全 文 ：植物生理与分子生物学学报 , oJ u rn a l of laP n t p hy s ot lo 舒 a n d物 le e u la r 丑ot ot 盯 20 07 , 33 (6 ) : 5 17一5 2 3
转望江南核糖体失活蛋白基因 ca s in 烟草及其对烟草花叶病毒的抗性
阮小蕾 , 刘丽芳 , 李华平 ’
华南农业大学植物病毒研究室 , 广州 5 10 6 4 2
摘要 : 通过构建植物表达载体 , 由农杆菌介导 , 将望江
南核糖体失活蛋白基因 。as s in 转入烟草。 PC R和 Sou ht e m
bl ot 杂交结果证明: 外源基因已经以单拷贝整合到烟草基
因组内 , 并且在后代发生遗传分离。 R T 一 P C R和 N o rt he m
bl ot 杂交结果显 示 : 外源基因可以正常转录。 用不 同浓度
的 TM V 机械摩擦接种转基因 T , 、 T : 代各 3个自交株系 ,
以非转基因烟草为阴性对照 , 实验结果表明转基因烟草
对 TM V 表现出不 同程度的抗性 。
关键词 : 转基因烟草 ; 核糖体失活蛋白 ; 抗病性评价 ;
烟草花叶病毒
中图分类号 : Q 7 4
核糖体失活蛋白(r ib o s o m e i n a e t i v a t i n g p r o t e i n ,
R IP )是一种能抑制真核细胞核糖体功能的毒蛋白(单
丽波和贾旭 20 00 ; N i e l s e n 和 B o s t o n 200 1 ) 。 它有 N -
糖普酶 (EC 3 . 2 . 2 . 22 )活性 , 专一的水解 2 85 r RN A 第
4 324 位的腺嗓吟碱基 , 使核糖体大亚基不能结合延
长因子 2 以至不可逆失活 , 进而抑制蛋白的合成 ;
但它不使自身的核糖体及 : R N A 失活 (侯法建和刘望
夷 19 99 ) 。 R IP 可以分为 2类 , 第 l 类 ( T y p e l )是单
肤链蛋白 , 具有 R N A N 一 糖普酶活性 , 在活性位点
区域内有高度保守的活性残基和二级结构 , 如天花
粉蛋白 ( t r i c h o s a n t h i n , T C s ) 、 商陆抗病毒蛋白
(p o k e w e e d a n t i v i r a l p r o t e i n
,
p A p )
、 皂草素 (s叩 o r i n ) 、
丝瓜毒蛋白( lu if n) 等 (李向东和刘望夷 19 7) 。 第 2 类
是异源二聚体蛋白 , 其 A 链具有 R N A N 一 糖普酶活
性 , B 链是一个对半乳糖专一的凝集素 。 这类 R I P
仅在 6 科 8种植物中发现 , 如蓖麻毒蛋自i(r ic n) 和相
思豆毒蛋白(a b r i n ) ( S t i r p e 和 B a t t e l l i 200 6 )等 。 研究
发现 , 很多 R I P 具有免疫抑制 、 抗病毒 、 抗肿瘤
等多方面的药理活性 (王玉露 20 03 ) 。 此外 , R IP 还
具有广谱的植物病毒抗性和抗多种植物病原真菌以及
农业害虫的活性 , 在植物保护中具有广泛的应用前
影王关林和方宏绮 20 0 1: C h a n d r a s h e k a r 和 s a t y a n a -
r a y a n a 2 0 0 6 )
。
通过基因工程将抗病基因导入植物己经成为抗
病育种的新途径 (王关林和方宏绮 20 01 ) 。 本研究室
通过分析多种不同来源的植物 R IP 的氨基酸序列 ,
据其保守区域设计了一对植物 R IP 通用简并引物 P l
和 P Z , 首次从苏木属 ( C a 、 、 i 。 )的药用植物望江南
(aC
s s ia 。 e c ide n t a l i s )中分离出一个 I型 R I P 基因—c a s s i。 。 此基因全长为 8 82 b p , 从它推导的氨基酸
序列与现已在 G en B a kn 中登录的 2个 R lp— p一hi if n和 t r i e h o s a n th i n ( T C S )的相似性分别只有 5 8 . 2% 和
3 4 7%
, 与 G e n B a n k 中其他 R IP 的序列无显著相似
性(阮小蕾等 20 0 7) 。 为研究该基因是否具有抗植物
病毒的功能 , 本研究构建了该基因的植物表达载
体 , 通过农杆菌叶盘转化法 , 将该基因转化入了烟
草 。 并通过接种 T M V 试验 , 初步表明该基因的转
化赋予了转基因烟草对 T M V 的较高抗性 。
1 材料与方法
L l 植物材料
普通烟草(从 e o t i a n a t o b a e u m )品种 ` K 3 26 ’ 组
培苗 (2 6 ’ C , 12 h 光照和 12 h 黑暗 , 一20 n m o l -m , s一 `)
和实生苗 ( 26一 3 0 0C , 防虫网室 ) 、 觅色黎 ( C h e n o 尸。 -
d i
u 。 。 m a ar n t i e o l o r ) ( 26一 30 0C , 防虫网室 )由本实验
室提 供 。
1
.
2 质粒和载体及试剂 .
质粒 pM D 一 s 一 e a s s i n 、 植物表达载体 p B l l Z I 和
T M V 抗血清 , 由本实验室提供 。
烟 一草花叶病毒 (t o b a e e o m o s a i e v i r u s , T M V )由本
实验室分离 、 鉴定和保存 , 使用前接种于普通烟 一草
品种 ` K 3 2 6 ’ L进行扩繁 。
E x T aq 酶 、 限制性内切酶 、 T 4 D N A 连接酶 ,
D N A 分子量标准参照物 入D N A /H i n d l l l 、 D L 2 0 0 O 、
D L 1500 0
,
R a n d o m P r im e r D N A L ab e l i
n g 儿 t V e r 2 . 0
2 0 0 7
一
0 5
一
2 8收到 , 2 0 0 7一 1 0 一 3 0 接受 。
坏l家自然科学基金项 11(N o . 3 0 3 7 0 9 2 9 )资助 。
* 通讯作者( E一 m a i l : h u a p i n g @ s e a u ` e d u ￡ n ; T e l : 0 2 0 一8 5 2 8 [ 1 0 7 ) 。
植物生理与分子生物学学报 3 3卷
购自 Ta Ka Ra (大连 )公司 。 N R A p ur e 植物 RN A提取
试剂盒购自广州英韦创津生物工程有限公司 ; PC R
产物回收试剂盒购自安徽优晶生物工程公司 ;反转
录酶 Re v e r Tr a Ac e 购自日本 TO YO B O 公司 ;放射
性同位素 [a 一 3, p ]d C T p ( 10 林C i单 L )购自北京亚辉公
司 ; 羊抗兔 gI G 购自广州美津生物工程公司 ; 竣节
青霉素 ( e a r b e n i e i l l i n , C a r b ) 、 卡那霉素(k a n a m y c in ,
K a n )
、 利福平 ( r i f a m p i e i n , R i f )等购自广州威佳公
司 ; 植物激素及其他分析纯生化试剂均购自广州精
科公 司 。
1
.
3 植物表达载体的构建
将表达载体 pB l l Z z 以肠 a l 和 s a e l 双酶切 , 切
掉 g us 基因 , 回收大的载体片段 。 将带有 。 as is 。 基
因的质粒 pM D 一 s 一 c a s s i n (阮小蕾等 200 7 )也用肋 a l 和
S a cl 双酶切 , 回收小的目的基因片段 。 将载体片段
与目的基因片段进行连接反应 , 经鉴定获得植物表
达载体 p B l l 2 1一 e a s s i n 。
L 4 烟草的转化
以常规叶片转化的方法转化普通烟 ` K 3 2 6 ’ 。
将烟草 ` K 3 2 6 ’ 组织培养苗的幼嫩叶片切成小块 ,
与转化了植物表达载体 p BI 121 一 ca s i。 的工程农杆菌
共培养 。 在筛选抗生素存在的条件下 , 诱导愈伤组
织并长出小芽 ; 将它诱导生根 , 获得转化烟草植
株 。
1
.
5 转基因烟草的 P C R 和 R T · P C R 检测
根据望江南核糖体失活蛋 白基 因 。 a 、 : i n
(G e n B a n k 的登录号为 EF 1834 6 8 )的全长 c D N A 序列
设计引物 P l 和 P Z 。 其引物序列为 : P l : 5 ’ 一 A T G
A A C A G A T T C A C A T T T C T C T C
一
3
’ 和 P Z : 5 ’ 一T T T
C A G T G T T T G T A G G A A T A C
一
3
’ 。 以 C T A B 法抽
提转化烟草的总 D N A 为模板 , lP 和 P Z为引物 , 在
U N O l l 型 P C R 扩增仪 (B i o m e t r a 公司)上进行 。 a s s i。 I
的扩增 。 其反应条件为 : 25 林L 体系中 , 模板 D N A
50 n g
,
l x p C R 缓冲液 , dN T p 1 m m o F L , l 林m o lL/
上游和下游引物 , l 个单位 E x T aq 酶 。 反应程序
为 : 94 oC 预变性 5 m i n ; 9 4 oC 变性 1 m i n , 5 0 oC
退火 1 m in , 7 2 ℃延伸 5 0 5 , 进行 3 0 个循环 ; 然
后 7 2 OC延伸 1 0 m i n 。
按试剂盒标示的方法提取转基因烟草的总 RN A
为模板 , P l 和 P Z 为引物 , 用两步法扩增 , 检测其
在烟草中的转录 。 其反转录条件为 : 1 0 林 L 体系
中 , 模板 100 n g , l x盯 缓冲液 , d N T p 1 m m o l /L ,
p Z I 林m o lzL , 10 0个单位 R e v e r T r a A e e 反转录酶
( 10o U扭L ) , 4 0 个单位 RN a s e in h ib i t o r (4 0 U小L ) 。
反应程序为 : 4 2 oC 6 0 m i n , 9 9 oC 5 m i n , 得到
c D N A
。 再以此为模板 , 进行 P C R 扩增 。
1
.
6 转基因烟草的 S o u th e r n b l o t 杂交和 N o r th e r n
b lo t 杂交
以 P I 和 p Z为引物 , 以质粒 pM D 一 s 一 c a s s i n 为模
板进行。 as 、 in 基因的 P C R 扩增 。 以回收的扩增产物
为模板 , 以试剂盒标示的方法合成并标记探针 。
提取转基因烟草的基因组 D N A , 用 S a 。 I进行
单酶切 ; 取酶切产物进行常规 S 。 u t h e r n b l o t 杂交。
提取转基因烟草的总 R N A 进行常规 N or the rn bl ot 杂
交 。
杂交结果用磷屏增感仪 (P er ik n lE m e ; 公司)进行
放射自显影 。
1
.
7 病毒接种和病情调查
以常规机械摩擦接种的方法接种烟草第 3 真叶
期幼苗顶部第 3 张平展叶片 , 每个株系接种 2 0 株 ,
接种后第 7 天开始做病害调查 。 病毒接种液分别稀
释 10 倍和 50 倍后接种觅色黎 , 通过统计其叶片上
产生的枯斑数来估计接种的病毒浓度 。
接种 7 d 后开始观察 、 分级记载病情 (田波和裴
美云 19 87) , 第 巧 天仍未出现症状的植株 , 再接种
一次 。 接种 3 0 d 后不显示症状的被认为是抗病植
株 。
L S 接种植株中病毒浓度的定量
接种 30 d 后 , 称取 0 . 1 9烟草新叶 (顶叶下第 3
张叶片 )接种觅色黎 , 每个株系接 3 张叶片 , s d 后
统计枯斑的总数目。 采集接种 30 d 后的烟草植株的
新生叶片 , 进行由辣根过氧化物标记的羊抗兔免疫
球蛋白的间接 EL IS A 法检测 。 以未转基因的健康植
株叶片和清水为阴性对照 , 烟草花叶病症状显著的
烟草病叶为阳性对照 。 具体操作参照 T h o t at p IP H y
( 19 95 )的方法 。 用 550 型酶标仪(B i o 一 R a d 公司 )在 405
n m 波长下测其 O D 值 , 重复 3 次 。
2 结果
2
.
1 植物表达载体 p B l l Zi 一 e a s s i n
按材料与方法的叙述构建 p B l l 21 一 ca s in 质粒 。
以酶切电泳 (肋叹 1与 aS d )方法来鉴定含有 ca s in 基因
6期 阮小蕾等 :转望江南核糖体失活蛋白基因 。s as i n烟草及其对烟草花叶病毒的抗性
的候选质粒 , 有约 1 0 0 0 b p 的特异条带存在 (图 1) ,
证明植物表达载体 p B l l ZI 一 ca s in 构建成功 。 图 2 显
示了这个质粒的部分结构 。
1 2 3 4 5
15 0 0 0 bP
2 0 0 0 b P—1 0 0 0 b P— 1 00 0 b P
图 1 植物表达载体 pBI 121 一 ca s in 转化子的电泳图
F ig
.
l E le e t r o P h o r e t o g r a m o f Pl a n t e x Pr e s s i o n v e e to r P B l l Z I
-
C a S S l n
l : D N A m a k e r D L 20 0 0 : 2
,
3 : P B l l Z I
一 c a s s in / Xb a l a n d S a c l : 4 :
P B l l Z I
一 e a s s i n ; 5 : D N A m a k e r D L 150 00
.
图 3 烟草转化植株的获得
F i g
.
3 Re g e n e r a ti o n o f t r a n s g e n i c t o b a e e o P la n t s
A : C a l lu s in du e e d i n s e r e e n i n g m e di u m : B : Y o u n g r e g e n e r a t io n
P la n ts i n di fe
r e n t i a l m e di u m ; C : R e g e n e r a ti o n Pl a n t w it h r o o t s
i n r o o t in g m e di u m ; D : N e g a ti v e C K i n s e re e n i n g m e d i u m
.
图 2 植物表达载体 p lB l ZI 一 ,’a s in 的完整表达盒
F i g
·
2 T h e w h o l e e x Pr e s s i o n b o x o f P la n t e x Pr e s s i o n v e e t o r
PB l l Z I
一` 、 a s s i n
植株的检测结果见图 4 。 转基因阳性的烟草能扩增
出长度为 8 2 bp 的特异条带 , 而作为阴性对照的非
转基因烟草则没有特异条带的出现 , 与预期结果一
致 。 本研究从 T 。代烟草中筛选到 17 株 P C R 为阳性
的植株 , 将之编号为 1一 17 。
。一4一,一.2 2 转基因烟草植株在含有 K a n 7 5 m g /m L 和 C a r b 250 m g /m L 的筛选平板 _ 1 , 转化叶盘在共培养后 10 d 开始长出愈伤
组织 。 约 2 1 d 后 , 茂密的愈伤组织中长出很多小
芽 (图 3 A ) , 将小芽切块进行继代培养 。 14 d 后 , 有
成形的烟草植株 长出(图 3 B ) 。 将各株分开 , 移入生
根培养基中培养 。 5 6 d 之后 , 长成根系发育良好的
完整植株 (图 3 c ) 。 对照叶盘接种后在抗生素的筛选 图 4
压下渐渐发黄 , 最终白化死 亡 (图 3 D o) iF .g 4
将经转化的烟草组织培养苗移出 , 分单株栽种 il en s
一 1 0 0 0 b P一 7 5 0 b P
部分 T 。代转基因植株的 P C R 鉴定的电泳图谱
E l e e tor P hoer t
o g r am
o f CP R
a n al y s is o f s o m e 0T tr an
s fo mr
e d
于防虫网室内 。 组织培养苗扎根生长后 , 即获得 0T
代烟 草苗 。 收取其自交种子 , 单粒播种 , 得到 T ,
代烟草苗 。 收取其 自交种子单粒播种后 , 得到 T : 代
烟 一学二植株 。
.2 3 转基因烟草含有 ca s in 基因
用 P c R 的方法 , 检测 T O 、 T , 和 T : 代转基因植
株中外源基因 ca 、 、 in 的插入情况 。 T。代部分转基因
l一 4 : T o Pl a n ts o f tr a n s fo r m e d li n e s ; 5 : D N A m a r ke r D L 20 00
.
经过 S o ut he nr bl ot 杂交检测 , 发现这 17 株烟草
均能检测到杂交信号 ; 所有信号都为单一条带 (图
5 )
。 这表明外源基因以单拷贝整合于植株的基因组
中 。
利用 R T 一 PC R 的方法 , 检测这 17 株烟草中外源
植物生理与分子生物学学报 3 3 卷
23 4 5 6 7
图 5 部分 T 。代转基因植株的S ou t he m bl ot 杂交结果
i Fg
·
5 S o u th e rn bl o t a n al ys is of e hro m
o s o m e o f s o me TO Plan
t s o f
tr a n s g e n i e l in e s di g e s t e d b ySa e l
1一 6 : T o Pl a n t s o f t r a n s g e n i e l i n e s : 7: No n t r a n s fo rm e d e o n t r o l
l Pa n t
.
2
.
4 T
: 和 T : 代植株中 c a s s in 基因的分离
为了检测 。 as : in 基因在转基因植株中的分离情
况 , 分别取 3个自交的 T ,株系 : T广 l 、 T ,一 8 、 T : -
9和 3个自交的 T : 株系 : T Z一 8一 2 、 T Z一 s 一 5 、 T Z一 8一 s ,
进行 P C R , 统计其阳性检出率并进行 X Z检测 。 结
果 (表 1 )表明 : 在所有的自交系中 , 。 as : in 基因的分
离比均符合 3 : 1孟得尔分离规律。 这再一次表明外源
基因在植物染色体上是单拷贝插入 , 而且单拷贝基
因在后代中分离 。
基因的转录情况 (图 6) 。 结果发现其中有 7 株能扩增
出长度为 8 82 bp 的特异条带 , 其编号分别为 1 、 5 、
9
、
1 1
、
1 2
、
1 5
。 在这 7 个株系的自交后代
、
T : 的各株系中筛选出 R T 一 P C R 呈阳性的植株进
行下面的实验 。
表 I T ,和 T Z代 ca s in 转基因烟草中外源基因的分离
T a b l e 1 S e g er g a t i o n r a t i o s o f t r a n s g e n e i n T I a n d T Z li n e s
in te g r a te d w iht c a s s i n
Se g er g a
一
P r e dic te d
L i n e s oT t
a l p o s i ti v e t io n s e g r e g a ti o n XZ
r a ti o r a t i o
、l
。。T
丹、à凡j内、门é内伪n曰,`n八内j1QZ,一,、à,`气à今jùn2689310
0八ù8CUonnU
,、à,内、ù内é傀J,ù
,白ù、公一N-ó.
山.CI西O少OCQ八广-1 wel尸户、KTC1 2 3 4 5 6
1 000 b P
7 5 0 b P
0
.
8 77 < 3
.
84
0
.
2 19 < 3
.
84
0
.
03 5 < 3 84
0
.
19 7 < 3
.
84
0
.
16 5 < 3
.
84
0
.
16 5 < 3
.
84
0
图 6 部分 T。和 T ,代转基因植株的 R T一 P c R鉴定的电泳图谱
F i g
.
6 E le e tr o Ph o r e to g r a m o f RT
一
PC R a n a l y s i s o f s o me T
o a n d
T 一 tr an s fo mr
e d l in e s
l一 : So m e tr a n s fo mr e d li n e s o f 0T an d T l g e n e r iat o n s : 5 : N e g a t iv e
c o n t r o l ; 6: D N A m ar k e r D L 20() 0
.
对 R T 一 P C R 检测呈阳性的植株及其自交后代进
行 N o r t h e r n b l o t 杂交检测 (图 7 ) 。 其结果是有 5 个植
株及其自交 T , 、 T : 代植株中能检测到杂交信号 , 表
明外源基因在植株中确实进行了转录 。 其编号分别
为 1 、 8 、 9 、 1 2 、 1 5 。
1 2 3 4 5 6 7
图 7 部分 T 。 和 T .代转基因植株的N o r th e rn b zo t杂交结果
F i g
.
7 N o rt h e rn b lo t a n a l y s i s o f s o m e T
o a n d T 一 t r a n s g e n i e li n e s
l一 6 : S o m e t r a n s g e n ie l i n e s o f T o a n d T I g e n e r a t i o n s : 7 :
N o n t r a n s fo mr
e d c o n t r o l P la n t
.
.2 5 转基因烟草对 T M V 的抗性
为检测转基因烟草抗病毒的能力 , 对 。 as 、 in 基
因确有转录的 T ,代 3个自交株系 T ;一 1、 T广 8 、 T :一 9
及 T : 代 3个自交株系 T Z一 s 一 2 、 T Z一 8一 5 和 T Z一 s一 8 的转
基因植株接种 T M V 。 接种液设 2个浓度 , 其中病
毒的相对含量分别为 : 1 0 倍稀释液产生枯斑数为
3 4 8个 , 5 0 倍稀释液产生枯斑数 1 5 8 个 。
接种结果表 明 , 所有的转基 因烟草植株对
T M V 均具抗性 , 但抗性程度有差异 。 在不同的病
毒接种浓度下 , 转基因烟草的感病程度随接种浓度
的上升而加重 。 对于较高浓度的病毒 , 转基因植株
的抗性程度要低于其对较低浓度的病毒的抗性 。
在病毒浓度较高 (病叶汁液 1 0 x 液 )时 , 转基因
T ,代 3 个株系中约有 10% 一 25 % 的植株表现轻微症
状 , 病情的严重程度为 1一 2 级 。 与对照相比 , 症
状出现迟 4一 13 d 。 其中株系 T l一 8 的植株中仅有 2株
表现轻微症状 , 推迟症状出现 13 d ; 其余植株在接
种的 3 0 d 内未表现症状 。 其 3 个自交株系 T Z一 8 一 2 、
T Z
一
8
一
5和 T Z一 8一 8 在接种后仅有 5%一 10% 的植株表现轻
6期 阮小蕾等: 转望江南核糖体失活蛋白基因 。sa s in烟草及其对烟草花叶病毒的抗性
微症状 , 病情的严重程度为 1级 。 症状出现与对照
相迟 1 1一 14 d 。 在 T Z一 8 的子代中 , 筛选出一株高抗
TM v 的烟草植株 , 其编号为 T Z一8 一 2 一 1 , 在接种的 7 0
d 内未表现任何症状 。 接种后未发病的新生叶片的
间接 E L IS A 检测结果显示 , 所有的转基因烟草内
T M V 的浓度均明显 t匕非转基因植株的低 , 与枯斑测
定结果一致 (表 2) 。 其中 T ,一 8表现为高抗 , 体内TM v
的积累量仅为对照的 or . 5% ; T I一 9 抗性较低 , T M v
的含量为对照的 3 5 . 7% 。
在病毒浓度较低 (病叶汁液 50 、 液)时 , T ,代 3个
株系中约有 10 % 一巧% 的植株表现轻微症状 , 病情的
严重程度为 l 一 2 级 。 与未经转基因的植株相比 , 延
迟症状出现 4一 12 d 。 三个 T : 代自交株系接种后都仅
有 5 % 的植株表现轻微症状 , 病情的严重程度为 1
级 。 与对照相比 , 症状出现延迟 1 1一 15 d 。 而 T Z -
8
一
2
一
1 的植株在接种后 70 d 时尚未表现出症状 。 对接
种后未发病植株的新生叶片的间接 E L is A 检测结果
显示 , 所有的转基因烟草内 TM V 的浓度均明显低于
未经转基 因的植株 , 与对枯斑 的测定结果一致
(表 2 ) 。
3 讨论
众多 R IP 由于具有抑制免疫 、 抗病毒 、 抗肿瘤
等多方面的药理活性 , 因而在医学领域中研究较多
(王玉露 20 03 : 于海等 20 05 : S t i印 e 和 B a t t e ll i 2 00 6 ) 。
相比较而言 , 在植物保护领域的研究较少 。 从现有
的研究结果看 , R IP s 不仅抗病毒 , 还可抗真菌 、 细
菌和植物寄生线虫等众多有害植物病原生物 (王关林
和方宏荡 20 0 1 : 王临旭等 20 0 2 ) 。 L o dg e 等( 19 93 )首
次报告转美洲商陆R IP基因植株显示出对植物病毒侵
染具广谱抗性 ; M a s s im o 等 ( 1997 )报道转玉米 b一 32 基
因的烟草对丝核真菌有耐病性 ; J a c h 等 ( 19 95 )报告
大麦 I 型 R I P 单基因转化烟草 , 对立枯丝核菌
沂人i z o e t o n ia s o la n i )等真菌病原具有一定的抗性 。 冯
道荣等( 19 9 )报道当班P 与真菌细胞壁的水解酶如几
丁质酶 、 p一 l , 3 一 葡聚糖酶等协同作用时 , 抗真菌效
果更为显著 。 林毅等 ( 2 0 0 4) 克隆了绞股蓝 ( G y n 口 -
s t e m m a 夕e n t即 h夕l l u m )的 R IP 基因 , 并将它转化进了
烟草 , 但是尚未进行抗病性测定 。
望江南中班P基因 。 as is n 与已报道的 R IP 有较大
的序列差异性 (阮小蕾等 20 0 7) 。 为了测定该基因在
表 Z T ; 和 T : 代转基因烟草植株对 TM v 的抗性
T a b le 2 Re s i s t a n t Ph e n o ty Pe s o f T 一a n d T Z t r a n s g e n ie li n e s e h a l le n g e d w iht TM V
L i fl e S
T i te r
(TM V )
S u s e e P ti b le
(% )
D a tC
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(d )
D i s e a s e i n d e x b
N u m b e r o f n e e or s is
c
(土 S E )
O D扔5
(土 S E )
T ,
一
1 10 x 2 0 12 1 2 1
.
00 (士 1
.
5 3) 0
.
2 11 (士 0
.
0 0 1)
5 0 x 15 14 1 2 0
.
00 (士 1
.
5 3) 0
.
2 13 (士 0
.
00 1 )
T :
一
8 10 x 10 20 1 18
.
95 (士 1
.
8 0) 0
.
2 0 1 (士 0
.
00 2)
5 0 x 10 20 1 18 33 (士 1
.
2 0) 0
.
195 (土 0 0 0 2 )
T l
一
9 10火 2 5 1 1 2 64 . 6 3 (士 2习 6) O石 83 (士 0 . 0 0 2 )
5 0 x 15 12 2 5 8
.
33 (土 3
.
18) 0
.
66 3 (土 0
.
0 0 2)
T Z
一
8
一
2 10 x 10 18 1 22
,
27 (士 1 3 6) 0 2 63 (土 0 00 1)
5 0 x 5 20 1 2 1
.
6 7 (土 1
.
7 6 ) 0 2 0 3 (土0
.
0 0 1)
T Z
一
8
一
5 10 x 5 19 1 2 1
.
9 5 (土 1
.
45 ) 0
.
2 2 1 (土0
.
0 0 1 )
5 0 x 5 19 1 2 1
.
3 3 (士 1
.
87 ) 0
.
193 (士0
.
0 0 1 )
T Z
一
8
一
8 10 x 10 2 1 1 22月5 (士2 . 19 ) 0 . 2 82 (士0 . 0 02 )
50 x 5 2 3 1 22
.
0 5 (士2
.
52 ) 0
.
2 32 (土0
.
00 2 )
C K 10 x 100 7 4 17 1
.
0 0 (土 2
.
08 ) 1
.
9 12 (士0刀0 2 )
50 x 10 0 8 4 14 8
.
00 (土 1
.
53 ) 1
.
5 12 (士 0
.
00 1 )
T i te r o f T MV fo r i n o e u l a ti o n a s IO
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一
le s s
t r a n s g e n i e to b a e e o y o u n g l e a f 30 T d a y s P a s t in o e u l a t io n w i th TM V d : O D
4 o s v a l u e d e te r m i n e d b y in d i r e e t
一
E L IS A
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T h e d a ta i n t h e
Par e n th e s is w a s s t a n d a r d e r o r o f t h e m e a n
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植物生理与分子生物学学报 33 卷
植物中的的抗病性能 , 本研究构建了该基因的植物
表达载体(图 l )并转入烟草 。 通过 p C R 、 S o u th e r n
b l o t 杂交 、 R T 一 P C R 、 N o r th e r n b l o t 杂交和遗传分离
的分析 , 证明外源基因已经以单拷贝整合到烟草的
基因组中 , 并能正常转录 (图 4一 7) 。 。 as : in 接种实验
表明 : 转基因烟草对 T M V 具有明显的抗性。 在发
病率 、 症状始发期 、 发病程度等各项指标上转基因
植株比对照均有较大改善(表 2 ) 。 这初步说明携带
ca s in 基因的转基因植株所具备的抗 TM V 活性是由
于外源基因的随机插入所致 , 证实植物来源的不同
R I P基因可以作为抗病毒转基因的候补基因。
在转基因植物中 , 表达 R IP 基因的研究面临的
一个问题是 R IP 对受体植物的毒性 。 美洲商陆 R IP
在转基因植物中低水平表达时 , 可以提高植物对几
种病毒的抗性而不对受体植物产生明显伤害 , 但高
水平表达时可使植物严重矮化 、 叶片畸形 (w an g 等
一99 8 ) 。 L a m 等 ( 199 6 )的研究结果也显示 : 天花粉蛋
白基因对烟草宿主也有一定的伤害 。 在本研究中 ,
转基因植物在生长过程中没有表现任何异常 , 转基
因植物的开花 、 种子成熟 、 结实率等生理过程和指
标与对照非转基因植物未表现差异 (结果未显示 ) 。
这初步说明。 as is n 的表达对烟草植株的生长无显著影
口向。
为了证实 ca s in 转基因植株所具备的 TM V 抗性
确实是由于 c a s : in 的插入所导致的 , 下一步的研究
工作将从以下 3个方面进行 : ( l) 在获得 。 as 、 in 基因
抗血清的基础上进行 w e s t e r n b l o t 杂交和 E L IS A 分
析 , 以确定 C as s in 表达量与转基因烟草植株对 T M V
抗性的关系 ; ( 2) 对 。 as sl’ n 基因做原核表达 , 获得其
表达蛋白 , 进行抑菌实验 , 以确定 C as s in 蛋白在体
外的抑菌能力和范围 ; ( 3) 进一步分析转基因烟草对
其他病毒 、 真菌和细菌等病原生物的抗性 。 这些工
作的进展以及本研究所获得的高抗 TM V 的转基因株
系 , 将为进一步研究 ca s in 基因的功能、 并将它应
用于作物转基因抗病虫害育种等工作奠定重要的基
础 。
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s id e er d a s th e h i gh l y r e s is t a n t t y P e w i th a d e l a y o f
4一 13 d in d e v e lo Pm e n t o f s y m P t o m s a n d 10% 一
2 5% o f t e s t P la n t s w e r e i n fe e t e d
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g e n ie e o n tr o l Pl an t
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