全 文 ：1 . f戮科子选展 第 , 3卷 第 4 期 2 0 03 年 4月
表达千穗谷 A h 一 A刻 rP 基因的转基因烟草抗病性研究 关
陈 艳 ` , 2 郭洪年 2 姜 瑛 “ 李常青2 赵文明 ` 田颖川 “ ` 关 关
西安交通大学生命和技术学院 , 西安 7 10 049 ; 2 . 中国科学院微生物研究所 , 北京 1 0 0 0 8 0
摘要 通过 P C R 从览属植物千穗谷 ( A m a ra ht u : h yP 、 ho n d ir ac us )的总 D N A 中扩增 出觉菜抗菌肤
( A h
一
A M P ) 的核基 因片段 , 序列分析结果表明该基因长 2 61 b p , 编码一个由 8 6 个氨基酸组 成的 A h -
A M P 前体多肤 . 在构建 A h 一 A M p 基 因 的植物表达 载体 p B in A H 916 后 , 通过根癌土壤杆菌介 导方
法转化了烟草 . 转化再生植株 和 T , 代转基因烟草的 P C R 和 so ut he m bl ot 分析表明 , A h 一 A M P 基因
已整合到烟草 的染色体 中 , 并为单拷贝整合 . T , 代转基 因烟草 的 N or t he m b lot 分析结果 表明 ,
A h
一
A M尸 基因在转基因烟草中至 少在 m R N A 水平上能正 常表达 . 对 T 。 代转基 因烟草进行烟草青
枯病的抗病性试验 , 筛选出两株抗性较强 的植株 . 对 T l 代抗青枯病 的统计分析发现 , 其抗病性 比
起始品种 S R I 分别提高了 2 . 2 4 和 1 . 6 2 个级别 ; 其病情指数比起始品种降低 4 9 . 6 % 和 3 7 . 3 % 对
黑胫病也表现一定的抗性 , 主要表 现在推迟 发病时间 , 减缓发病速度上 . 这些结果表明 A h 一 A M 尸
基因在植物抗病基 因工 程研 究中可能是一个有潜在应用价值 的基因 .
关键词 千穗谷览菜 抗菌肚 A h- A脚 基因 转基因烟草 抗病性
植物受到病原菌侵染及其他胁迫条件诱导时 ,
会产生一 系列的病程相关蛋 白 ( P R S ) . 其中几丁 质
酶和 件1 , 3 一葡聚糖酶在体外能水解真菌细胞壁的两
种主要成分几丁质和葡聚糖 , 具有较强的抗真菌活
性 { ’ 〕 . 另一类富含半胧氨酸的抗菌肤 ( A M sP ) , 包括
硫荃 、 植物防御素 、 打结素型肤和橡胶素型抗菌肤
也具抗菌活性「2 ] , 如大麦硫荃在烟草中过量表达可
提高对细菌病害烟草野火病的抗性 3[] ; 表达萝 卜防
御素 R s 一 A F P Z [ 4〕和紫花首楷防御素 a lf A F P [ 5 }的转基
因植物分别提高了对真菌病害烟草赤星病和马铃薯
黄萎病的抗性 . D e B ol e 从尾穗觉 ( A 阴 a ar nt h u : 。 a 。 -
d at u 、 )种子中分离到两个橡胶素类抗菌肤 A c 一 A M PI
和 A c 一 A M P Z , 分别由 2 9 和 30 个氨基酸组成 , 在体
外具有很强的抗真菌和细菌的特性 , 而且对植物细
胞和哺乳动物细胞无害〔“ 〕 . 随后 , 分离了 A c 一 A M sP
的 c D N A 序列并对其结构进行了研究 , 结果表明该
蛋白质由氨基端信号肤 、 成熟肤和含有 N 一糖基化位
点的梭基端前肤 3 个区域组成比 “ 〕 . 定位分析表明
A c
一
A M P Z 主要分布在细胞间隙且转基因植物中纯化
的 A c 一 A M P S 具有 同样的抗菌活性 9l[ . A c 一 A M P Z 转
基因烟草中的抗真菌活性 已有初步研究 , 但因所试
病菌种类有限 , 此基因在植物抗病基因工程中应用
的可行性 尚需进一步的研究结果来证实 .
根据 A c 一 A 人寸p Z 基因序列 , 经 P C R 方法在 千穗
谷觉菜 ( A m a ar nt h u 、 h y Pco h on d ir a cu 、 )中克隆出一个
抗菌肤基因 A h 一 A M P . 本文主要研究转 A h 一 A M P 基
因烟草对细菌和真菌的抗性分析 , 为利用分子育种
方法培育广谱性的抗病品种提供理论依据 .
材料与方法
1
.
1 植物材料 、 菌种与质粒
览菜品种千穗谷 ( A m 。 : 。 二 t人。 s h护 o e h o n d r i a c u 、 )
种子由美国 oI w a 州立大 学 区域 植物 引种站馈 赠 .
4一 5 叶期的无菌培养烟草 s R I (从 e o z i a n a ra b a e u o Z
vc
.
S R )I 作为根癌土壤杆菌转化试验的外植体 . 烟
草青枯 病菌 ( 尸s e u d o m o n a 、 、 o za n a cea r u m ) 、 大 肠杆
2( )0 2
一
1 1 12 收稿 , 2 0 0 2一 12 一 2 5 收修改稿
关 国际科学与文化中心 ( IC S C )世界实验室资助项 目
关 , 东北农业大学硕士研究生
* 、 * 联系 人 , E 一 m a , l : t ;a n y e @ s u n . , m . a e . e n
红戮并乎选展 第 〕3 卷 第 4期 20 03 年 4月
菌 ( E c s人e r ie 人i a。 0 21) DS H。 、 根癌土壤杆菌 ( Ag r o 占 ae -
t e r i u n, t m
aef
e i e n s ) L B A 4 4 0 4
、 质粒 p U C 1 9 、 二 元
载体 p iB n 4 3 8 由本实验 室保存或构建 . 烟 草黑胫病
菌 (尸h yt oP ht ho ar : 女ot ia an 。 )由青州烟草研究所王凤
龙研究员惠赠 .
1 5 胖g总 R N A 在 1 . 2 % 的 甲醛变性胶中电泳分离后 ,
转移至 H y bo dn 一 N 十 尼龙膜上 . 探针的标记 同 1 . 6 所
述 . 同一杂交膜经 煮沸的 0 . 5 % DS S 洗去探 针后 ,
再用 1 8 5 r D N A 探针进行杂交 .
1
.
2 A h- A 再I P 基因的克隆及分析
参照文献「10 ]从觉菜叶片中提取总 D N A . 根据尾
穗觉 ( A m a ar nt h u 、 ca 翻汰刁t u 、 )抗菌肤 A e ~ A N l 〕的 c l )N A
序列 , 设 计以下 PC R 引物 . cA l一 I : 5 ’ - C G G A z灯 v l℃ A -
G用 ’( 几A C 〔!AT G G T G A A C A FG AA G FG I , -G 3 ’ ; cA 卜n :
5
’ 一
C C G A A (义了1丫 r G T C G A C T C AT 《义玉A C IA C C A (义二A C C -
3’ . PC R 反应 条件 为 : 94 ℃ 预变 性 3 而 n , 然后 以
94 ℃变性 1 im n , 56 ℃复性 4 5 5 , 72 ℃ 延伸 1而n , 进
行 30 个循环 通过琼脂糖凝胶 电泳 回收扩增片段 ,
与 s m a l 酶切后的 p u c 19 载体连接 , 所得重组质粒命
名为 p 气H 9 1 6 .
1
.
8 转基 因烟草青枯病抗性鉴定
接种用青枯菌在 T z C 培 养基 (牛 肉汁培 养基
+ 0
.
05 % 2
,
3
,
5
一氯化三 苯基四 氮哩 )上挑选野 生
型菌落 , 转 移到牛 肉汁培养基 ( N A )上 , 30 ℃ 培养
4 8 h 后使用 . 参照文献「14 」, 用沾根法对长至 5 一 6
片叶的转基因烟草进行青枯病接种实验 , 实验重 复
3 次 . 病情观察方法根据 国家规定 的方法进 行〔` , ] .
病情指数和病级计算方法根据文献 「1 4〕进行 . 品种
抗性级别标准 : 病级 0 . 1一 2 为抗病 ( R ) ; 2 . 1一 3为中
抗 (M R ) ; 3 . 1一 4 为中感 ( M S ) ; 4 . 1一 5 为感病 ( S ) .
1
.
3 植物表达载体的构建和烟草的转化
重组质粒 p A卜19 16 经 雌 2 1和 反 l 工酶切 , 回收
26 0 bp 基 因 片 段 与 伪。 H 工和 反 z 工酶 切 的载 体
p iB 科38 连接 , 所得质粒命名为 p BI I俏月 9 16 . 按 文献
「1 1] 将该质粒转入根癌土壤杆菌 I」3八屏4 04 中后 , 即
可用于植物的转化 . 烟草的转化参照文献「12」进行 .
1
.
9 转基因烟草黑胫病抗性鉴定
黑胫病菌在燕 麦培养基 ( 5 % 燕 麦 + 3 % 琼脂 )
上 , 2 8 ℃ , 黑暗培养 s d 后 , 转移到煮过的谷子中 ,
2 8 ℃黑暗培养 10 d 后使用 . 接种 烟草苗龄为 2 个
月 . 接种时在离植株 Z Cm 处挖一小坑 , 埋入 1 9 菌
谷 . 保持高温高湿的条件 ( 25 一 30 ℃ ) , 接种 s d 后
观察病情￡’ 5 〕并进行病情指数和病级计算 ￡` 4〕 .
2 结果与分析
1
.
4 转基因烟草的 P C R 分析
根据 35 5 启动子和 A h 一 A M I 〕 基因序列设计以下
P C R 扩 增 反应 的 引 物 , P l : 5 气 C T C C A C T G A C G -
T A 丫、 G G G A T G A 一 3 ’ ; P Z : 5 ’ 一 G G A C T A C C A G C A C C -
A G C A G A
一
3
’ . 扩增条件为 : 9 4 ℃ 变性 45 5 , 56 ℃复
性 4 5 5 , 72 ℃延伸 1 m in , 共进行 35 个循环 .
5 转基因烟草的遗传分析
参照文献「1 1] 进行 .
1
.
6 转基因烟草子代 ( T l )的 s o u t h e r n 印迹分析
总 D N A 提 取 及 s ou t he m 杂交 分析 参 见 文 献
「1 0 , 1 3」. 用 P C R 法标记探针 . 以 A e l一 I 和 A e l一 n
为引物 , p B in A H 9 16 质粒 D N A ( 一 2 . s n g )为模板 ,
加入 0 . 2 m m o l / I一 的无 d e T P 的 dN T P 及 s o L 。 一 , Z P -
d c T P
, 在 5 0 碑一 体系中进行 P C R 扩增 , 扩增条件
同 1 . 4 所述 .
2
.
1 A h
一
A M p 基因的克隆和分析
以觉菜总 D N A 为模板进行 P C R 扩增 , 产物经
琼脂糖电泳分析表明有一条约 2 60 b p 的 D N A 片段 ,
将此片段克隆至 S m a 工酶切的载体 p u 1C 9 中 . 形成
A h
一
A 人工p 的 D N A 克隆 妞H 9 16 .
对获得的克隆进行序列分析的结果表明 , 目的
片段长 2 61 b p , 编码 一个 由 86 个氨基酸组成 的多
肤 , 与 已报道的尾穗觅 ( A . ca u da t us )种子中发现的
抗菌肤 A c 一 A M P Z 的 C D N A 序列相 同 , 说 明在不 同
的觅菜种中 , 此基因至少在编码 区中是保守的 , 而
且不存在 内含子 序列 . A h一 A M P 基 因的序 列 已 被
G e n B a n k 收录 (登记号为 A F 1 5 3 9 15 ) .
1
.
7 转基因烟草子代 ( T l )的 R N A 提取和 N o r t h e r n
杂交分析
参照 文 献 仁13 〕提 取烟草总 R N A . 并 取 10 一
2
.
2 植物表达载体的构建和烟草外植体的转化
为了研究 A h一 A M P 基因在转基因植物中可能的
抗病作用 , 利用二元载体 p iB n4 38 构建了植物表达
载体 p B i叭 H 9 16 . 重组质粒 p B i n A H 9 16 经 P e R 和
cE
o R l / iH
n d l 双酶切分析 , 结果证 明其结构正
确 , p iB nA H 9 16 中的一D N A 结构见图 1 .
自、盆并乎选展 第 1 3 卷 第 4 期 2 0 0 3 年 4 月
H ,刀 d 111 B a m l l aS l
符合 3 : 1 分离 . 此结果说明 N P T l 和其紧密连锁的
A h
一
A AJ p 基因可能以单拷贝整合到 了这两个株系的
基因组上 .
A h
、 刁入了尸
图 1 A h 一A 几至p 基因植物表达载体中 -T D N A 结构
N尸T l 为新霉素磷酸转移酶基 因 ; n 为烟草花叶病毒 R N A 的
5
’ 末端非翻译区 c D N A 片断 ; D 3 5 S 为带双增强子 的 C a M v 3 5 S
启动子 ; N os 3 ’ 为 N o s 基 因的转录终止序列
2
.
3 转化再生植株的 P c R 检测和青枯病抗性分析
用 P l 和 P Z 引物扩增具有卡那霉素抗性的再生
植株的 D N A , 得到 1 条 4 2 8 b p 的 D N A 片段 , 与预
期长 度 一 致 , 而 以 非 转 基 因 对 照 或 转 空 载体
p iB n 43 8 的植株 D N A 为模板未检测到该 P c R 产物 ,
证 明外源基因很可能 已整合到植物 的染色体 中 . 在
转 A h 一A AJ P 基因的再生植株中获得了 50 株 P C R 鉴
定为阳性的植株 (资料略 ) .
当 4 0 个 P C R 阳性的再生植株长到 5 一 6 片叶
时 , 按材料与方法所述接种青枯病菌 . 其中一些植
株表现出比非转基因植株更好的抗性 , 主要表现在
非转基因植株在接种 1 d 后开始发病 , 而一些转基
因植株在接种 4 个星期后仍正常生长 (图 2 ) . 最后
获得 5 株可育的抗病转基因系 , 其中 2 株抗性最好
的用来进行下一步实验 .
2
.
5 转基因子代的分子生物学分析
为了解转基因子代中抗菌肤 A h 一 A M P 基因的遗
传情况 , 对 B巧 和 B 25 子代各选取 30 株抗卡那霉
素的植株用特异引物 P l 和 P Z 进行 P C R 检测 . 结果
60 株被测试 的植株均 出现 4 2 8 b p 的扩增带 , 而非转
基因或 p iB n4 38 空载体转化 的对照无扩增带 . 这一
结果初步表明 A h 一 A八了P 基因已稳定遗传给子代 .
对 3 株 B 15 和 2 株 B 25 子代植株进行了 S ou t h -
er n bl ot 分析 . 结果显示 (图 3) 所检测的 5 个植株都
有 1个特异的杂交带 , 非转基因对 照无杂交带 , 质
粒 pA H 9 1 6 ( E co R 工酶解 )阳性对照的位置 出现一条
2
.
9 5 k b 大小的杂交带 , 与预期的大小一致 . 此结果
说明 A h 一 A M p 基因在 1B 5 和 B 25 两个转 基因系中
只有一个拷贝 , 但两 个株系 中基 因插入 的位置 不
同 . 这 一结果与子代卡那霉素抗性分析结果一致 ,
从而说 明目的基因正确地遗传给了后代 .
2
.
9 5 kb
图 3 转基因烟草子代 s o u t h e r n b l o t 分析
1
, 非转基 因对照 ; 2 , 阳性对照 ; 3 一 5 , B巧 转基因植株
子代 ; 6 一 7 , 砚 5 转基因植株子代
图 2 转基因系 B i s 子代 ( i , 2 )和对照 ( 3 , 4 )
在青枯病菌接种 20 d 后的生长状态
N o r t h e r n 分析结果显示 (见图 4 ) , 在 1 8 S r R N A
杂交信号强度在不同样 品之 间基本一致的条件下 ,
非转基因烟草没有杂交带 出现 , 而在 2 个转基 因系
( B 15
,
B 2 5) 的子代植株中均出现 1 条杂交信号强弱
不同的特异的杂交带 , 说明 A h 一 A A寸1〕 基 因能够正确
转录 , 而转录水平在不同个体之间存在差异 , 这种差
搽耀2 . 4 转基因烟草的遗传分析为进一步了解外源基因在染色体上 的整合及分离情况 , 从原代转基因植株 ( T 。 )选择 2 个抗青枯病
的植株收获其 自交的种子 ( T l ) , 按 1 . 9 所述的方法
对 0T 代植 株 的子代进行 卡 那抗性 检 测 以 测 定与
A h
一
A八心〕 基因紧密连锁的基 因 N P T 且的分离情况 .
结果表 明转基因系 B 15 和 B 2 5 植株中抗性和敏感植
株数 比例分别是 3 3 7 比 9 2 和 2 3 5 比 7 6 , 卡方分析
4 弃 、水压
A h
、 廿护
18 S r R N A
图 4 转基因子代 N o r th e r n b l o t 分析
1一 3 , B 15 转基因植株子代 ; 4 , 非转基因对照
s R I ; 5
,
B 2 5 转基 因植株子代
自、生并子选展 第 1 3卷 第 4 期 2 。。 3年 4 月
异可能由基因沉默或因植株个体之 间在生理活性方
面的差异引起 .这 种差异的原因及对植 株抗病性的
影响值得进一步研究 .
2
.
6 转基 因烟草子代的抗病试验
为了进一步证实 A h 一A MP 基因的表达赋予植株
的抗病性 , 从 B 15 和 B 25 中选择抗卡那霉素和 P C R
阳性的 T l 代植 株 , 鉴定其对烟 草细 菌病害 (青 枯
病 )和真菌病害 (黑胫病 )的抗性 . 从转基因 T , 代烟
草对青枯病的抗性分析结果 (表 1) 可 以看 出 , 转基
因系 B 1 5 在接 种 20 d 后病情指数 比非转基因品种
S R I 低 4 9 . 6 % , 抗性提高 了 2 . 24 个级别 , 达到抗
病 的水 平 . 转 基 因 系 B 25 的病 情 指 数 比 sR I 低
3 7
.
3 %
, 抗性水平提高 一 r 1 . 62 个级别 , 达到 中抗的
水平 . 转二元载体 p iB n4 38 (空载体 )的转基 因植株在
接种青枯病后的表现较非转基 因对照略更敏感一些 ,
由于病指和抗病级别的确定主要以非转基因植株为对
照进行的 , 所以在此略去空载体对照的有关资料 .
表 1 转基因烟草子代青枯病抗性分析
转基因株 系 接种株数 病级或病指相对值 / % (抗级 )
S R l b ) 1 0
B 15 3 ()
B 2 5 2 8
病指 a )
8 3
.
3
3 3
4 6
3
.
9 2 ( M S )
1
.
6 8 ( R )
2
.
3 ( M R )
a
) 接种 20 d 后的病情指数 , b) 非转 基因株系
从表 2 及图 5 可 以看 出转 基因 T I 代烟 草对黑
胫病侵染的反应 . 转 A h 一 A 九f P 基 因的 2 个株系 , 病
情指数都比非转基因品种低 , 尤其 B巧 系 , 接种到
第 1 天时只有轻微发病 , 达到抗病的水平 .
表 2 转基因烟草子代黑胫病抗性分析 a)
转基 因株系 接种 株数 病指 ( 7) 病指 (9 ) 病指 ( 1 1) 病指 ( 1 2)
S R I 8 5 3 8 5 85 9 5
B 1 5 1 1 U 0 18 2 5
B2 5 1 1 40 4 5 6 0 6 5
a) 括号内数字代表接种 天数
已有报道 表明 A c 一 A M P S 在体外 能抑制真菌链
格胞 ( A zt e r n a 二 i a 占ar s s i e o za ) 、 大丽轮枝菌 ( ve r t i c ￡z-
z i u m 由人zi a 。 ) 、 灰葡萄抱 ( B o tyrt i , 。 i n e er a ) 、 豆刺盘
饱 ( oC z ze t o t r艺c人u m 21, d e n ` u t入i a n u m ) 、 豌 豆壳 二胞
(
、
As` 口 c h yt a p i s i )
、 黄色镰抱 (凡 s a r i u m : u zm o r u m ) 、
木霉菌 ( T八 hc od er m a ha m at u m )及两种革兰 氏阳性
菌巨大芽抱杆菌 ( B ac 汀 lu : m gae t er iu m )和藤黄叠球菌 ( s a cr i n a z u t e a ) [6 ]的生长繁殖 , 以上结果说 明这
种蛋白质具有比较广谱的抗菌活性 , 尤其对真菌病
害 . 我们的实验证明 , 转 A h 一 A M P 基因的烟草植株
推迟了青枯病和黑胫病 的发病时间 , 减缓了发病速
度 , 表 明 A h 一 A八寸1〕 基因表达产物在转基因植物中也
具有抗细菌和真菌的作用 , 这在此类抗菌肤基 因工
程研究中尚未见报道 . D e B el 发现转 A c 一 A M p Z 基
因烟草对烟草赤星病和灰霉病的抗性没有明显提
高 , 可能是 A c 一 A M P Z 在转基 因植物 中的表达 量过
低的原 因 0[] . 我们也重复了转基 因烟草对赤星病的
抗性研究 , 结果发现烟草品种 K 326 相对 SR I 更容
易被侵染感病 , 而 S R I 经多次接种均未受到侵染 ,
表明 SR I 本身具有抗赤星病 的能力 . 转基因植株与
野生种具有同样高的抗性 , 该抗性可能来源于 品种
本身 , 所以 尚不 能确定 A h 一 A M P 对该病 的抗病作
用 . A h 一 A M P 与几丁质结合蛋 白富含 C ys / lG y 的功
能域具有同源性 , 所以其抗菌机理可能与其有结合
几丁质的能力有关 , 而不同于 C ce or p i n s 一类的裂解
肤 [ `“了. 至于 A h 一 A M P 为何能够抗细菌病害以及其抗
菌谱还有待于进一步研究 .
参 考 文 献
图 5 转基因植株 1B 5 子代 (左 )和
对照 (右 )在黑胫病菌接种 7 d 后生长状态对比
蓝海燕 , 等 . 表达 爵1 , 3一葡聚糖酶几丁 质酶基因的转基 因烟草
及其抗真菌病的研究 . 遗传学报 , 2 0 0 , 2 7( 1 ) : 70
B r o e k a e r t W F
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环青海湖地绒草地蝗虫
遥感监测与预测
招 组 ,羊 索 浇
巍 犷t 执
本书以环青海湖地区为研究区 , 利用编者多年实地调 查所获得的
丰富资料 , 在依据昆虫学原理 与方法 的基础上 , 借助现代遥 感技术 ,
对研究区草地蝗虫的监测与预测进行了探讨 . 全书分 为上 、 下两篇 :
上篇包括第 1一 7 章 , 从整个研究 区角度 , 探讨 了草地蝗虫生境的监
测 、 评价方法以及对草地蝗虫发生的预测方法 ; 下篇包括第 8一1 章 ,
从样区研究角度 , 探讨了如何采用空间统计与空间插值方法分析草地
蝗虫的空间分布状况 , 并分析 了草地蝗虫与植被之间的相关性 , 以及
论述 了草地蝗虫发生的遥感监测原理与方法 .
本书可供从事蝗虫发生和防治及遥感应用领域的科研人员和实际
工作者参考 , 并可供相关领域 的高校师生参考 .
上海科举奴琳出版枕