9387(2008)09-0058-07
Transcript analysis of K
+
uptake relat ive genes
in AVP2 transgenic tobacco
GUO Zhao-kui1 ,YANG Qian1 ,YAN Pei-qiang2 ,WAN Xiu-qing2
(1 Li f e S ciences &Eng ineering Dept , H arbin Insti tute o f Technolog y , Harbin , Hei long j ian g 150001 , Ch ina;
2 H ei long j iang Tobacco Research Inst i tute ,Mudanj iang , Hei lon g j iang 157011 , Ch ina)
Abstract:【Objective】N utrition uptake has clo se relations w ith energy supply in plant cell.The studly
investig ated the effects of H+-py rophosphatase on the expression o f plant potassium uptake related genes.
【Method】The vacuolar H +-py ropho sphatase(V-H+-PPase)gene AVP2 which w as amplified f rom Arabi-
dopsis thaliana by RT-PCR was inserted into the plant binary expression vector containing int ron kanamy-
cin gene and SAR sequence from tobacco and int roduced into tobacco variety K326 by Agro-bacte rium me-
diated t ransfo rmation.Total RNA was isolated f rom the roo ts of AVP2 trans-fo rmants and no rmal tobacco
wi thout genetic modification.The transcript of six g enes including tobacco K + t ranspo rter g ene NtH AK1 ,
K+ channel gene NK T1 , plasma H+-A TPase gene NH A1 , vacuole H +-A TPase gene VAG1 , vacuole H +-
PPase gene N VP 1 w ere analyzed using real-time PCR.【Result】Eleven AVP2 transgenic tobacco plants
＊[收稿日期] 　2007-09-26
[基金项目] 　国家烟草专卖局科技攻关项目(110200101008)
[作者简介] 　郭兆奎(1964-),男 , 黑龙江鸡东县人 ,研究员 ,博士 ,主要从事烟草分子生物学研究。
E-mail:guozh aokui@yahoo.com.cn
DOI :10.13207/j.cnki.jnwafu.2008.09.014
were obtained and approved GUS dye and AVP2 sequence PCR test.The mRNA of AVP2 w ere detected in
the trans-fo rmant plant roots w hich confirmed that AVP 2 have been transcript and expressed effect ively in
the modified tobacco.The results show ed that the transcript of K + t ranspor ter gene N tHAK 1 and po tassi-
um channel NK T1 w ere significant ly stimulated , and that of vacuolar V-H+-A TPase G unit gene VAG1
and V-H +-PPase genes N VP1 w ere down-regulat ion.There w as no significant alteration can be found in
the transcript of plasma proton pumping (P-H+-A TPase)gene NH A1.It w as found tha t the po tassium
contents increased significant ly and there were no changes in nico tine , sugar and o ther chemical contents in
the leaves of AVP 2 transgenic tobacco T1 generation.【Conclusion】The results indicate that AVP2 which
encoded the vacuo lar H
+-py ropho sphatase have effects on the po tassium uptake in plant.
Key words:AVP2;transgenic tobacco;K + uptake;t ranscript
　　钾是植物生长必需的大量元素 ,K +对细胞内多
种酶的活性 、渗透势和电势平衡等起着重要作用。
由于钾矿是不可再生资源 ,在保证作物正常生长发
育前提下 ,通过增强根系吸钾能力来降低钾肥的施
用量 ,对于环境保护和农业的可持续发展具有重要
意义 。根系从土壤中吸收 K+是由多个基因家族控
制的 , 现已分离鉴定了 K +通道 、HK T 、KUP/
HAK/K T 和 N a(K)-H +反向转运体基因 。Sze
等[ 1]研究发现 ,植物离子吸收 、运输与细胞质膜和液
泡膜质子泵 H +-ATPase 和 H+-PPase 的能量供应
有关 。Na+/H+反向转运体 、Ca2+/H +反向转运体
是由液泡膜上的 V-A TPase 和 V-PPase 产生的跨
膜质子电化学梯度驱动进行离子运输。 Briskin
等[ 2]报道 ,细胞质膜 P-H +-A TPase与 H +/K +交换
有关 ,主要参与植物细胞的钾离子吸收。 Ramirez
等[ 3]研究发现 ,酵母细胞质膜 H +-AT Pase 基因缺
陷型 K +通道的开关特性与细胞内的 AT P 密切相
关。Briskin等[ 4] 证实 ,细胞钾通道和 K +转运体对
K
+的吸收与细胞质膜 H+-A TPase 的能量供应有
直接关系 ,细胞质膜 H +-AT Pase通过 H +梯度变化
运送 Ca2+来激发 K 通道。Apse 等[ 5] 发现 ,过量表
达 AtN HX 1 的拟南芥转化材料耐盐性显著提高 ,
其耐盐性与 A tN HX 1基因的转录 、液泡 H+离子泵
活性直接相关。 Reinhold 等[ 6] 报道 , H +-AT Pase
活性的变化可以引起细胞内糖分和离子浓度的改
变。Maeshima[ 7] 发现 ,拟南芥 H +转运无机焦磷酸
酶(H+-PPase)是单亚基蛋白 ,位于植物细胞液泡膜
上 ,形成跨膜的电化学梯度 ,促进 H +从胞质向液泡
的转运[ 8] 及 K +在液泡中的积累[ 9] 。盐分处理 Dau-
cus carota [ 10] 和 Acer pseudoplatanus[ 11] 可以提高液
泡中 V-H +-PPase 活性 ,表明 V-H+-PPase 与细胞
中的离子代谢有关 , H+-PPase 基因仅存在高等植
物(N icot iana tabacum[ 12] 和 Hordeum vulgare[ 13]
等)和藻类的液泡膜上。Yolanda 等[ 14] 将无机焦磷
酸酶分为对 K+敏感的 AVP1型和对 K +不敏感的
AVP2型;Gaxio la等[ 1 5] 在拟南芥上过量表达 AVP1
发现 ,液泡膜跨膜电化学势增强 ,液泡中无机离子
Na+和 K+浓度增加 ,对盐分的耐性提高 ,但对于无
机焦磷酸酶转化材料中钾吸收相关基因的转录与表
达的影响还未见研究报道。本研究报道了拟南芥
AVP2基因的克隆 、植物双元载体构建及在转化烟
草幼根中各基因的转录水平分析 ,以了解无机焦磷
酸酶对植物钾吸收和相关基因表达的作用。
1　材料与方法
1.1　试验材料
拟南芥哥伦比亚种(Arabidopsis thal iana v.
Co lumbia),由上海农科院生物技术中心惠赠;烟草
(Nicotiana tabacum)品种 K326 ,由黑龙江省烟草科
学研究所育种室提供;引物由上海生物工程公司商
业化合成 ,纯度 PAGE 级;其他主要化学试剂为
Sigma或国产 AR级试剂 。
1.2　拟南芥 AVP2基因的克隆
用 RNeasy Plant M ini Kit (Qiagen)提取拟南
芥哥伦比亚种幼根总 RNA , 经 DNA 酶 Ⅰ(Pro-
mega)处理去除烟草基因组 DNA , ImProm-IITM逆
转录试剂盒(Promega)反转录合成 cDNA 第一链。
再应用拟南芥 AVP2(AF182813)阅读框引物
R2989(5′-AAA GGA TCC AAC AAT GGA TGA
AGA TGT TGA GCA GGC CAG T TT G-3′, 具
Sac Ⅰ酶切位点)和 R2990(5′-AAA GAG CTC
AGA GGA AAA CCG GAG CCA TG -3′, 具
BamH Ⅰ酶切位点), Ex-Taq DNA 聚合酶(TaKa-
Ra)对反转录产物进行 PCR扩增 ,将扩增产物切胶
回收 ,与 pMD18-T(TaKaRa(大连))连接 ,转化大肠
杆菌 DH5α,提取阳性菌落质粒进行酶切验证 ,经酶
59第 9 期 郭兆奎等:拟南芥 A VP2基因转化烟草中吸钾相关基因的转录分析
切鉴定正确的克隆进行核苷酸全序列测定。
1.3　AVP2基因植物表达载体的构建
AVP2基因植物表达载体是在 pYH455 载体
(上海农科院惠赠)的基础上构建而成 , 通过
BamH Ⅰ和 SacⅠ(TaKaRa)双酶切 ,将 AVP2基因
从克隆载体 pMD18-T(TaKaRa(大连))上切下 ,利
用 T4连接酶(TaKaRa )插入具有相同酶切位点的
pYH455载体中 ,构建 AVP2 基因的植物双元载体
pYF7716 ,冻融法转化 LBA4404(Clontech)制备工
程菌株 ,并进行菌落 PCR验证。
1.4　烟草转化
采用叶盘法进行烟草转化 。将无菌苗叶片剪成
约 5 mm×5 mm 的小块 , 放入 50 mL OD值 0.3 ～
0.5的农杆菌液中感染 5 ～ 8 min后取出 ,灭菌滤纸
吸干 ,置于 9 cm 培养皿的两层滤纸中间 ,滴共培养
液 MSc(MS0 +NAA 0.2 mg/ L+6-BA 1 mg/L)保
湿 , 22 ℃黑暗条件下共培养 3 d后 ,转接到第 1次筛
选培养基 MS1(MS0 +6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.1
mg/L +Kanamycin(Km)50 mg/L +Carbenicillin
(Cb)250 mg/L)上光照培养 20 d ,再转到第 2次筛
选培养基 MS2(MS0 +6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.1
mg/L+Km 100 mg/L +Cb 250 mg/ L)上光照培养
30 d;取少许第 2次筛选培养后的抗性芽叶片 ,采用
Jefferson等[ 16] 的方法进行 GUS 染色鉴定;切下
GUS染色阳性芽插入生根培养基 MSr(MS0 +Km
25 mg/L+Cb 25 mg/L)光照培养 30 d ,生根形成转
化苗 。自然光温下练苗 3 ～ 5 d后移栽到育苗钵中 ,
单株提取烟苗叶片 DNA ,应用 AVP2基因检测引物
AVP2-Z(5′-G TG A TT GGT ATC GCC ATC CTC
TA T TCT AC-3′)和 AVP2-F(5′-AGG CTC GTG
CT T A TA GTC TG T A TA ATA TT T GG-3′)进
行PCR扩增 ,扩增条件:94 ℃预变性6 m in;94 ℃变
性 30 s ,62 ℃退火 40 s , 72 ℃延伸 1 min ,循环 35
次;最后 72 ℃延伸 10 min 。剔除检测结果阴性烟
苗 ,阳性烟苗移入温室正常管理。
1.5　Southern杂交鉴定
用 CTA B 方法提取转基因烟草的基因组
DNA ,然后用 Pst Ⅰ酶切消化 ,并进行琼脂糖电泳 、
转膜和杂交 ,分子探针为32P 标记的 AVP2基因 ,具
体操作参考 Sambrook等[ 17] 的方法。
1.6　荧光定量 PCR检测
根据 烟草 钾 离子 转 运体 基 因 NtH AK1
(DQ841950)、钾通道基因 NK T1(AB196790)、细胞
质膜 H+-A TPase 基因 NHA1(AAR32129)、液泡
膜 H +-A TPase 基因 VAG1(AJ005899)、液泡膜
H+-PPase 基因 N VP 1(X83730)和烟草 β-act in 基
因(AB158612)序列设计阅读框引物 ,对 AVP 2转
化烟苗幼根 mRNA 提取物的 ImProm-IITM 逆转录
产物进行 PCR扩增(方法同 AVP2基因克隆),扩增
产物纯化后 ,通过紫外分光光度计吸光值 OD260和
DNA 序列中 4种核苷酸含量 ,制备各 DNA 片段拷
贝数分别是 102 ,103 ,104 ,105和 106 的倍比稀释液 ,
作为荧光定量 PCR反应的参比标准模板。利用 MJ
Opticon 2荧光定量 PCR仪 ,分别以 AVP2S-F(5′-
TCT CGA TGG ACC GGA TAG T T-3′), AVP2S-
R(5′-GGC CTA CTC TGC TTA TCA CA-3′);Nt-
HAK1S-F(5′-CCT TA T TGT GCC GTC A TG
CC-3′), N tHAK1S-R(5′-CTG AGA T TG CAG
GAG TAA GG-3′);NK T1S-F(5′-CAA TCT TGG
CCT CAC TGC TT-3′), NKT1S-R(5′-TAC CTC
ATC TGG CGA T TC G T-3′);NHA1-S-F(5′-GCA
AGA GCA GGC ATC CAA GA-3′), NHA1-S-R
(5′-CCA CAG CCA AGG AAC GAA GA-3′);
VAG1-S-F(5′-GGC ACG TAA CCA CAG TGA
AG-3′),VAG1-S-R(5′-AGA AGC AGC CA T GCC
TAG TC-3′);TV P1-F(5′-GCT GGA GGA A TA
GCT GAG A T-3′), TVP1-R(5′-G TC ATG GCA
GAG AAC CAG TA-3′);Act-F (5′-GA T CT T
GCT GG T CG T GAT CT- 3′), Act-R(5′-ACT
TCC GGA CA T CTG AAC CT-3′)为引物 , 应用
SYBR G reen I(Sigma)荧光染料 ,同时对 AVP 2基
因烟草转化材料及未转化对照幼根的总 RNA 反转
录产物 10倍稀释液和参比标准模板进行实时定量
PCR扩增 ,并以参比 DNA模板绘制 Ct值与靶序列
拷贝数的标准曲线 ,以烟草内源 β-actin 基因作为看
家基因 ,通过目标基因 mRNA 拷贝数与看家基因拷
贝数的比值 ,标定幼根 RNA 提取物中各目标基因
的转录水平 ,消除 PCR反应体系中由于所加模板量
的差异而引起的误差 ,试验结果以 3次重复的“平均
值±S E”表示。
1.7　转化烟株矿质营养和内在成分的测定
将各转化材料的 T2 代种子育苗 ,移栽前单株
取样提取 DNA 进行 AVP2基因 PCR检测 ,检测结
果呈阳性的烟苗移栽至隔离圃(宁安市范家乡黑龙
江省烟草科学研究所试验场),每个转化材料种植
30株 ,以同品种未转化烟草为对照 ,烟叶成熟后取
第 7 ～ 12片叶烘烤 ,选烟叶等级为 CLX3样品 ,应用
烟叶流动分析仪测定烟叶中 K + 、还原糖 、总糖 、烟
60 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 36 卷
碱 、蛋白质等内在化学成分。
2　结果与分析
2.1　拟南芥 AVP 2基因的克隆
经拟南芥幼根总 RNA 提取 、纯化 、反转录和
AVP2阅读框引物 PCR扩增 ,获得 2 400 bp左右扩
增产物 , 将该扩增产物切胶回收 , 与 T-载体
(pMD18-T)连接 ,进行大肠杆菌转化子的酶切鉴
定 ,并对酶切鉴定正确的 5个克隆进行插入片段的
核苷酸全序列测定 , 获得测序鉴定正确的克隆
YF6885 ,其中的插入序列全长 2 403 bp ,和 Gen-
Bank 上公布的拟南芥 AVP2 基因的核苷酸序列基
本一致 ,仅有 2个核苷酸的差别 ,不造成编码氨基酸
的改变。
2.2　AVP2基因植物表达载体的构建
2.2.1 　AVP 2 基因表达载体的构建 　利用
BamH Ⅰ和 SacⅠ双酶切 ,将测序鉴定正确的 AVP2
基因全长克隆 YF6885 替换 pYH455 质粒上的
Rdre1B I 基因 , 构成 AVP2 基因的植物双元载体
pYF7716 ,该植物双元载体是 pCAMBIA1201双元
载体的衍生质粒[ 18] 。由烟草的 Ubi.U4 基因启动
子控制内含子 GUS 基因的表达;AVP2 基因由带
Ψ翻译增强子的双 CaMV 35S启动子和 nos终止子
控制 ,并在 NHX 1基因的一侧插入了烟草染色质附
着序列MAR ,以增强转入基因的稳定性 ,选择基因
是带 Catalase 基因内含子的Km 抗性基因 ,由于基
因内部带有内含子 ,不能在根癌农杆菌中表达 ,但可
以在转基因植物中正确转录 ,并翻译出有功能的产
物 ,因此在筛选培养过程中加入 Km 即可达到杀菌
及筛选转基因植物的双重目的 ,降低了头孢及羧苄
等杀菌抗生素的使用浓度;头孢及羧苄等杀菌抗生
素具有类似植物激素的活性 ,会干扰植物外植体的
正常生长和分化 ,内含子 Km 抗性基因的使用可减
轻杀菌抗生素对外植体生长和分化的不利影响 ,明
显提高植物的转基因效率;同时 ,由于内含子 Km抗
性基因飘逸至微生物中不能表达出功能产物 ,所以
带有内含子 Km的抗性基因可提高转基因植物的环
境安全性。
2.2.2　AVP 2 基因表达载体的验证 　用构建的
AVP2基因表达载体 pYF7716转染大肠杆菌 DH5α
感受态细胞 , 选择白斑菌株提取质粒 ,经 Sac Ⅰ和
BamH Ⅰ双酶 ,切获得了酶切片段长度约为 2.4 kb
的 DNA 片段 ,与设计的 AVP2 基因目标片段长度
相符(图 1),证实载体构建正确 ,再将鉴定正确的表
达载体质粒转化根癌农杆菌 LBA4404 ,制备 AVP2
工程菌株 YH5121 , 并应用 AVP2-Z 和 AV P2-F 引
物进行菌落 PCR验证 ,结果见图 2。由图 2可以看
出 ,泳道 3 ,5和 6的根癌农杆菌菌株的菌落 PCR均
可以扩增出片段长度为 2.4 kb的特异性产物 ,证实
表达载体 pYF7716已成功转化根癌农杆菌制成工
程菌株 。
图 1　表达载体 pYF7716 的酶切验证
1.DNA 分子量标记 DL2000;2.pYF7716质粒;
3.SacⅠ和 BamH Ⅰ双酶切的 pYF7716质粒
Fig.1　Res t riction analysis of pYF7716
1.DNA Marker DL2000;2.pYF7716 vector;3.SacⅠ and
BamH Ⅰ digested pYF7716 vector
图 2　工程菌株 YH5121 的菌落 PCR 验证
1.含有 pYF7716质粒的 DH 5α;2～ 6.转化 LBA4404菌株;
7.DNA 分子量标记 DL2000
F ig.2　Co lony PCR analy sis of YH5121的菌落 PCR分析
1.DH5αcontaining pYF7716 vector;2-6.Transformed
LBA4404;7.DNA M arker DL2000
61第 9 期 郭兆奎等:拟南芥 A VP2基因转化烟草中吸钾相关基因的转录分析
2.3　AVP2转化烟草的鉴定
2.3.1　PCR鉴定　通过根癌农杆菌介导的 AVP2
基因遗传转化 ,共获得 Km 抗性转基因烟草 71株 ,
其中 GUS 染色阳性转基因烟草 11 株 , 以抽提的
GUS染色阳性的转基因烟草植株总 DNA 为模板 ,
以AVP2-Z 和 AVP2-F 为引物 ,通过 PCR扩增检测
转基因植株中的 AVP2基因。PCR扩增结果显示 ,
7株 GUS染色阳性的烟草植株的总 DNA 中都可扩
增出 700 bp左右的 AVP2基因片段(图 3)。
2.3.2 　Southern 杂交鉴定　提取 GUS 染色和
AVP2基因 PCR扩增均呈阳性的各抗性烟苗基因
组 DNA ,经 PstI Ⅰ酶切 ,以32 P 标记的 AVP 2基因
(BamH Ⅰ和 S acⅠ的酶切片段)为探针进行 South-
ern杂交 ,结果如图 4。由图 4可见 ,GUS 染色阳性
的转基因烟草植株都有杂交带出现 ,证实 AVP2基
因已成功导入烟草。
图 3　转 A VP2 基因烟草植株的 PCR扩增结果
1.DNA分子量标记 DL2000;2.非转基因烟草;
3.含 AVP 2的阳性对照;4～ 10.转化烟草植株
Fig.3　PC R analy sis of A VP2 transformed tobacco plants
1.DNA Mark er DL2000;2.Nont ransformed tobacco plants;
3.Positi ve cont rol(AVP2 gene);4-10.Transgenic tobacco plan ts
图 4　转 AVP 2基因烟草植株的 S outhern 杂交鉴定结果
1～ 4.AVP2基因烟草转化株
Fig.4　Southern blot of AVP2 t ransformed tobacco p lan ts
1-4.AVP 2 t rans-f orm an ts
2.4　转化材料中 AVP 2基因的转录水平
随机从 PCR扩增和 GUS染色阳性的不同转化
材料中取 6 个转化单株 ,将其烟苗幼根总 RNA 的
反转录产物与拷贝数为 102 , 103 ,104 , 105 和 106 标
准参比 DNA 和未转化 DNA 提取物同时进行荧光
定量 PCR扩增 ,扩增曲线如图 5所示 。
图 5　转化烟草植株幼根中 A VP2 转录水平
的荧光定量 PC R扩增曲线
S0～ S5.DNA 模板标准参比;1～ 6.转化烟草幼根 cDNA
Fig.5　Testing curves of A VP2 transcript
in the tr ansgenic r oo ts by real- time PCR
S0-S5.Standard conference DNA template;1-6.cDNA
1 from 6 samp les of t ransgenic tobacco root s
根据标准参比 DNA S1 、S2 、S3 、S4 、S5和 S0所
建立的 C t值与 DNA 考贝数对数值的直线回归方
程为Y =-0.25X +8.85 ,相关系数 r 2 =0.995 ,同
时建立看家基因 β-actin 拷贝数与反应 Ct值的标准
曲线和回归方程 ,由此计算出目标基因 AVP2和看
家基因 β-actin的考贝数 ,为消除由于模板量造成的
误差 ,利用各转化烟草材料幼根中 AVP2 与看家基
因的比值来估测 AVP 2基因的相对转录量 ,结果见
图 6。由图 6可以看出 ,导入的 AVP2基因在 6个转
化烟草材料的 T1代幼根中 ,均有 mRNA 转录 ,证
实 AVP2基因已转入烟草基因组中 ,并成功转录为
mRNA ,但不同转化材料的转化水平有所不同。
图 6　各转化烟草材料中 A VP2转录 mRNA 的分析
AVm-n.AVP 2转化烟草的 T1株系 AVP 2;CK.未转化烟草
Fig.6　mRNA analy sis of AVP2 in transgenic ro ots
AVm-n.Tobacco t ran sformant T1 gen eration;CK.
Wild type tobacco
62 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 36 卷
2.5　转化烟草 K +吸收相关基因的转录分析
分别提取转化株 AV9-2 和未转化材料幼根总
RNA ,反转录后分别应用烟草钾通道基因 NK T1 、
钾离子转运体基因 N tHAK 1 、细胞质膜 H+-A T-
Pase基因 NHA1 、液泡膜 H +-ATPase 基因 VAG1
和液泡膜 H +-PPase 基因 N VP1的实时PCR引物 ,
进行荧光定量分析 ,结果见图 7 。由图 7 可以看出 ,
与未转化烟草对照相比 ,转拟南芥 AVP2 基因烟草
幼根中 ,烟草液泡膜 H+-A TPase 基因 VAG1 和液
泡膜 H +-PPase基因 N VP 1的转录水平有所降低 ,
烟草钾离子转运体基因 N tHAK 1显著增加 ,而烟
草钾通道基因 NK T1稍有增加 ,细胞质膜 H +-A T-
Pase基因 N HA1无显著变化。
图 7　转 A VP2基因烟草 K+吸收相关基因的转录
F ig.7　A VP2 tr anscription of g enes relativ e to K + uptake
图 8　A VP2基因转化材料烟叶的含钾量
Vm-n-o.AVP 2转化烟草的 T2代株系;CK.未转化烟草
Fig.8　The potassium contents of A VP2
tr ansfo rmed tobacco leaf
Vm-n-o.AVP2 tobacco transformants T2 gen eration;
CK.Wild type tobacco
2.6　转化烟叶的含钾量分析
经 AVP2基因 PCR鉴定结果为阳性的 T2代
转化烟苗 ,移栽到中间试验隔离圃 ,正常管理 ,并用
标签标注采收中部叶片 ,烘烤后测定烟叶内在化学
成分 ,对转化烟草材料烟叶的内在化学成分的分析
发现 ,与对照相比 ,除烟叶含钾量外 ,其他内在化学
成分均无显著变化 ,各转化材料烟叶含钾量化验结
果见图 8。由图 8可以看出 ,与同品种未转化对照
相比 , AVP2基因转化烟草 T2 代材料烟叶含钾量
显著增加 ,不同转化材料中烟叶含钾量有较大差异 ,
其中 3个转化材料 V2-5-4 、V7-3-5和 V9-2-6 烟叶
含钾量超过 2.0%,较对照增加了 30%以上。
3　结论与讨论
植物中的钾主要存在于细胞质和液泡 ,液泡中
K+浓度的变化与植物组织 K+含量变化相一致 ,而
细胞质中 K +保持恒定 ,细胞质中 K+浓度仅在液泡
内 K+浓度低到一定程度时才表现降低[ 19] 。细胞质
中的 K +/Na+对于细胞的生理功能非常重要 ,当植
物处于必需营养元素缺乏或盐胁迫环境时 ,为维持
正常的生理代谢 ,细胞将通过相关基因转录和翻译
来调控多种跨膜运输 、渗透势和电化学机制[ 20] 。通
过质膜和液泡膜对 K +/N a+离子的选择性运输 ,使
细胞质中各种离子浓度稳定在一定范围内 ,与动物
细胞不同 ,植物细胞不具有 Na+/K +-A TPase ,只能
依靠 H +-AT Pase和 H +-PPase 形成的跨膜电化学
势 ,来驱动 K +和其他离子的吸收与代谢[ 21] ;经盐胁
迫处理的烟草培养细胞 H +-ATPase 转录增加[ 22] ,
H
+-A TPase 水解 AT P或 PPi把质子泵出质膜外或
液泡膜内 ,使跨膜的质子电化学势发生改变 ,进而影
响 K+离子的次级运输途径 ,如钾通道或 H+/K +协
同转运体 ,各种离子的转运机制(离子转运 、通道蛋
白 、反向转运体等)发生相应变化 ,维持细胞内的离
子平衡 。本研究通过提取拟南芥总 RNA , RT-PCR
反转录克隆拟南芥 AVP2 基因 ,并完成全序列测
定 ,经根癌农杆菌介导法 ,将从拟南芥中克隆的
AVP2基因导入烟草品种 K326中 ,得到了 AVP2
基因的转化烟草。以同品种未转化烟草为对照 ,应
用荧光定量 PCR分析了 AVP 2转化烟草幼根中各
K+吸收相关基因的转录水平 。结果证实 ,与未转化
对照相比 ,在 AVP 2转化烟草幼根中 ,通过带有增
强子的 35S 启动子引导拟南芥液泡膜 H +-PPase基
63第 9 期 郭兆奎等:拟南芥 A VP2基因转化烟草中吸钾相关基因的转录分析
因 AVP2的过量表达 ,增加了 H +-PPase 的能量供
应 ,改变了液泡膜跨膜质子电化学势 ,这可能是烟草
细胞中钾离子转运体基因 Nt HAK 1和钾通道基因
NK T1转录增加的原因。由此可以推测 ,钾离子转
运体基因及钾通道基因的转录和表达 ,与液泡膜上
H +-PPase的能量供应有关 ,同时发现 ,转 AVP2基
因烟草幼根中 , 烟草液泡膜 H+-A TPase 基因
VAG1和液泡膜 H+-PPase基因 N VP 1的转录水平
较正常烟草有所降低 ,细胞质膜 H +-AT Pase 基因
NH A1无显著变化。
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64 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 36 卷