全 文 ：拟南芥钙调素结合蛋白AtIQD26的分离鉴定 *
韦慧彦 1,2) 郭振清 1)** 王振杰 1) 李朝炜1)** 王志娟 1) 崔素娟 1)***
(1)河北师范大学生命科学学院分子细胞生物学实验室,石家庄 050016;2)焦作师范高等专科学校理化生系,焦作 454000)
摘要 钙调素结合蛋白的研究有助于探明钙调素介导的信号转导途径.以拟南芥钙调素亚型 2(ACaM2)为钓饵,重组共转化
法构建并筛选了酵母双杂交文库.复筛后得到一个阳性克隆.序列测定及分析表明,分离的阳性克隆中包含一个编码钙调素
结合蛋白AtIQD26的cDNA片段.凝胶覆盖实验进一步表明,AtIQD26在 1mmol/LCa2+或 1mmol/LEGTA条件下都能与钙
调素结合,说明其存在不依赖于 Ca2+的 CaM结合特性.GUS染色分析表明,AtIQD26具有普遍的组织表达特性,尤其是在
新生的组织中表达量较大;融合荧光蛋白定位显示,AtIQD26在细胞核与质膜附近有分布.AtIQD26与钙调素空间分布的相
似性,预示着它们在植物生长发育过程中可能共同发挥作用.
关键词 钙调素结合蛋白,酵母双杂交,拟南芥,凝胶覆盖分析, 组织表达, 亚细胞定位
学科分类号 Q291
*国家自然科学基金(2006CB0D1105,30470889,90208004),河北省
自然科学基金(C2004000152),教育部新世纪优秀人才支持计划
(NECT-06-0256)和河北师大博士基金资助项目(L2004B11).
**郭振清.现工作单位:河北科技师范学院生命科学系,秦皇岛066000
**李朝炜.现工作单位:河北科技大学生命科学院,石家庄050016
***通讯联系人.
Tel:0311-86269144,E-mail:cuisujuan@263.net
收稿日期:2007-11-17,接受日期:2007-12-27
生物化学与生物物理进展
ProgressinBiochemistryandBiophysics
2008,35(6):703~711
www.pibb.ac.cn
研究报告ResearchPapers
钙调素(calmodulin,CaM)是一类小分子质量、
高度保守的钙结合蛋白,作为胞内钙信使的多功能
受体蛋白,广泛参与细胞信号转导的诸多途径[1].
由于CaM自身没有酶活性,CaM介导的信号途径
依赖于钙调素结合蛋白(calmodulin-bindingproteins,
CaMBPs)的表达模式和活性[1].因此,对 CaMBPs
的研究是揭示 CaM发挥生理功能作用机制的重要
途径,是探明钙离子(Ca2+)-CaM信号转导系统的
关键.
CaMBPs与 CaM的结合可分为依赖于 Ca2+的
和不依赖于 Ca2+的两种类型,分别称之为钙依赖
性 CaMBPs和钙不依赖性 CaMBPs[2].钙依赖性
CaMBPs在真核细胞中发挥着重要功能[1].然而,
CaMBPs与Ca2+的结合并不总是必需的,钙不依赖
性CaMBPs在细胞内具有另外一些重要作用[2].钙
不依赖性 CaMBPs的研究与钙依赖性 CaMBPs的
研究同等重要却远远滞后,因此,加强钙不依赖性
CaMBPs的研究,有助于探明CaMBPs在生物生长
发育中的作用.对钙不依赖性 CaMBPs的鉴定与
分析将有助于阐明 CaM信号转导途径的特异性、
复杂性和多样性.
酵母双杂交体系(yeasttwo-hybridsystem)又称
相互作用陷阱(interactiontrap),是在酿酒酵母中研
究蛋白质间相互作用的一种非常有效的分子生物学
方法,可用来分离能与一种已知靶蛋白相互作用的
蛋白质的编码基因[3].酵母双杂交系统反映的是不
同蛋白质之间在活细胞内的相互作用,并可结合对
整个 cDNA文库进行筛选,直接克隆与某已知蛋
白质相互作用的蛋白质基因,简便、灵敏、高效的
优点使其应用广泛[4].
酵母双杂交体系在植物中的应用,主要集中在
筛选 cDNA文库中编码与诱饵蛋白特异作用的未
知蛋白并检测蛋白质间的相互作用.Quail实验室[5]
以光敏色素 C端序列为诱饵,从拟南芥的 cDNA
文库中筛选到一个与光敏色素发生相互作用的蛋白
PIF3是一个转录因子.Doonan等[6]用双杂交技术
分离了 CDK的相互作用蛋白,如 cdk抑制子和
suc1的同源物.Mizoguchi等[7]用双杂交技术证明
ATMAPK4、MEK1和 ATMEKK1可以相互作用,
在拟南芥中形成一特殊的 MAPK级联.本文报道
生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2008;35(6)
了利用酵母双杂交技术对拟南芥钙调素结合蛋白
AtIQD26(At3g16490)的分离鉴定,研究结果表明,
AtIQD26存在不依赖于Ca2+的CaM结合特性.
1 材料和方法
1.1 材料
野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)生态型为
Columbia,E.coliDH5!,双元载体 pCAMBIA1300
和农杆菌GV3101菌株为河北师范大学分子细胞生
物学实验室保存;质粒 pGBKT7-AtCaM2,含有拟
南芥2号亚型钙调素基因,为河北师范大学分子细
胞生物学实验室博士生宋林霞构建.
MatchmarkerTMTwo-HybridLibraryConstruction
ScreeningKit,酵母双杂交 GAL4系统及酵母缺失
培养基等购自 Clontech公司;mRNA分离试剂盒
为Qiagen-Ambion公司产品.
载体构建用各种内切酶和逆转录酶、Taq酶、
T4连接酶分别为 TaKaRa、华美、Promega等公司
产品;常用生化试剂:氨卞青霉素、卡那霉素、
dNTP、鲑精 DNA、DMSO、玻璃珠购自 Sigma公
司;LB培养基成分购自 Oxiod公司;酵母培养基
成分购自 Clontech公司;胶回收试剂盒购于上海
华舜公司;其他生化试剂为进口分装或国产分析纯
试剂;寡核苷酸引物合成(PAGE纯化,纯度 99%)
及DNA序列测定由上海生工公司完成.
1.2 拟南芥的种植
拟南芥种子经表面(75%乙醇,30～60s;无菌
水洗3次)和深层(2.5%次氯酸钠,8～10min,无菌
水洗 3～5次)消毒后,4℃暗中处理 3天,播种在
固体 MS培养基(3%或 1%蔗糖,0.7%琼脂粉,1×
Murashige和Skoog盐和维生素,用KOH调pH至
5.8)上,转到光照培养箱中培养,22℃,16h/8h
光周期(L/D光强 130μmol·m-2·s-1),8～10天即幼
苗长出2片真叶后,将幼苗移栽到浸透水的花盆中
(盆中含有营养土与蛭石按1∶2比例混合的培养介
质),相同温度和光照周期继续培养,每周浇 1～2
次水.
1.3 酵母双杂交文库的构建及筛选
取拟南芥花的雄蕊和雌蕊约 3g,液氮研磨,
按 RNAwizTM试剂盒说明进行 RNA的提取,参照
Qiagen公司 OligotexmRNASpin-ColumnProtocol
进 行 mRNA的 分 离.然 后 按 Clonetech公 司
MatchmarkerTM Two-HybridLibraryConstruction&
ScreeningKit的用户手册进行文库的共转化法构建
和筛选鉴定.首先以分离的 mRNA为模板合成第
一 链 cDNA, LD-PCR 扩 增 dscDNA, 利 用
CHROMASPIN+TE-400Column纯化dscDNA.再
将 dscDNA样品与 pGADT7-Rec和 pGBKT7-CaM
共转化 AH109感受态酵母,把共转化混合物涂在
二缺(SD/Leu-Trp-,DDO)培养基上,将二缺培养
基上长出的克隆转印到三缺(SD/His-Leu-Trp-,
TDO)或四缺(SD/Ade-His-Leu-Trp-,QDO)培养基
上,30℃恒温培养直至阳性克隆出现.将在四缺平
板上生长的阳性克隆,进行 #-半乳糖苷酶活性的
滤膜染色分析(X-Galassay).提取染色为蓝色的阳
性 克 隆 酵 母 中 的 pGADT7 质 粒 , 分 别 与
pGBKT7-CaM质粒,一对一共转化酵母 AH109,
筛选出四缺平板生长及 X-Gal显蓝的 pGADT7质
粒,测序确定外源cDNA序列.
1.4 AtIQD26cDNA的RT-PCR扩增与克隆
取 5μg花粉 RNA为模板,以 5′ggaatcatggg-
aagagctgcgagatggtca3′为上游引物,以 5′cgggatc-
cctaatatgaatctaaatcagtct3′为下游引物(5′、3′分别引
入 EcoRⅠ和 BamHⅠ酶切位点),按照 RNAPCR
Kit(AMV)Ver.2.1Manual进行 RT-PCR扩 增.
PCR产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳,回收 1170bp
片段,将其连入 pGEM-TEasy载体.测序正确的
AtIQD26cDNA和载体 pGADT7进行连接,构建质
粒pGADT7-AtIQD26cDNA.重组质粒转化至 E.coli
DH5!,平板培养过夜,挑取阳性克隆,扩大培养,
以碱裂解法提取质粒并用 EcoRⅠ和 BamHⅠ双酶
切鉴定,通过测序验证正确性.
1.5 AtIQD26在原核系统中重组表达
将 pGADT7-AtIQD26和 pET-28b(+)质 粒 经
BamHⅠ和 NcoⅠ酶切,电泳回收、连接、转化.
将 AtIQD26蛋白编码区克隆到 pET-28b(+)表达载
体上,转化 E.coliBL21(DE3)感受态菌株.抗性
(kan+)平板上挑选阳性克隆,酶切鉴定,最后测序
验 证 正 确 性 , 获 得 正 确 构 建 的 阳 性 重 组 子
pET-28b-AtIQD26cDNA.
1.6 SDS-PAGE及CaM凝胶覆盖分析
接 种 含 pET-28b-AtIQD26cDNA 单 克 隆 的
BL21菌株于2～3mlLB液体培养基中,37℃摇培
过夜,然后按 1∶50比例扩培于新鲜培养基中,
37℃生长至 A600nm=0.6～0.8时(约 3h),取菌液于
EP管中,每管 1ml,作诱导前对照.加 IPTG到
终浓度为 1mmol/L,于诱导后 1、2、3h分别取
样,样品和对照分别10000g离心1min,弃上清,
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韦慧彦等:拟南芥钙调素结合蛋白AtIQD26的分离鉴定2008;35(6)
收集菌体或于-20℃保存.
按 Laemmli[8]方法,将离心收集的菌体进行
12%SDS-PAGE.电转移至 NC膜,氨基黑染色确
定转膜效果.生物素化钙调素凝胶覆盖(Bio-CaM
overlay)按李家旭等[9]方法;35S标记钙调素凝胶覆
盖(35S-CaMoverlay)按崔素娟等[10]方法.
1.7 拟南芥的遗传转化
质 粒 pCAMBIA1300-GUS和 pCAMBIA1300
35S:YFP为河北师范大学分子细胞生物学实验室
保存.将来自pGEM-TEasy载体上的HindⅢ-BamHⅠ
AtIQD26启动子片段插入 pCAMBIA1300-GUS质
粒,获得pCAMBIA1300AtIQD26:GUS双元载体;
将来自 pGEM-TEasy载体上的 BamHⅠ-BglⅡ
AtIQD26cDNA插入 pCAMBIA1300AtIQD26:GUS
质粒,获得 pCAMBIA1300AtIQD26:cDNA-GUS
双元载体;将 AtIQD26cDNA插入 pCAMBIA1300
35S:YFP质粒,获得 pCAMBIA130035S:AtIQD26-
YFP双元载体.将构建好的 pCAMBIA130035S:
IQD26-YFP及 对 照 35S:YFP和 pCAMBIA1300
AtIQD26:cDNA-GUS及 AtIQD26:GUS的表达载体
分别转化农杆菌GV3101,再利用浸花法转化拟南
芥植株[11].T2代出现潮霉素抗性分离比为3∶1的
株系进入后续实验.
1.8 转基因拟南芥植株的GUS组织染色
取不同时期转基因苗按Jeferson等[12]方法进行
GUS组织化学染色,体视显微镜(日本尼康公司,
型号C-DSS230,规格SMZ800)拍照.
1.9 倒置荧光显微镜观察
取 10天左右转基因苗于载玻片上,滴上适量
水,加盖玻片,置于倒置荧光显微镜(日本尼康公
司,型号TE2000-U)上进行观察.观察条件为:以
450～490nm观察 YFP荧光,以 330～380nm观
察 DAPI.随机 NikonACT-1软件记录结果,处理
图像.
2 结 果
2.1 以钙调素为诱饵筛选酵母双杂交文库
首先进行拟南芥花总RNA的提取、mRNA的
分离、cDNA的合成、扩增及纯化,然后将
dscDNA样品与 pGADT7-Rec和 pGBKT7-CaM共
转化酵母菌 AH109感受态酵母细胞,二缺 DDO
上筛出共转有 pGADT和 pGBKT7(AD和 BD)质粒
的酵母,再经过三缺 TDO或四缺 QDO的进一步
筛选, 得到了5个QDO生长且X-Gal染色显蓝色
的阳性克隆.
进一步分别提取5个染色较深的阳性克隆酵母
中的 AD质粒,分别与 pGBKT7-CaM质粒一对一
共转化酵母,筛选出四缺平板生长及 X-galassay
阳性的AD质粒,测序得到外源cDNA序列,其中
的 3个克隆中得到了一致的序列.将序列提交到
GenBank(htp:/ncbi.nlm.nih.gov/blast)网站进行了比
对,结果表明,其中一个阳性克隆含有的 cDNA
序列代表的是分析推测的拟南芥基因 at3g16490的
开放阅读框(ORF)286～859位核苷酸,其编码的
蛋白质为推测的 AT3G16490全蛋白的一部分.
AT3G16490被Abel等[13]命名为AtIQD26.
2.2 AtIQD26编码区全长 cDNA扩增及预测编码
蛋白的分析
由于文库筛选到的阳性克隆中包含 AtIQD26
ORF的部分片段,为进一步验证 AtIQD26全长与
CaM的相互作用,我们根据拟南芥专业网站TAIR
(www.arabidopsis.org)提供的信息,设计引物,扩
增了 AtIQD26cDNA编码区全长片段,将其连入
pGEM-TEasy载体,经测序分析,与网上生物信息
学分析的序列一致.AtIQD26的cDNA编码区全长
1170bp,编码389个氨基酸组成的AtIQD26蛋白,
富含 Ala(A,11%)、Ser(S,10%)、Arg(R,9%)和
Lys(K,7%)(图 1).蛋白质一级结构分析表明,
AtIQD26蛋白分子质量为 43661.0u,等电点
为10.6.
二级结构预测表明:AtIQD26蛋白 106～172
位含有一个由 67个氨基酸残基组成的、植物特有
的、与 CaM结合有关的结构域——IQ67结构域
(即 IQD),该 IQD包含 3个 Ca2+非依赖的 IQ基序
(氨基酸序列通式为[ILV]QxxxRGxxx[RK]),其间
距分别是11和15个氨基酸残基; 每个IQ基序又
同时与Ca2+依赖的1-5-10和1-8-14基序部分重叠;
每个IQ基序旁侧序列中还包含保守的疏水和碱性
氨基酸残基(图2a).
借助 Htp:/calcium.uhnres.utoronto.ca网站对
AtIQD26蛋 白 135～151共 17个 氨 基 酸 残 基
(LQALVRGYLVRKRAAET)进行了轮状分析,结
果表明,17个氨基酸形成了一个典型的双亲性的
α螺旋,并包括间隔的带正电荷的氨基酸残基,符
合CaM结合域(CaMBD)的典型特征[14,15](图2b).
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生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2008;35(6)
Fig.1 Nucleotideanddeducedaminoacid
sequenceofthecodingregioninAtIQD26
1 ATGGGAAGAGCTGCGAGATGGTTCAAGGGTATTTTTGGTATGAAGAAGAGCAAAGAGAAA
M G R A A R W F K G I F G M K K S K E K
61 GAGAACTGTGTTTCCGGCGACGTTGGAGGTGAAGCCGGTGGTTCTAACATTCACCGGAAA
E N C V S G D V G G E A G G S N I H R K
121 GTTCTCCAAGCTGACTCCGTCTGGCTCAGAACTTACCTTGCGGAAACAGACAAAGAACAG
V L Q A D S V W L R T Y L A E T D K E Q
182 AACAAACACGCGATTGCGGTTGCTGCTGCTACAGCCGCGGCTGCTGACGCAGCGGTTGCA
N K H A I A V A A A T A A A A D A A V A
241 GCGGCTCAAGCTGCTGTGGCGGTGGTCAGGTTAACAAGTAACGGAAGAAGCGGAGGATAT
A A Q A A V A V V R L T S N G R S G G Y
301 TCCGGGAACGCAATGGAGCGGTGGGCCGCAGTGAAAATTCAATCAGTCTTCAAGGGCTAT
S G N A M E R W A A V K I Q S V F K G Y
361 TTGGCGAGAAAAGCGTTACGAGCTTTGAAAGGTTTAGTGAAGCTACAAGCTTTGGTAAGA
L A R K A L R A L K G L V K L Q A L V R
421 GGATACTTAGTCCGCAAACGCGCCGCCGAAACGCTGCATAGCATGCAAGCTCTCATTAGA
G Y L V R K R A A E T L H S M Q A L I R
481 GCTCAAACCAGCGTCCGATCGCAACGCATCAACCGCAACAACATGTTTCATCCTCGACAC
A Q T S V R S Q R I N R N N M F H P R H
541 TCACTTGAGAGGTTGGATGATTCAAGAAGTGAAATCCATAGCAAGAGAATATCAATCTCT
S L E R L D D S R S E I H S K R I S I S
601 GTAGAGAAACAGAGTAATCACAACAACAATGCGTACGATGAGACCAGTCCCAAGATTGTG
V E K Q S N H N N N A Y D E T S P K I V
661 GAGATTGATACTTACAAGACGAAATCAAGATCAAAGAGAATGAATGTGGCTGTATCCGAA
E I D T Y K T K S R S K R M N V A V S E
721 TGTGGAGATGATTTCATCTATCAAGCCAAAGATTTCGAATGGAGTTTTCCGGGAGAGAAA
C G D D F I Y Q A K D F E W S F P G E K
781 TGCAAGTTTCCTACGGCTCAAAACACGCCGAGATTCTCTTCATCAATGGCTAATAATAAC
C K F P T A Q N T P R F S S S M A N N N
841 TATTACTACACGCCCCCATCGCCGGCGAAAAGTGTTTGCAGAGACGCTTGTTTTAGGCCA
Y Y Y T P P S P A K S V C R D A C F R P
901 AGTTATCCTGGTTTGATGACACCTAGCTATATGGCTAATACGCAGTCGTTTAAAGCCAAG
S Y P G L M T P S Y M A N T Q S F K A K
961 GTACGTTCGCATAGTGCACCGAGACAACGTCCTGATAGAAAAAGATTGTCACTTGATGAG
V R S H S A P R Q R P D R K R L S L D E
1021ATTATGGCGGCTAGAAGTAGCGTTAGTGGTGTGAGGATGGTGCAACCACAACCACAACCG
I M A A R S S V S G V R M V Q P Q P Q P
1081CAAACGCAAACGCAGCAACAGAAACGCTCTCCTTGTTCGTATGATCATCAGTTTCGTCAG
Q T Q T Q Q Q K R S P C S Y D H Q F R Q
1141AACGAGACTGATTTTAGATTCTATAATTAG
N E T D F R F Y N
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韦慧彦等:拟南芥钙调素结合蛋白AtIQD26的分离鉴定2008;35(6)
2.4 AtIQD26的亚细胞定位
为了研究 AtIQD26的亚细胞定位,我们用黄
色荧光蛋白(yelowfluorescentprotein,YFP)做为报
告基因,构建了 pCAMBIA1300:35S:AtIQD26-YFP
及对照 35S:YFP的双元表达载体,经过测序证明
构建结果正确.借助倒置荧光显微镜观察上述转基
因纯合体,同时采用细胞核特异荧光染料DAPI染
色,结果表明,报告基因YFP在质膜和细胞核处的
表达较明显,但在胞质内也有明显的表达(图 5).
这样的结果与对 AtIQD26蛋白定位预测的生物信
Fig.4 RecombinantAtIQD26interactedwithCaMinvitrobyCaMoverlay
TransferedNCmembraneoverlayby
Bio-CaM+Avidin-HRPAvidin-HRP 35S-CaM
+Ca2+ +Ca2++EGTA +Ca2+ +EGTA
TransferedNCmembrane
stainedbyAmino-Black
- + - + - + - + - + - +IPTGku
97.4
66.2
43.0
31.0
20.1
14.4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
←AtIQD26
←Nonspecificband
Fig.3 AtIQD26interactedwithACaM2invivo
byyeasttwo-hybridsystem
(a)GrowthonQDOmedium.(b)X-Galassay.
Positivecontrol
Negativecontrol
AD-At3g16490
BD-CaM
AD-At3g16490
BD-CaM
(b)(a)
2.3 AtIQD26全蛋白与CaM的结合特性
文库筛选克隆到的阳性克隆只编码出AtIQD26
蛋 白 的 部 分 片 段 , 为 进 一 步 验 证 AtIQD26
(At3G16490)全蛋白与 CaM的相互作用,我们采
用了酵母双杂交和标记CaM凝胶覆盖两种方法.
首先利用酵母双杂交方法,鉴定 AtIQD26全
蛋白和 ACaM2是否具有相互作用.将重组质粒
pGADT7-AtIQD26cDNA 转 化 到 含 有 质 粒
pGBKT7-ACaM2的酵母菌 AH109中,涂布在缺少
Trp和 Leu的二缺 DDO固体培养基上,30℃培养
2～3天,待菌落长出,将其划线转接到四缺培养
基QDO上,观察它的生长情况,结果显示,共转
AD-At3g16490和 BD-CaM质粒的酵母克隆生长良
好,将在四缺平板上生长出的菌落,进行 !-半乳
糖苷酶活性检测,结果为阳性(图3a).而 AtIQD26
和 BD-CaM的单独转化子,!-半乳糖苷酶活性检
测均为阴性,而且在四缺培养基上不能生长,这说
明二者无自激活作用(图3b).上述结果表明,全长
AtIQD26蛋白能够和ACaM2在酵母体内发生相互
作用.
为了进一步验证AtIQD26蛋白与 CaM的结合
特性,又采用了标记 CaM凝胶覆盖实验.将含阳
性重组子 pET-28b-AtIQD26cDNA的 BL21菌株,
37℃进行 1mmol/LIPTG诱导,经 SDS-PAGE分
析表明,IPTG诱导了一条分子质量约 43ku的蛋
白表达,这与理论预测的AtIQD26分子质量一致,
而在对照菌株中并没有此蛋白质的表达.用生物素
化 CaM(Bio-CaM)及 35S-CaM分别对诱导蛋白进行
了覆盖检测,结果表明,诱导表达蛋白在有Ca2+条
件下与 CaM结合,表现为一条明显的显色条带,
在 1mmol/LEGTA存在条件下也有较强的结合
(图4).
707· ·
生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2008;35(6)
3 讨 论
酵母双杂交系统是一种研究蛋白质-蛋白质在
生物体内相互作用的有效方法.植物细胞信号转导
研究中,借助这一系统验证、筛选了许多重要的信
号组分[16].本实验以拟南芥的花器官为实验材料,
以拟南芥钙调素亚型 2(ACaM2)为钓饵,重组共转
化法构建并筛选了酵母双杂交文库.经初筛、复筛
确定了一个推测的CaMBP——AtIQD26.
为了证实 AtIQD26确为 CaMBP,利用生物信
息学方法对其 CaM结合域进行了分析预测,结果
表明:AtIQD26蛋白中存在多个Ca2+依赖的和Ca2+
Fig.5 ThesubcelularlocationofAtIQD26inroot
of35S:IQD26-YFPtransgenicArabidopsisline
Bar=10μm
35S:IQD26-YFP
35S:YFP
YFP DAPI Brightfield
Fig.6 SpatiotemporalexpressionofAtIQD26genebyGUShistochemicalstaining
(a)AtIQD26:GUStransgeniclines.1:Seedling;2,5,6:Leaf;3:Flower;4:Silique;7:Primaryroot;8:Lateralroot.(b)AtIQD26:cDNA-GUS
transgeniclines.1:Seedling;2,3:Leaf;4:Root;5,6:Flower.Bar=1cm
1 2 3 4
1 2 3
4 5 6
5 6 7 8
(a)
(b)
息学分析结果基本一致,表明 AtIQD26可能是非
分泌蛋白,主要分布在细胞核及细胞膜附近.
2.5 AtIQD26的组织表达特性
用 β-葡萄糖苷酶(β-glucuronidase,GUS)做为
报告基因,将 AtIQD26的启动子或 cDNA与 GUS
构建成融合基因并经过测序证明构建结果正确.利
用GUS的化学染色分析AtIQD26的组织表达.结
果表明:利用 AtIQD26:GUS的纯合体植株作为材
料时,在子叶的叶脉和叶尖、真叶叶尖、根的中
柱,花萼、花丝、花柱、柱头等处检测到了明显的
GUS表达,说明 AtIQD26在这些部位中有表达
(图 6a).利用 AtIQD26:cDNA-GUS的纯合体植株
作为材料时,AtIQD26在新生真叶中表达量较高且
明显,但随着下一对真叶的长出,前一对真叶中该
基因的表达量明显下降,当叶子完全长大后
AtIQD26就基本仅在叶柄、叶脉处表达了,在根中
的表达主要局限于根的中柱(根中的输导组织)且相
对较弱,花中仅在花柱部位(胚珠)检测到了 GUS
的表达(图6b).
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韦慧彦等:拟南芥钙调素结合蛋白AtIQD26的分离鉴定2008;35(6)
非依赖的CaM结合基序,说明它有与CaM相互作
用的潜力,通过酵母双杂交验证了二者在酵母体内
确实能发生相互作用.Bio-CaM及 35S-CaM凝胶覆
盖体外结合实验研究表明,重组 AtIQD26蛋白在
有1mmol/LCa2+条件下与CaM结合,而在1mmol/L
EGTA存在条件下也有结合,但有Ca2+条件下有利
于它们的结合(图4),说明 AtIQD26存在不依赖于
Ca2+的 CaM 结 合 特 性. 同 时 , 纯 化 的 重 组
GST-AtIQD26的融合蛋白点杂交结果也显示:有
Ca2+的条件下比无Ca2+条件下的结合信号要强(结果
未展示).
生物信息学的分析表明:AtIQD26蛋白在分类
上属于具有未知生化功能的、推测的 CaM靶蛋白
家族——IQD(IQ67domain)家族.IQD家族是Abel
等[13]借助生物信息学方法,利用 IQ基序搜索模式
植物拟南芥和水稻基因组,得到一类具有 IQ67结
构域(即由 67个氨基酸残基组成的含有 IQ基序的
结构域)的推测的CaMBPs的总称.由于IQ基序是
典型的 Ca2+非依赖性 CaMBP,因此该类 CaMBP
在理论上都存在不依赖于 Ca2+的 CaM结合特性,
属于钙不依赖性 CaMBPs.拟南芥的 IQD家族由
33个基因成员组成,其编码的蛋白质被称为
IQD1～33.迄今为止,拟南芥 IQD家族是拟南芥
基因组中最庞大的CaMBP家族,仅随其后的是与
CBLCa2+传感器相互作用的 CIPK家族(25～30个
基因成员).
研究显示IQD(IQ67domain)中包含3个Ca2+非
依 赖 的 CaMBD(IQ基 序)和 多 个 Ca2+依 赖 的
CaMBD(1-5-10或1-8-14基序).虽然 IQ基序在生
物界分布广泛,但IQD中3个IQ基序的排列组合
方式却是植物特有,目前尚未在植物蛋白以外发现
IQD[13].例如除 IQD家族以外,结合 CaM的转录
激 活 子(calmodulin-bindingtranscriptionactivator,
CAMTA)家族、肌球蛋白(myosin)家族和循环核苷
酸门控通道(cyclicnucleotidegatedchannels,CNGC)
家 族 都 是 具 有 IQ基 序 的 CaMBP家 族 , 但
CAMTA、myosin和 CNGC家族中各 IQ基序的间
距以及外显子 -内含子的组合方式与 IQD家族明
显不同[16].此外,分析表明[16],大多IQD蛋白都具
有碱性等电点,富含Ser且多数定位于细胞核内.
根据上述研究推测,IQD蛋白参与并协调了与
CaM及其同源蛋白的相互作用,可能在细胞核发
挥功能,在转录及转录后水平调节基因表达[13].
然而,目前人们对 IQD家族各成员所知甚
少.仅有体外实验证明:IQD20在Ca2+或EGTA存
在时都能与 CaM结合,而 IQD1只在 Ca2+存在时
与CaM结合,IQD1参与促进植物体内芥子油苷积
累,与防御反应相关[17].
在对 AtIQD26的研究中,为了进一步揭示
AtIQD26的结构和功能,我们研究了其组织表达与
亚细胞定位.AtIQD26自身启动子与 GUS融合基
因的恒定转化可以反映 AtIQD26在转录水平的表
达情况,而 AtIQD26自身启动子与 cDNA-GUS融
合基因的恒定转化可以反映 AtIQD26在转录及翻
译水平的表达情况.AtIQD26:GUS及 AtIQD26:
cDNA-GUS恒定转化的结果显示:虽然两者表达
模式存在一些差异,但 AtIQD26广泛存在于植物
体的各个部分(图 6),说明它可能与植物基本的生
理功能有关.此外,转 AtIQD26:cDNA-GUS的植
株中,GUS组织染色结果显示:AtIQD26在生长
分裂旺盛的部位和维管组织中表达量较高,推测其
功能可能与细胞分裂、营养和信号分子的运输有
关.当然,这一推测还需要进一步实验的支持.
越来越多的证据表明:植物细胞中能产生核特
异的Ca2+信号,CaM及其相关Ca2+受体蛋白在转录
或基因剪接等核过程中具有潜在的调控作用[18～24].
在 35S强启动子驱动下,AtIQD26与 YFP融合基
因恒定转化的结果显示:AtIQD26蛋白主要定位在
细胞核及质膜附近(图 5).虽然 AtIQD26蛋白结构
中不含有已知的DNA或RNA结合结构域,但考虑
到 AtIQD26蛋白的碱性等电点和富含丝氨酸的特
性,说明其可能在细胞核发挥功能,在转录及转录
后水平调节基因表达.而且 AtIQD26蛋白中多个
Ca2+依赖的和 Ca2+非依赖的 CaMBD可能参与、协
调了与CaM或CaM样蛋白的相互作用,其生理功
能有待进一步的探讨.
参 考 文 献
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韦慧彦等:拟南芥钙调素结合蛋白AtIQD26的分离鉴定2008;35(6)
IsolationandCharacterizationofCalmodulin-binding
ProteinAtIQD26inArabidopsisthaliana*
WEIHui-Yan1,2),GUOZhen-Qing1)**,WANGZhen-Jie1),LIZhao-Wei1)**,WANGZhi-Juan1),CUISu-Juan1)***
(1)InstituteofMolecularCelBiology,ColegeofLifeScience,HebeiNormalUniversity,Shijiazhuang050016,China;
2)DepartmentofPhysics,ChemistryandBiology,JiaozuoTeachersColege,Jiaozuo454000,China)
Abstract Calmodulin(CaM)isaubiquitous,multifunctionalcalcium(Ca2+)sensorthatexistsinaleukaryotes.
Calmodulin-bindingproteins(CaMBPs)playimportantrolesinvarioussignalpathwayofcalmodulin.Thefinding
ofnewCaMBPswilbeusefulforilustratingmechanismofCaMimplicatinginplantgrowthanddevelopment.
Yeasttwo-hybridsystemisanefectivemethodforstudyingprotein-proteininteractionsinvivo.Inthestudyof
plantsignaltransduction,manyimportantsignaltransductionmoleculeswereobtainedbythissystem.Here,
Arabidopsisflowerwereusedasthematerial.TheYeasttwo-hybridlibraryofArabidopsisflowerwasconstructed
byco-transformingyeaststrainAH109withdscDNA,pGADT7-recandpGBKT7-ACaM2.Apositiveclonewas
identified.DNAsequencingandanalysisindicatedthatthiscDNAcloneencodescalmodulin-bindingprotein
AtIQD26.TheAtIQD26proteincontainsaplant-specificdomainof67conservedaminoacidresidues,referedto
astheIQ67domain(IQD),whichischaracterizedbyauniqueandrepetitivearangementofthreediferentCaM
recruitmentmotifs,knownastheIQ,1-5-10,and1-8-14motifs.Yeasttwo-hybridanalysisandgeloverlay
experimentsdemonstratedthatAtIQD26interactedwithCaMbothinthepresenceorabsenceofCa2+.Astriking
featureofAtIQD26isthehighisoelectricpoint(～10.6)andfrequencyofserineresidues(～10%).Touncover
potentialrolesforAtIQD26,aseriesofexpressionvectorswereconstructedaboutit,andtherelativetransgenic
workswerefinished.Usingthesetransgeniclines,thetissueexpressionandthesubcelularlocalizationof
AtIQD26werestudied.FusionGFPreportershowedthatAtIQD26waslocatedatthenucleusandnearcytoplasm
membrane.GUShistochemicalassayshowedthatAtIQD26hadcharacteristicofuniversaltissueexpression,
especialyintherenascenttissue.InteractionofAtIQD26withCaMandthepresenceofpredictedCaMbinding
sitesinitsuggestthatAtIQD26isanewmemberofCaMtargets.Thebasicisoelectricpointanditspotential
nuclearlocalizationsuggestthatAtIQD26linksCa2+ signalingpathwaystotheregulationofgeneexpression.
ExpressionsimilarityindicatesthatAtIQD26combinedwithCaMtoregulateplantdevelopmentandgrowth.
Keywords calmodulin-bindingproteins,yeasttwo-hybridsystem,Arabidopsis,geloverlay,tissue-specific
expression,subcelularlocalization
*ThisworkwaspartlysupportedbygrantsfromTheNationalNaturalScienceFoundationofChina(2006CB0D1105,90208004,30470889),National
EducationDepartmentNewCenturyExcelentTeacherProject(NCET-06-0256),TheNationalNaturalScienceFoundationofHebeiProvince
(C2004000152)andSpecializedResearchFundforTheDoctoralProgramofHebeiNormalUniversity(L2004B11).
**GUOZhen-Qing.Curentaddress:ColegeofLifeScience,HebeiScienceandTechnologyNormalUniversity,Qinhuangdao066000
LIZhao-Wei.Curentaddress:ColegeofLifeScience,HebeiScienceandTechnologyUniversity,Shijiazhuang050016
***Corespondingauthor.
Tel:86-311-86269144,E-mail:cuisujuan@263.net
Received:November17,2007 Accepted:December27,2007
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