全 文 ：２０１４年１月 四川大学学报（自然科学版） Ｊａｎ．２０１４
第５１卷　第１期 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏｌ．５１　Ｎｏ．１
收稿日期：２０１３－０１－２５
基金项目：国家自然科学基金（３１１７１５８６）；国家转基因重大专项（２０１１ＺＸ０８００９－００３－００２）
作者简介：陶志文（１９８５－），男，硕士，研究方向为生物化学与分子生物学．
通讯作者：杨毅．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｙｉ５２８＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ
ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０４９０－６７５６．２０１４．０１．３２
拟南芥ＡｔＭＹＢ４４与ＲＣＡＲ１相互作用的研究
陶志文，李德款，姜　欣，袁德志，杨　毅
（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都６１００６４）
摘　要：以拟南芥脱落酸（ＡＢＡ）受体ＲＣＡＲ１和以文为诱饵蛋白质，利用酵母双杂交（Ｙ２Ｈ）
技术筛选出转录因子ＡｔＭＹＢ４４，本文进行了ｐｕｌ　ｄｏｗｎ及重转酵母验证，确定它们之间的关
系，实验结果显示ＲＣＡＲ１与ＡｔＭＹＢ４４之间确实存在相互作用．此外，为了确定ＲＣＡＲ１在
ＡｔＭＹＢ４４上的作用区域，构建了不同长度的ＡｔＭＹＢ４４ｃＤＮＡ序列的ＰＧＡＤＴ７载体，利用
酵母双杂交实验分析，表明只有ＡｔＭＹＢ４４的Ｎ端５４～１０５氨基酸序列与ＲＣＡＲ１存在相互
作用．
关键词：蛋白沉降；酵母双杂交；ＲＣＡＲ１；ＡｔＭＹＢ４４
中图分类号：Ｑ７８　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：０４９０－６７５６（２０１４）０１－０１８９－０５
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｓｔｕｄｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＡｔＭＹＢ４４　ａｎｄ　ＲＣＡＲ１ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
ＴＡＯＺｈｉＷｅｎ，ＬＩ　Ｄｅ－Ｋｕａｎ，ＪＩＡＮＧ　Ｘｉｎ，ＹＵＡＮ　Ｄｅ－Ｚｈｉ，ＹＡＮＧ　Ｙｉ
（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｃｏ－Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００６４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ＡｔＭＹＢ４４ｆｏｕｎｄ　ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ　ｗａｓ　ａｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｐａｒｔｎｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂａｉｔ　ｐｒｏ－
ｔｅｉｎ　ＡＢＡ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ＲＣＡＲ１ｂｙ　ｙｅａｓｔ　ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｃｏｎｆｉｒｍ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅ－
ｔｗｅｅｎ　ｔｈｅｍ，ｐｕｌ　ｄｏｗｎ　ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ｒｅ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｙｅａｓｔ　ａｓｓａｙ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ
ＡｔＭＹＢ４４ｉｎｄｅｅｄ　ｉｎｔｅｒａｃｔｓ　ｗｉｔｈ　ＲＣＡＲ１．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ＲＣＡＲ１ａｔ
ＡｔＭＹＢ４４，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ＡｔＭＹＢ４４ｃＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｏｆ　ＰＧＡＤＴ７ｐｌａｓｍｉｄ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎ－
ｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｂｙ　Ｙ２Ｈａｎａｌｙｓｉｓ，ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ａｒｅａ　ｉｓ　ｌｏｃａｔｅｄ　ａｔ　５４～１０５ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
ｏｆ　ＡｔＭＹＢ４４Ｎｔｅｒｍｉｎｕｓ　ｗｉｔｈ　ＲＣＡＲ１．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｕｌ　ｄｏｗｎ；Ｙ２Ｈ；ＲＣＡＲ１；ＡｔＭＹＢ４４
１　引　言
在植物体内，植物激素脱落酸（ＡＢＡ）调控许
多基因的表达，它的关键作用是调控植物的抗逆
性及植物的生长发育［１］．在整个ＡＢＡ信号传递过
程中，ＡＢＡ受体是唯一直接感受 ＡＢＡ信号的元
件，是传递ＡＢＡ信号的起始，起到一个开关的作
用．因此探究与ＡＢＡ受体相互作用的蛋白，对深
入了解ＡＢＡ信号转导途径，认识其作用机制具有
至关重要的作用［２］．
目前，一些ＡＢＡ受体已有报道，但仍有一些
尚未被证实［１］．２００９年，一种含有ＳＴＡＲＴ结构
域 蛋 白 家 族， 命 名 为 ＰＹＲ／ＰＹＬｓ（也 称 为
ＲＣＡＲｓ），被鉴定为ＡＢＡ受体蛋白．研究者发现
一些ＰＹＲ／ＰＹＬ蛋白既能与ＰＰ２Ｃ发生相互作用，
又具有抑制它的活性［３－５］．该ＰＰ２Ｃ（ＡＢＩ１、ＡＢＩ２、
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５１卷
ＨＡＢ１和 ＰＰ２ＣＡ／ＡＨＧ３）负调控 ＡＢＡ 反应［５］．
相反地，能被ＡＢＡ激活的ＳｎＲＫ２是ＡＢＡ信号通
路的正调控因子［１］．ＰＹＲ／ＰＹＬ对ＰＰ２Ｃ的抑制作
用导致ＳｎＲＫ２激酶（包括ＳｎＲＫ２．２、ＳｎＲＫ２．３和
ＳｎＲＫ２．６）成功激活，它们使一种称为 ＡＢＦｓ／
ＡＲＥＢｓ的ｂＺＩＰ型转录因子磷酸化［６，７］．该ｂＺＩＰ
结合在 ＡＢＡ 反应的启动子元件上，从而诱导
ＡＢＡ应答基因的表达［８］；然而ＡＢＡ信号通路中仍
然有许多的调控因子尚不清楚．
鉴于以上原因，本实验室以拟南芥ＡＢＡ受体
ＲＣＡＲ１为诱饵蛋白质，利用酵母双杂交技术筛选
出了ＡｔＭＹＢ４４转录因子．由于酵母双杂交技术
存在缺陷，可能存在假阳性；为了排除假阳性，本
文进行了ｐｕｌ　ｄｏｗｎ实验和酵母重转验证实验确
定它们之间的相互作用，实验结果显示 ＲＣＡＲ１
与ＡｔＭＹＢ４４之间确实存在相互作用．为了进一
步确定ＲＣＡＲ１在ＡｔＭＹＢ４４上的作用区域，本文
构建了不同长度的 ＡｔＭＹＢ４４ｃＤＮＡ 序 列 的
ＰＧＡＤＴ７载体，利用酵母双杂交实验分析，表明
只有 ＡｔＭＹＢ４４的 Ｎ 端５４～１０５氨基酸序列与
ＲＣＡＲ１存在相互作用．
２　材料与方法
２．１　材料
Ｒｏｓｓｅｔａ菌株，ＰＥＴ２８ａ、ＰＧＥＸ－６Ｐ－１载体为
本实验室保存．ＧＳＴ－ｒｅｓｉｎ、Ｈｉｓ－ｒｅｓｉｎ蛋白质纯化
柱购自ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司．Ｈｉｓ抗体购自Ｓｉｇｍａ公
司．ＰＶＤＦ膜购自罗氏．ＤＡＢ显色购自北京康为
世纪．酵母双杂交系统及酵母相关产品购自Ｃｌｏｎ－
ｔｅｃｈ公司．ＤＭＳＯ购自Ｓｉｇｍａ公司，其它的试剂
购自成都博瑞克生物技术有限公司．引物合成及
测序由华大基因公司完成．
２．２　方法
２．２．１　目的基因的分离与载体的构建　参照本实
验之前克隆得到的拟南芥 ＡｔＭＹＢ４４、ＲＣＡＲ１基
因的方法［２］，得到ＡｔＭＹＢ４４与ＲＣＡＲ１基因序列
全 长． 构 建 ＰＥＴ２８ａ－ＡｔＭＹＢ４４、ＰＧＥＸ－６Ｐ－１－
ＲＣＡＲ１重组表达载体，然后采用亲和层析纯化方
法，分别得到 Ｈｉｓ－ＡｔＭＹＢ４４、ＧＳＴ－ＲＣＡＲ１融合
蛋白；构建ＰＧＢＫＴ７－ＲＣＡＲ１诱饵载体的实验方
法引用参考文献［２］．根据文献的报道，对 Ａｔ－
ＭＹＢ４４蛋白家族的基因序列进行了比对（图２），
并用ＳＭＡＲＴ软件对 ＡｔＭＹＢ４４的基因结构域进
行预测，将 ＡｔＭＹＢ４４的氨基酸序列分成五个部
分 （图 １）：ＡｔＭＹＢ４４１－５４、ＡｔＭＹＢ４４１－１０５、Ａｔ－
ＭＹＢ４４５４－１０５、ＡｔＭＹＢ４４５４－３０５、ＡｔＭＹＢ４４１０５－３０５．分别
设计引物，ＰＣＲ扩增，酶切后连接ＰＧＡＤＴ７形成
融合载体：ＰＧＡＤＴ７－ＡｔＭＹＢ４４１－５４、ＰＧＡＤＴ７－Ａｔ－
ＭＹＢ４４１－１０５、ＰＧＡＤＴ７－ＡｔＭＹＢ４４５４－１０５、ＰＧＡＤＴ７－
ＡｔＭＹＢ４４５４－３０５、ＰＧＡＤＴ７－ＡｔＭＹＢ４４１０５－３０５．
图１　不同长度的ＡｔＭＹＢ４４氨基酸片段ＡＤ载体的
融合蛋白
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ＡＤ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ＡｔＭＹＢ４４ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
２．２．２　蛋白质纯化及Ｐｕｌ　ｄｏｗｎ　蛋白质纯化过
程方法参考文献［９］，分别得到较纯的蛋白０．３８３６
ｍｇ／ｍＬ　Ｈｉｓ－ＡｔＭＹＢ４４、０．４０１４ｍｇ／ｍＬ　ＧＳＴ（用
作对照组）、０．４０１０ｍｇ／ｍＬ　ＧＳＴ－ＲＣＡＲ１．分别取
５０μＬ的ＧＳＴ、ＧＳＴ－ＲＣＡＲ１蛋白质，向其中各加
入４０μＬ谷胱甘肽－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ介质及１３μＬ的
Ｈｉｓ－ＡｔＭＹＢ４４蛋白质，然后各补足Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ
ｂｕｆｆｅｒ（５０ ｍｍｏｌ　Ｔｒｉｓ－Ｃｌ，ｐＨ　７．５，１００ ｍｍｏｌ
ＮａＣｌ，１ｍｍｏｌ　ＥＤＴＡＮａ２，１ｍｍｏｌ　ＤＴＴ，０．２％
Ｔｒｉｓｔｏｎ　Ｘ－１００）到５００μＬ的体系；将它们在７０ｒ／
ｍｉｎ，４℃ 孵育４ｈ．用 Ｗａｓｈｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ
Ｔｒｉｓ－Ｃｌ，ｐＨ　７．５，５００ｍｍｏｌ　ＮａＣｌ，１ｍｍｏｌ　ＥＤ－
ＴＡＮａ２，１ｍｍｏｌ　ＤＴＴ，０．１％Ｔｒｉｓｔｏｎ　Ｘ－１００）洗６
次，每次洗５ｍｉｎ，最后低速离心１ｍｉｎ得到蛋白
质复合体．然后加入３０μＬ　１×ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ制
样，取１．３μＬ　Ｈｉｓ－ＡｔＭＹＢ４４制作１０％Ｉｎｐｕｔ，
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳及ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测按参考
文献［１０］进行，以 Ｈｉｓ－Ｔａｇ特异性抗体为检测抗
体．
２．２．３　酵母转化　酵母转化步骤按照 ＣＬＯＮ－
ＴＥＣＨ 操作手册进行．以 ＰＧＢＫＴ７－ＲＣＡＲ１ ＋
ＰＧＡＤＴ７－ＡｔＭＹＢ４４１～３０５共转为正对照；以 ＰＧ－
ＢＫＴ７－ＲＣＡＲ１ ＋ ＰＧＡＤＴ７ 与 ＰＧＢＫＴ７ ＋
ＰＧＡＤＴ７－ＡｔＭＹＢ４４１～３０５为负对照．将图１所构建
０９１
第１期 　　 陶志文等：拟南芥ＡｔＭＹＢ４４与ＲＣＡＲ１相互作用的研究 　
的 ＡｔＭＹＢ４４不同长度的氨基酸片段融合载体
ＡＤ 分 别 与 ＰＧＢＫＴ７－ＲＣＡＲ１ 共 转 到 酵 母 菌
ＡＨ１０９中，涂在缺陷性培养基ＳＤ／Ｌｅｕ／Ｔｒｐ上
３０℃培养３～４ｄ，然后分别挑取单克隆菌涂在
ＳＤ／Ｌｅｕ／Ｔｒｐ与ＳＤ／Ｌｅｕ／Ｔｒｐ／Ｈｉｓ／Ａｄｅ平板上
３０℃培养３～４ｄ，能在ＳＤ／Ｌｅｕ／Ｔｒｐ／Ｈｉｓ／Ａｄｅ
平板上长出白色光滑、丘状隆起状的菌落就是阳性
克隆菌．
２．２．４　β－半乳糖苷酶的定性分析　β－半乳糖苷酶
的定性分析操作方法及Ｚ　ｂｕｆｆｅｒ／Ｘ－ｇａｌ试剂的配
制方法参考ＣＬＯＮＴＥＣＨ的操作手册．
３　结果与分析
３．１　ＡｔＭＹＢ４４是典型的Ｒ２Ｒ３型转录因子
ＡｔＭＹＢ４４基因的开放阅读框包含９１８对碱
基，共编码３０５个氨基酸．它是典型的Ｒ２Ｒ３型转
录因子，在拟南芥中属于Ｓ２２亚家族，这个家族
包 括：ＡｔＭＹＢ４４、ＡｔＭＹＢ７０、ＡｔＭＹＢ７３、Ａｔ－
ＭＹＢ７７，它们都具有典型的 ＭＹＢ结构域和两个
保守的基元 ＴＧＬＹＭＳＰｘＳＰ（ｍ１）与 ＧｘＦＭｘＶ－
ＶＱＥＭＩｘｘＥＶＲＳＹＭ（ｍ２）（图２），Ｒ２Ｒ３这两个保
守的结构域都含有保守的色氨酸．
图２　Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ的Ｓ２２家族序列比对
其中Ｒ２、Ｒ３是典型的 ＭＹＢ结构域，星号表示保守的色氨酸，ｍ１、ｍ２为它们共同的保守基元
Ｆｉｇ．２　Ｓｕｂｇｒｏｕｐ２２ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ
Ｒ２ａｎｄ　Ｒ３ａｒｅ　ｔｙｐｉｃａｌ　ＭＹＢ　ｄｏｍａｉｎ，ｔｈｅ　ａｓｔｅｒｉｓｋ　ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，ｍ１ａｎｄ　ｍ２ａｓ　ｔｈｅｉｒ　ｃｏｍ－
ｍｏｎ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｍｏｔｉｆ
３．２　Ｐｕｌ　ｄｏｗｎ验证ＡｔＭＹＢ４４与ＲＣＡＲ１之间的
相互作用
此部分的分析及作图方法参考文献［１０］，首
先，采用亲和层析纯化方法，得到了纯度较高的
三个蛋白，结果如图３－Ａ－（ｂ）所示：从左至右分别
是ＧＳＴ－ＲＣＡＲ１、ＧＳＴ、Ｈｉｓ－ＡｔＭＹＢ４４；其次，采用
Ｈｉｓ－Ｔａｇ抗体检测了Ｐｕｌ　ｄｏｗｎ实验得到的相互
作用蛋白复合物，如图３－Ａ－（ａ）所示：从左至右分
别是ＧＳＴ－ＲＣＡＲ１＋ Ｈｉｓ－ＡｔＭＹＢ４４、ＧＳＴ＋ Ａｔ－
ＭＹＢ４４、１０％Ｉｎｐｕｔ，其中１０％Ｉｎｐｕｔ作为阳性对
照；图３－Ｂ是用Ｂａｎｄｓｃａｎ软件对图３－Ａ－（ａ）中蛋白
条带的灰度统计结果；根据已得到的实验结果，可
以确定：ＲＣＡＲ１与 ＡｔＭＹＢ４４之间在体外的确存
在相互作用．
３．３　ＡｔＭＹＢ４４与ＲＣＡＲ１相互作用区域
按照实验方法２．２．３挑取单克隆酵母菌，３０℃
培养３～４ｄ，经Ｈｉｓ／Ａｄｅ－ｔａｇ检测．结果发现：所有
的转化子在ＳＤ／Ｔｒｐ／Ｌｅｕ培养基上长出白色光滑、
丘状隆起状的菌落，这表明共转成功，并且 Ａｔ－
ＭＹＢ４４和ＲＣＡＲ１对酵母菌没有毒性（图４－Ａ）；Ａｔ－
１９１
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５１卷
ＭＹＢ４４１～１０５、ＡｔＭＹＢ４４５４～１０５、ＡｔＭＹＢ４４５４～３０５及全长
ＡｔＭＹＢ４４１～３０５转化子可以在四缺的平板上长出白色
光滑、丘状隆起状的菌落（图４－Ｂ），初步表明在这四
个转化子的ＡｔＭＹＢ４４的氨基酸序列中都包括可以
与ＲＣＡＲ１发生相互作用从而启动 Ｈｉｓ／Ａｄｅ－ｔａｇ报
告基因表达的蛋白质功能域．
图３　ＧＳＴ　Ｐｕｌ　ｄｏｗｎ体外实验检测ＡｔＭＹＢ４４与ＲＣＡＲ１之间相互作用
Ｆｉｇ．３　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＡｔＭＹＢ４４ａｎｄ　ＲＣＡＲ１ｂｙ　ＧＳＴ　Ｐｕｌ　ｄｏｗｎ　ａｓｓａｙ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
Ａ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＡｔＭＹＢ４４ａｎｄ　ＲＣＡＲ１ｂｙ　Ｈｉｓ　ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｈｉｓ－ＡＴＭＹＢ４４＋
ＧＳＴ　ａｓ　ａ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ；　Ｂ：ＡｔＭＹＢ４４ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　Ｂａｎｄｓｃａｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅ，ｔｈｅ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ
１０％Ｉｎｐｕｔ　ｂｅｉｎｇ　ｓｅｔ　ｔｏ　１００，ｔｈｅ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ＡｔＭＹＢ４４ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ＧＳＴ　ｂｅｉｎｇ　ｚｅｒｏ，ｔｈｅ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　Ａｔ－
ＭＹＢ４４ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ＧＳＴ－ＲＣＡＲ１ｂｅｉｎｇ　１７．
３．４　β－半乳糖苷酶的定性分析
采用滤纸印迹法定性检测转化酵母菌落ＬａｃＺ
报告基因的表达，结果表明：ＡｔＭＹＢ４４１～１０５、Ａｔ－
ＭＹＢ４４５４～１０５、ＡｔＭＹＢ４４５４～３０５转化子的酵母菌通过
Ｘ－ｇａｌ显色后，其菌落都可以在滤纸上显示为蓝
色，与正对照ＡｔＭＹＢ４４１～３０５相似，而负对照没有
显色（图４－Ｃ）．该结果与 Ｈｉｓ／Ａｄｅ－ｔａｇ的表达一
致，表明这四个转化子的 ＡｔＭＹＢ４４氨基酸序列
分别包括一段可以与ＲＣＡＲ１发生相互作用从而
启动报告基因ＬａｃＺ表达的蛋白质功能域．因此可
以确定 ＲＣＡＲ１在 ＡｔＭＹＢ４４上的作用区域定位
在ＡｔＭＹＢ４４的５４～１０５氨基酸区域．
综合以上结果可知：ＡｔＭＹＢ４４全长及不同长
度的 ＡｔＭＹＢ４４氨基酸序列与 ＲＣＡＲ１有明显的
相互作用，并且它们都含有ＡｔＭＹＢ４４的５４～１０５
氨基酸序列，因此 ＡｔＭＹＢ４４Ｎ端的５４～１０５氨
基酸序列在 ＡｔＭＹＢ４４与 ＲＣＡＲ１相互作用过程
中起着重要的作用．
４　讨论
在拟南芥中，Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ家族转录因子广泛
地参与植物的生长发育，包括植物细胞周期调控、
压力胁迫、次生代谢、细胞形态及分生组织的形
图４　ＢＤ－ＲＣＡＲ１与 ＡＤ－ＡｔＭＹＢ４４不同的氨基酸
片段的共转及ＬａｃＺ基因检测结果
Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＢＤ－ＲＣＡＲ１
ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ＡＤ－ＡｔＭＹＢ４４ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＬａｃＺｒｅ－
ｐｏｒｔｅｒ
Ａ：Ｙｅａｓｔｓ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ｏｎ　ＳＤ／Ｔｒｐ／Ｌｅｕ．Ｂ：Ｙｅａｓｔｓ　ｃｕｌｔｉｖａｔ－
ｅｄ　ｏｎ　ＳＤ／Ｈｉｓ／Ｔｒｐ／Ｌｅｕ／Ａｄｅ．Ｃ：Ｃｏｌｏｒｅｄ　ｙｅａｓｔｓ　ｂｙ　Ｘ－
Ｇａｌ．Ｄ：Ｄｉａｇｒａｍ　ｏｆ　ｙｅａｓｔｓ　ｏｎ　ｄｉｓｈ．
２９１
第１期 　　 陶志文等：拟南芥ＡｔＭＹＢ４４与ＲＣＡＲ１相互作用的研究 　
成［１１］．Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ结构域是由二个５０～５３个氨
基酸序列形成的螺旋－转角－螺旋的Ｒ２Ｒ３基元．根
据 ＭＹＢ结构域的Ｃ端保守的氨基酸序列基元，
Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ转录因子分成不同的亚家族．Ａｔ－
ＭＹＢ４４属于Ｒ２Ｒ３ＭＹＢ型转录因子Ｓ２２亚家族，
这个亚家族中主要包括 ＡｔＭＹＢ４４、ＡｔＭＹＢ７０、
ＡｔＭＹＢ７３和 ＡｔＭＹＢ７７，它们都有两个保守的基
元 ＴＧＬＹＭＳＰｘＳＰ 和 ＧｘＦＭｘＶＶＱＥＭＩｘｘ－
ＥＶＲＳＹＭ［１２－１４］．它们都有着相似的表达类型，并
且都受伤害、白光及冷处理胁迫诱导．微阵列分析
显示：在ＳＯＳ２突变体中，ＡｔＭＹＢ４４受胁迫的上
游调控；此外，ＡｔＭＹＢ４４的表达在ｆｕｓ３、ｌｅｃ１、ａｂｉ３
突变体中大量地减少［１１］．
ＡｔＭＹＢ４４过量表达的拟南芥在种子的萌发、
生长的早期、花期的推迟对ＡＢＡ高度地敏感，和
已报道的 ＤＲＥＢ１Ａ／ＣＢＦ３、ＤＲＥＢ２Ａ、ＡＢＦ３、及
ＡＢＦ４（这些基因依赖于 ＡＢＡ）对干旱的响应有着
相似的表型，这表明：在ＡＢＡ介导的反应中，Ａｔ－
ＭＹＢ４４对非生物胁迫，如干旱、高盐度、低温起着
重要作用［１５］．
最新研究结果表明：ＡｔＭＹＢ４４不仅参与ＡＢＡ
信号通路调控，而且参与赤霉素、茉莉酸、水杨酸信
号通路的调控［１５－１６］．当前，ＡｔＭＹＢ４４的作用机制还
没有相关的报道．本文考究了ＲＣＡＲ１与ＡｔＭＢＹ４４
之间的相互作用关系，结果表明：它们之间确实存
在相互作用，并且ＲＣＡＲ１作用于 ＡｔＭＹＢ４４的 Ｎ
端５４～１０５氨基酸序列上，根据ＳＭＡＲＴ软件预
测：ＲＣＡＲ１是作用在ＡｔＭＹＢ４４的 ＭＹＢ结构域Ｒ３
ＤＮＡ结合结构域上（图２），与其它的区域几乎没有
作用，这说明ＡｔＭＹＢ４４的Ｎ端５４～１０５氨基酸序
列在参与ＡＢＡ信号通路中起着重要的作用．本文
主要研究了它们在体外的相互作用关系，而在植物
体内，ＡｔＭＢＹ４４在 ＡＢＡ信号通路中扮演何种角
色，有待进一步的研究．
参考文献：
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ＰＹＬ５ｔｈｒｏｕｇｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌａｄｅ　Ａ　ＰＰ２Ｃｓ ［Ｊ］．
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［６］　Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｒ　Ｒ，Ｗａｇｎｅｒ　Ｒ　Ｌ，Ｖｅｒｈｅｙ　Ｓ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ
ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｋｉｎａｓｅ　ＰＫＡＢＡ１ｉｎｔｅｒａｃｔｓ
ｗｉｔｈ　ａ　ｓｅｅｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ－
ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ，ＴａＡＢＦ　ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ　ＴａＡＢＦ
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ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ
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［１３］　Ｒｏｍｅｒｏ　Ｉ，Ｐａｚ－Ａｒｅｓ　Ｊ，Ｂｅｎｉｔｏ　Ｍ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｒｅ
ｔｈａｎ　８０Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ
ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，１９９８，１４（３）：
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［１４］　Ｓｔｒａｃｋｅ　Ｒ， Ｗｅｒｂｅｒ　Ｍ， Ｗｅｉｓｓｈａａｒ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．
ＴｈｅＲ２Ｒ３－ＭＹＢ　ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ，２００１，４（５）：４４７．
［１５］　Ｊｕｎｇ　Ｃ，Ｓｅｏ　Ｊ　Ｓ，Ｈａｎ　Ｓ　Ｗ，ｅｔ　ａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ　ＡｔＭＹＢ４４Ｅｎｈａｎｃｅｓ　Ｓｔｏｍａｔａｌ　Ｃｌｏｓｕｒｅ　ｔｏ　Ｃｏｎｆｅｒ
Ａｂｉｏｔｉｃ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｎ　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００８，１４６（２）：６２３．
［１６］　Ｓｈｉｍ　Ｊ　Ｓ，Ｊｕｎｇ　Ｃ，Ｌｅｅ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．ＡｔＭＹＢ４４ｒｅｇｕ－
ｌａｔｅｓ　ＷＲＫＹ７０ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｏｄｕｌａｔｅｓ　ａｎｔａｇｏｎｉｓ－
ｔｉｃ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｊａｓｍｏｎｉｃ
ａｃｉｄ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，２０１３，７３（３）：４８３．
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