全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(4): 557−564 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家转基因植物研究与产业化开发专项项目(JY-03-A-02); 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2004AA212131)
作者简介: 安宝燕(1979−), 女, 硕士研究生, 植物发育专业。罗琰(1981−), 女, 硕士研究生生, 植物发育专业。∗∗ 共同第一作者。
*
通讯作者(Corresponding authors): 张宪省, 男, 教授, E-mail: zhangxs@sdau.edu.cn, Tel: 86-538-8249418; 高新起, 男, 副教授,
E-mail: gaoxq@sdau.edu.cn
Received(收稿日期): 2007-07-29; Accepted(接受日期): 2007-10-23.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00557
紫花苜蓿 Na+/H+逆向转运蛋白基因在拟南芥中表达提高转基因植株的
耐盐性
安宝燕 1,2,** 罗 琰 1,** 李加瑞 2 乔卫华 3 张宪省 1,* 高新起 1,*
(1山东农业大学生命科学学院 / 作物生物学国家重点实验室, 山东泰安 271018; 2美国堪萨斯州立大学植物病理系, 美国曼哈顿 66506;
3北京大学生命科学学院, 北京 100871)
摘 要: 以紫花苜蓿(Medicago sativa)为材料, 利用反转录 PCR 方法分离了 NHX1 全长 cDNA(命名为 MsNHX1)。
Southern杂交结果表明, 在紫花苜蓿中存在一个小的液泡型 Na+/H+逆向转运蛋白基因家族。序列分析表明, 该基因所
编码的蛋白与拟南芥、水稻和棉花中液泡型 Na+/H+逆向转运蛋白具有较高的同源性。在洋葱表皮细胞中瞬时表达
MsNHX1-GFP融合基因的结果表明, MsNHX1定位在液泡膜上。Northern杂交发现该基因的表达受高浓度 NaCl诱导。
MsNHX1在盐敏感酵母突变体中表达可以提高转化子对 NaCl的耐受性, 说明 MsNHX1具有转运 Na+的功能。在拟南
芥中表达 MsNHX1 能显著提高植株耐受盐胁迫的能力; 而且在受到盐胁迫时, 转基因植株比野生型的渗透调节能力
更强, 生物膜受破坏程度降低, 光合能力增强。以上研究结果表明 MsNHX1 是一个液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白, 在
植物耐受盐胁迫过程中起重要作用。
关键词: 紫花苜蓿; Na+/H+逆向转运蛋白基因; 拟南芥; 耐盐性
Expression of a Vacuolar Na+/H+ Antiporter Gene of Alfalfa Enhances
Salinity Tolerance in Transgenic Arabidopsis
AN Bao-Yan1,2,**, LUO Yan1,**, LI Jia-Rui2, QIAO Wei-Hua3, ZHANG Xian-Sheng1,*, and GAO Xin-Qi1,*
(1 State Key Laboratory of Crop Biology, College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, Shandong, China; 2 Department
of Plant Pathology, Kansas State University, Manhattan 66506 KS, USA; 3 College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China)
Abstract: Plant Na+/H+ antiporters play an important role in salt tolerance. An alfalfa (Medicago sativa) full length cDNA
(named as MsNHX1) was isolated by RT-PCR according to the homologous region of plant Na+/H+ antiporter genes. Southern blot
analysis revealed that there was a small antiporter gene family in alfalfa genome. Sequence analysis indicated that MsNHX1
shared high homology with other vacuolar Na+/H+ antiporters. Transient transfection of MsNHX1-GFP fusion gene revealed that
MsNHX1 targeted to vacuolar membrane. The transcription of MsNHX1 was up-regulated after high salinity treatment. Further-
more, the expression of MsNHX1 in yeast partly suppressed the salt-sensitive phenotype of yeast Na+/H+ antiporter mutant, indi-
cating that MsNHX1 was a functional Na+/H+ antiporter of alfalfa. The physiological analysis revealed that the expression of
MsNHX1 in Arabidopsis enhanced the resistance of transgenic plants to salt stress. These results suggest that MsNHX1 is a
vacuolar Na+/H+ antiporter and functions in salt tolerance of plants.
Keywords: Alfalfa; Na+/H+ antiporter gene; Arabidopsis; Salt tolerance
植物的生长发育受干旱, 高盐以及冻害等不良
环境因子的影响, 直接影响农作物的产量[1]。近几年
盐胁迫的危害日益突出, 高盐胁迫对植物的伤害主
要是离子毒害和渗透胁迫。离子毒害启动了膜质和
膜蛋白的过氧化作用, 造成膜损伤, 使质膜透性增
加, 植物表现盐害特征。渗透胁迫使土壤溶液的水
558 作 物 学 报 第 34卷

势降低, 造成生理干旱[2]。受到盐胁迫时, 植物通过
将 Na+运到液泡中或将 Na+从胞质排出从而避免了
过多的 Na+对细胞的毒害 , 维持细胞的渗透平
衡[3-5]。将 Na+转运到液泡中的区隔化作用是通过定
位于液泡膜上的 Na+/H+逆向转运蛋白完成的。最近
研究显示, Na+/H+逆向转运蛋白是植物耐盐的关键
因子之一。Apse 等 [6]的研究结果表明过量表达
Na+/H+逆向转运蛋白基因的转基因拟南芥植株在
200 mmol L−1 NaCl胁迫下能正常生长发育, 另外在
Na+敏感的酵母 nhx1 突变体中表达 AtNHX1 可部分
抑制该突变体的阳离子敏感表型[7]。除模式植物拟
南芥外, 近年来, 又有一些植物的 Na+/H+逆向转运
蛋白基因被陆续分离, 其中包括玉米[8]、滨藜[9]和陆
地棉[10]。这些 Na+/H+逆向转运蛋白基因都能在很大
程度上提高转基因植物的耐盐性。此外, 月季的液
泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因还能抑制潮霉素对酵
母 nhx1突变体的毒害, 表明这类基因应该和酵母液
泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因 ScNHX1 功能相同,
是一个定位于内膜上的转运蛋白, 在序列和功能上
具有保守性[11]。这些研究表明 Na+/H+逆向转运蛋白
在植物耐盐过程中具有重要作用。
紫花苜蓿是世界上产量最大, 营养价值最高的
优质牧草之一, 具有中度耐盐能力 [12-13]。因此研究
紫花苜蓿的耐盐机制对农作物品质改良具有重要意
义。本研究首次从紫花苜蓿中分离出一个 Na+/H+ 逆
向转运蛋白基因, 命名为 MsNHX1。洋葱表皮细胞瞬
时表达 MsNHX1-GFP融合基因后, 能够在液泡膜上
检测到较强的荧光信号。Northern 杂交发现该基因
的表达受高浓度 NaCl诱导。在酵母中表达 MsNHX1
可以部分互补酵母液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因
突变体的盐敏感表型。与野生型拟南芥相比, 表达
MsNHX1 基因的转基因植株能够耐受更高浓度的盐
胁迫。本研究表明 MsNHX1 是定位于液泡膜上的
Na+/H+逆向转运蛋白, 在通过遗传工程的方法提高
植物耐受盐胁迫的能力中有应用价值。
1 材料与方法
1.1 植物材料
紫花苜蓿种子(Medicago sativa L.)由山东农业
大学王洪刚教授惠赠。种子在(25±1)℃(16 h光照, 8
h 黑暗)水培萌发。拟南芥的播种参照 Clarke 的方
法[14]。
1.2 紫花苜蓿 Na+/H+逆向转运蛋白基因的分离
利用 RNA 提取试剂盒(Promega Corporation,
Madison, WI, USA)提取幼苗总 RNA, 利用 Promega
公司的 cDNA合成 Kit合成第 1条 cDNA链, 并以其
为模板进行 PCR扩增。根据拟南芥和水稻的液泡膜
Na+/H+逆向转运蛋白基因保守序列设计兼并引物:
5′-CA(T/C)TA(C/T)AC(C/T)TGGCA(C/T)AA(C/T)G
T-3′; 5′-CAT(G/C)AG(A/C/)CC(A/G/T)GCCCACC
(A/G/T)AT-3′。通过 PCR方法扩增获得 309 bp中间片
段, 测序结果显示该片段与其他 Na+/H+逆向转运蛋
白具有高度同源性。根据获得的中间片段设计 5′RACE
的特异性引物 5′-GGACAAGGTAGCAAAAGAAT
GCTT-3′, 采用 5′ RACE试剂盒克隆MsNHX1基因 5′
端序列。试剂盒内提供的锚定引物序列为 :
5′-CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTA
C(G)-3′。具体步骤按照 BIBCO-BRL 公司的 RACE
试剂盒说明书进行。MsNHX1 基因 3′端序列利用
3′RACE 的方法获得, 以特异引物 5′-ACTTGACTA
AAAAATCACAACA-3′和含有 oligo-dT 的锚定引物
5 ′-GACTCGAGTCGACATCGA(T)-3 ′为引物进行
P C R 反应。将所有扩增片段连接到克隆载体
pGEM-T Easy Vector上, 转化大肠杆菌。经过筛选和
酶切鉴定, 进行 DNA序列测定。经过序列比对验证
体外拼接得到 MsNHX1基因全长 cDNA序列。根据
拼接结果设计特异引物: 5′-CTCTAGAGACAGCTC
AGAAACATAAATATCTGG-3′和 5′-CGTCGACATT
TCATGGCTTCTTTTCTCAA-3′进行 PCR扩增, 获得
含有 MsNHX1基因全长编码框的 cDNA序列。
1.3 pBI121-MsNHX1-GFP表达载体的构建以及
MsNHX1蛋白定位的 GFP荧光检测
根据已知序列设计特异引物 5′-GTGGATCCGA
CAGCTCAGAAACATAAATATCTGG-3′和 5′-GTGCC
TCGACCCCATTGATTACCATTGCGT-3′进行 PCR
扩增。将扩增得到的 cDNA片段连接在 BamH I线性
化的含有GFP基因的表达载体 pBI121上, 将去掉终
止密码子的 MsNHX1 编码框连接在 GFP 蛋白的 N
末端, 构建 pBI121-MsNHX1-GFP表达载体, 使之在
35S 启动子的驱动下表达。以农杆菌浸染的方法转
化洋葱表皮细胞[15], 在荧光显微镜下观察侵染后的
洋葱表皮细胞检测荧光(BX51, model 7.3, Olympus,
Japan)。
1.4 Southern杂交分析
参照 Delloporta 等的方法用 CTAB 法提取紫花
第 4期 安宝燕等: 紫花苜蓿 Na+/H+逆向转运蛋白基因在拟南芥中表达提高转基因植株的耐盐性 559


苜蓿全基因组 DNA[16]。取 10 µg DNA用限制性内
切酶 EcoR I和 EcoR V分别酶切, 37℃保温 8~12 h。
1%的琼脂糖凝胶电泳分离酶解产物, 转移到硝酸纤
维素膜上, 65℃过夜预杂交。以 3端 800 bp的非保守
区片断为探针进行 Southern杂交(包括编码区和非编
码区序列)。65℃杂交 24 h。弃去杂交液, 依次用洗
液 2×SSC加 0.2%SDS和 0.2×SSC加 0.2%SDS洗膜。
−70℃放射自显影。
1.5 Northern杂交分析
水培 3 周后的紫花苜蓿幼苗, 以 200 mmol L−1
NaCl 处理 0、3、12、24、48 h, 分别取叶和根, 液
氮冷冻, 保存于−70℃。总 RNA提取方法如上所述。
Northern杂交方法参照 Sambrook等[17]。探针合成所
用模版与 Southern杂交相同。
1.6 在酵母中 MsNHX1的功能分析
用特异引物 5′-GTGGATCCGACAGCTCAGAA
ACATAAATATCTGG-3′和 5′-CTCTAGAATTTCAT
GGCTTCTTTTCTCAA-3′扩增MSNHX1全长编码区,
连接酵母表达载体 pYES2。用乙酸锂转化法[18-19]转
化 酵 母 nhx1 突 变 体 ATX3 (enal::HIS3::ena4,
nhal::LEU2, nhxl::TRP1, ura3-1)。对转化子进行抗性
检测, 选取 OD600=0.8 的酵母 YOD 液体培养液(1%
酵母提取物, 2%蛋白胨和 2%葡萄糖)取 2 µL并依次
稀释 10倍, 点在添加 50 mmol L−1 NaCl的固体培养
基上 30℃培养 48 h[7]。
1.7 拟南芥表达载体的构建以及农杆菌介导的
转化
用 Xba I和 Sal I双酶切含有MsNHX1的 pGEM-
T Easy 载体和植物表达载体 pBI121。将回收的
MsNHX1 cDNA片段和 pBI121载体片段连接。构建
好拟南芥表达载体 pBI121-MsNHX1, 转化农杆菌菌
株 GV3101, 然后利用花序浸染法转化拟南芥[20]。
1.8 转基因拟南芥的分子鉴定
利用特异引物 5′-CTCTAGAGACAGCTCAGAA
ACATAAATATCTGG-3′和 5′-CGTCGACATTTCAT
GGCTTCTTTTCTCAA-3′对 T1代卡那霉素抗性植株
进行分子水平检测。用 RNA 提取试剂盒 (BBI,
Shanghai Sangon, China)提取各个转基因株系和野生
型拟南芥总 RNA。
1.9 转基因拟南芥的耐盐试验
将野生型与转基因株系 TL1 的 T3代种子分别
播种于含 0、100和 200 mmol L−1 NaCl的 GM培养
基上, 20 d后计算各自的萌发率。GM培养基中萌
发的 TL1株系的 T3代卡那霉素抗性幼苗和野生型
幼苗移栽到填满基质的营养钵中, 正常生长 15 d后
浇灌 200 mmol L−1 NaCl溶液, 每 5 d浇灌 1次, 浇
灌 5次。
1.10 转基因拟南芥生理指标的测定
TL1 株系的 T3代植株和野生型植株分别用 200
mmol L−1 NaCl处理 0、1、2和 3 d后测定相关生理
指标。依照 Walker[21]的方法, 用 Clarke-type氧电极
(Hansatech, Kings Lynn, UK)测定光合放氧量。拟南
芥叶片的饱和渗透势(ψs100)由美国 VESCOR 公司
的蒸汽压渗透压计测定(5520; VESCOR, INC, USA),
测定方法参照 Verslues 等[22]。丙二醛(MDA)含量的
测定参照赵世杰等的方法[23]。
2 结果
2.1 紫花苜蓿 MsNHX1基因全长 cDNA的分离
紫花苜蓿幼苗用 200 mmol L−1 NaCl处理 12 h
后提取总 RNA, 以反转录产物为模板, 根据体外拼
接序列设计特异引物, 利用 RT-PCR方法扩增获得 1
840 bp的 cDNA片段。序列分析显示 MsNHX1基因
含有 1 623 bp的开放阅读框, 编码一个由 541个氨
基酸残基组成的蛋白 MsNHX1。该蛋白的氨基酸序
列与棉花、拟南芥和水稻的液泡型 Na+/H+逆向转运
蛋白序列有较高的同源性, 同源性分别为 77.3%、
75.7%和 72.7%(图 1-A)。而与拟南芥质膜 Na+/H+逆
向转运蛋白的序列同源性非常低, 只有 8.2%。此外,
MsNHX1 与 OsNHX1 和 GhNHX1 的 N-端结构域一
样, 都含有 12个跨膜片段, 包括液泡膜 Na+/H+逆向
转运蛋白非常保守的氨氯吡嗪咪结合位点
(84LFFIYLLPPI93)[8,10]。进化树分析结果也显示
MsNHX1与液泡型 Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系比
与质膜 Na+/H+逆向转运蛋白更近(图 1-B)。这些结果
显示MsNHX1为紫花苜蓿的一个液泡型Na+/H+逆向
转运蛋白。为进一步研究 MsNHX1在细胞中的定位
情况, 构建 pBI121-MsNHX1-GFP融合表达载体, 利
用农杆菌介导的方法转化洋葱表皮细胞[15], 用荧光
显微镜检测 MSNHX1::GFP融合蛋白的表达。如图 2
所示, 成熟的洋葱表皮细胞的液泡占了细胞的绝大
部分体积; 与对照细胞相比, 侵染后细胞的液泡膜
能够检测到较强的绿色荧光(图 2)。本研究结果进一
步证实 MsNHX1为液泡型 Na+/H+逆向转运蛋白。
560 作 物 学 报 第 34卷


图 1 Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列的同源比对
Fig. 1 Amino acid sequence analysis of Na+/H+ antiporters
A: 不同植物来源的 Na+/H+逆向转运蛋白序列的同源比对。NHX1的序列来源分别为: 紫花苜蓿 MsNHX1(AY513732); 棉花的
GhNHX1(AF515632); 拟南芥的 AtNHX1(NM_122597); 水稻的 OsNHX1(AB021878)。相同的氨基酸序列用黑色框起。序列中的原点
代表缺少的氨基酸。
B: 紫花苜蓿推测的 Na+/H+逆向转运蛋白与不同来源的 Na+/H+逆向转运蛋白聚类分析。序列来源如下: 紫花苜蓿 MsNHX1 (AY513732,
框出); 拟南芥 AtNHX1(NM_122597), AtNHX2 (AC009465), AtNHX3 (AC011623), AtNHX4 (AB015479), AtNHX5 (AC005287),
AtNHX6(AC010793), AtSOS1(AF256224); 水稻 OsNHX1 (AB021878), OsNHX2 (AAQ63678), OsNHX3 (ABA95118), OsNHX4
(BAD61599); 小麦 TaNHX1 (AY040245); 棉花 GhNHX1 (AF515632)。
A: alignment of amino acid sequences of NHX1 from several plant species. The accession numbers and sources of the NHX1 are as follows:
MsNHX1 (AY513732), Medicago sativa; GhNHX1 (AF515632), Gossypium hirsutum; AtNHX1(NM_122597), Arabidopsis thaliana; OsNHX1
(AB021878), Oryza sativa. Dark shading with white letters reflect 100% sequence conservation. The putative transmembrane domains are
boxed and indicated by roman letters.
B: a phylogenetic tree of putative Na+/H+ antiporter proteins. MsNHX1 (AY513732, boxed), Medicago sativa; AtNHX1(NM_122597),
AtNHX2 (AC009465), AtNHX3 (AC011623), AtNHX4 (AB015479), AtNHX5 (AC005287), AtNHX6 (AC010793) and AtSOS1 (AF256224)
from Arabidopsis thaliana; OsNHX1 (AB021878), OsNHX2 (AAQ63678), OsNHX3 (ABA95118) and OsNHX4 (BAD61599) from Oryza
sativa; TaNHX1 (AY040245), Triticum aestivum; GhNHX1 (AF515632), Gossypium hirsutum. The phylogentic tree was generated by using
DNAMAN Version 4 (Lynnon biosoft, USA).
第 4期 安宝燕等: 紫花苜蓿 Na+/H+逆向转运蛋白基因在拟南芥中表达提高转基因植株的耐盐性 561



图 2 MsNHX1-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中的瞬时表达
Fig. 2 Vacuolar membrane localization of pBI121-MsNHX1::GFP
transient expression in onion epidermal cell
A和 B: 表达 pBI121-MsNHX1-GFP蛋白的成熟的洋葱表皮细胞。
C: 只表达 pBI121-GFP蛋白的洋葱表皮细胞。标尺为 50 µm。
A and B: vacuolar membranes (Vm) of epidermal cells expressing
pBI121-MsNHX1-GFP construct. GFP expression was concentrated
to the tonoplast. C: an onion epidermal cell expressing pBI121-GFP
only as the control. Bar = 50 µm.

2.2 MsNHX1基因的表达分析
将水培三周的紫花苜蓿用 200 mmol L−1 NaCl
分别处理 0、3、12、24和 48 h, 分别提取不同处理
时间叶和根的总 RNA, 以 MsNHX1较不保守的 3端
800 bp 片段为模板合成探针, 进行 Northern 杂交。
结果表明, 该基因在叶和根中皆有表达, 说明其在
紫花苜蓿中的表达没有组织特异性。但是我们发现
NaCl处理后该基因在叶和根中的表达都有不同程度
的上调(图 3-A)。在根中, NaCl处理 3 h后, MsNHX1
基因表达量明显提高; 而且在叶中, 该基因的表达
量增加更加明显。表明 MsNHX1在叶中的功能可能
更强。
为了弄清MsNHX1基因在苜蓿基因组中的情况,
我们进行了 Southern 杂交。首先提取苜蓿的基因组
DNA, 然后分别用 EcoR I和 EcoR V酶切, 以MsNHX1
较不保守的 3′端 800 bp片段为模板合成探针。结果
表明, 通过放射自显影观察到至少有 4条带(图 3-B),
说明在紫花苜蓿基因组中可能存在一个小的 Na+/H+
逆向转运蛋白基因家族。
2.3 MsNHX1互补酵母突变体ATX3盐敏感缺陷型
酵母 nhx1突变菌株 ATX3部分丧失了 Na+转运
能力, 因此在含有 NaCl的培养基中生长受到明显的
抑制。将 MsNHX1全长 cDNA连接到酵母表达载体
p Y E S 2 上 , 用乙酸锂转化法转入酵母突变体
ATX3(enal::HIS3::ena4, nhal::LEU2, nhxl::TRP1,

图 3 MsNHX1基因的表达分析
Fig. 3 Molecular analysis of MsNHX1 gene
A: 200 mmol L−1 NaCl处理后紫花苜蓿叶和根中 MsNHX1基因的
诱导表达。B: MsNHX1基因的 Southern杂交分析。
A: upregulated expression of MsNHX1 mRNA at the indicated time
after treatment with 200 mmol L-1 NaCl in the leaves and roots.
Total RNA (20 µg per well) was isolated from leaves and roots of
10-day-old water-cultured alfalfa at indicated time after 200 mmol
L-1 NaCl treatment. The isolated RNA was hybridized with
32P-labeled 3′ fragment of MsNHX1. B: southern blot analysis of
MsNHX1 in alfalfa genome. Genomic DNAs from Medicago sativa
leaves (15 µg) was digested with EcoRⅠ and EcoR , respectively Ⅴ
and hybridized with 32P-labeled 3′ fragment of MsNHX1.

ura3-1)。MsNHX1 在 ATX3 中的表达可以明显促进
转化子在含有 50 mmol L−1 NaCl的 YPD培养基上的
生长(图 4), 表明 MsNHX1 与酵母 Na+/H+逆向转运
蛋白 ScNHX1具有一定的功能相似性[25]。

图 4 在酵母 Na+/H+逆向转运蛋白突变体中表达 MsNHX1能抑
制突变体对盐的敏感性
Fig. 4 Expression of MsNHX1 in yeast nhx1 mutant
MsNHX1连入酵母表达载体 pYES2并被转入酵母突变体ATX3, 未
转化的以及转入空载体的酵母突变体作为对照。2 µL酵母菌液依次
稀释10倍点在添加和没有添加50 mmol L−1 NaCl的YPD培养基(1%
酵母提取物, 2%蛋白胨和 2% D-葡萄糖)上, 30℃培养 48 h以上。
The complete MSNHX1 was subcloned into pYES2. The pYES2
empty vector and pYES2-MsNHX1 construct were transformed into
ATX3 (∆nhx1). The mutant strain ATX1 is used as the control. 2
µL saturated yeast solutions or 10-fold serial dilutions were spotted
onto YPD (1% Yeast extract, 2% Peptone and 2% D-Galactose)
plates with or without 50 mmol L−1 NaCl. The plates were grown at
30 for 48 h.℃

2.4 异源表达 MsNHX1 提高转基因拟南芥的耐
盐能力
为了研究 MsNHX1在植物体中的功能, 我们构
562 作 物 学 报 第 34卷

建了表达载体 pBI121-35S-MsNHX1并转化拟南芥。
对转基因 T1代植株进行基因组 PCR检测, 有 6个转
基因株系可以扩增出目的片段(1.84 kb)(图 5-A), 而
野生型拟南芥中检测不到相应条带。设计特异引物
利用 RT-PCR方法进一步检测外源基因的表达情况。
如图 5-B 所示, 其中转基因株系 TL1、TL4 和 TL6
中能检测到较强的表达信号, 说明 MsNHX1 在这 3
个转基因株系中的表达水平较高。

图 5 转基因拟南芥的 PCR和 RT-PCR检测
Fig. 5 PCR and RT-PCR analysis of transgenic Arabidopsis plants
A: 以 T1代转基因植株和野生型对照的叶片基因组为模板进行
基因组 PCR检测。P, 阳性对照, 含有 0.1 µg pBI121-MsNHX1
表达载体; TL1~TL6, 不同的转基因株系 1~6; WT, 野生型拟南
芥为阴性对照; M, DNA marker DL-2000。B: 转基因拟南芥的
RT-PCR分析。分别从 T1转基因及非转基因植株中提取总 RNA
反转录作为 PCR分析的模板。
A: Genomic DNA as templates for PCR analysis was extracted from
leaves of T1 transgenic and non-transgenic plants. P, Positive con-
trol, 0.1 µg expression vector PBI121-MsNHX1; TL1–TL6, the
transgenic lines 1–6; WT, Wild-type Columbia plants as negative
control; M, DNA marker DL-2000. B: RT-PCR analysis of MsNHX1
expression in transgenic plants. Total RNA was isolated from T1
transgenic and non-transgenic.

将 TL1(转基因株系 1)株系 T3代纯合系的转基
因种子和野生型种子一起播种在含不同 NaCl 浓度
的 GM培养基上, 在短日照放置 20 d左右观察它们
的生长情况。在不含 NaCl的 GM培养基上, 转基因
和野生型植株生长状况良好。在含 100 mmol L−1
NaCl的 GM培养基上, 野生型植株生长较弱而转基
因植株生长良好。在含 200 mmol L−1 NaCl的 GM培
养基上, 野生型植株在 20 d 左右大部分已死亡, 转
基因植株虽然生长较弱但仍能继续生长(图 6-A)。
将转基因的种子和野生型种子播种在 GM 培养
基上, 7 d后选择生长健壮的幼苗移栽至盛满基质的
营养钵中, 浇灌 200 mmol L−1 NaCl溶液, 约 1个月
后 , 野生型植株生长都逐渐停止 , 叶片黄化 , 植株
矮小, 最终枯萎死亡。而转基因植株能够开花结果,
完成正常的生活史(图 6-B)。

图 6 转基因和野生型拟南芥植株耐盐性分析
Fig. 6 Salt tolerance analysis of the wild-type and transgenic
Arabidopsis plants overexpressing MsNHX1
A: T3代的纯合系转基因拟南芥和野生型拟南芥种子在含 0、100
和 200 mmol L−1 NaCl的 GM培养基上生长 20 d; B: 200 mmol L−1
NaCl溶液处理转基因和野生型拟南芥植株 30 d。
A: The seed germination of the wild-type Arabidopsis (WT) and T3
generations of TL1 (T) after 20 days on GM medium containing 0,
100, and 200 mmol L−1 NaCl. B: The growth of T3 generation
transgenic plants (T) and wild-type plants (WT) irrigated with 200
mmol L−1 NaCl for 30 days.

2.5 盐胁迫处理对转基因和野生型拟南芥生理
指标的影响
为了检测盐胁迫对转基因植株光合机构的影响,
我们测定了盐胁迫下 TL1株系 T3代的转基因植株和
野生型植株的放氧活性。盐胁迫处理前转基因和野
生型植株的放氧活性并没有显著的差别。NaCl处理
后, 转基因和野生型植株光合速率都下降但野生型
下降的更明显(图 7-A), 表明在盐胁迫下 TL1转基因
株系的光系统Ⅱ受到更好的保护。
渗透调节能力大小是反映植物耐逆能力的一项
重要指标, 对于细胞膨压的维持具有重要意义[26-27]。
NaCl 处理 3 d 后, 我们发现与野生型对照相比 TL1
转基因株系具有更强的渗透调节能力(图 7-B)。
丙二醛(MDA)作为膜质过氧化作用的主要产物
之一, 在盐胁迫条件下有大量积累[28]。胁迫处理后
细胞内的 MDA水平直接反应了细胞的抗氧化活性。
NaCl处理 24 h和 48 h后, 野生型和转基因拟南芥的
MDA 含量皆有增加, 但是转基因植株的 MDA 含量
增加缓慢(图 7-C)。
3 讨论
高盐胁迫是影响植物生长和农作物产量的主要
非生物逆境之一。为了减轻盐胁迫的伤害, 植物进
化出不同的机制来限制 Na+的摄取, 或者将过量的
第 4期 安宝燕等: 紫花苜蓿 Na+/H+逆向转运蛋白基因在拟南芥中表达提高转基因植株的耐盐性 563



图 7 盐胁迫处理对TL1转基因株系和野生型植株生理指标的影响
Fig. 7 Physiological analysis of TL1 and wild-type plants under
salt treatment
A: 200 mmol L−1 NaCl处理对 TL1转基因株系和野生型植株放氧
活性的影响; B: 200 mmol L−1 NaCl处理对 TL1转基因株系和野
生型植株叶片的渗透调节能力的影响; C: 200 mmol L−1 NaCl处
理对 TL1转基因株系和野生型植株MDA含量的影响; 图中的数
据为 5个重复的平均值±SE。
A: photosynthetic oxygen evolution of the TL1 and wild-type plants
treated with 200 mmol L−1 NaCl; B: leaf osmotic adjustment capa-
city of the TL1 and wild-type plants treated with 200 mmol L−1 NaCl;
C: the MDA contents of the TL1 and wild-type plants treated with 200
mmol L−1 NaCl. Each value is the mean of five measurements ±SE.

Na+转移到到液泡中。从而避免过多 Na+在胞质内的
积累, 维持渗透平衡。Na+/H+逆向转运蛋白在这一过
程中起关键作用。紫花苜蓿作为一类重要的豆科牧
草是具有中度的耐盐能力, 因此研究紫花苜蓿的耐
盐机制对耐盐育种工作具有重要的指导意义。本研
究首次从紫花苜蓿中分离到一个液泡型 Na+/H+逆向
转运蛋白基因。序列分析表明, MsNHX1与拟南芥质
膜型 Na+/H+逆向转运蛋白 AtSOS1[24]的序列同源性
很低, 不同来源的 Na+/H+逆向转运蛋白的聚类分析
结果说明MsNHX1可能是液泡型Na+/H+逆向转运蛋
白[6,8,10]。进一步的研究发现, MsNHX1 与绿色荧光
蛋白的融合蛋白定位在洋葱表皮的液泡膜上, 这可
以进一步地确认MsNHX1是液泡膜Na+/H+逆向转运
蛋白。
Northern 杂交结果显示, MsNHX1 基因的表达
受盐诱导而且其表达模式与水稻、拟南芥和棉花液
泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白相似 [6,10,30], 据此推测该
蛋白可能与紫花苜蓿的耐盐能力有关。MsNHX1 可
以部分互补酵母 nhx1 突变体的盐敏感表型, 说明
MsNHX1 的确参 Na+的运输并且在植物的耐盐过程
中起重要作用。此外, 在拟南芥中表达 MsNHX1 可
以明显提高转基因植株的耐盐能力。生理指标测定
结果表明表达 MsNHX1 可以提高转基因植株在盐胁
迫下渗透调节能力, 降低膜质的过氧化作用。以上
研究结果充分显示MsNHX1是紫花苜蓿耐盐过程中
一个重要的功能蛋白。
4 结论
本研究首次从紫花苜蓿中分离到一个液泡
Na+/H+逆向转运蛋白基因MsNHX1, 具有Na+转运活
性。MsNHX1的表达受到盐胁迫的诱导, 在拟南芥中
表达该基因可以提高转基因株系的耐盐能力。

致谢: 感谢西班牙 Consejo Superior de Investigaciones
Científcas的 José M. Pardo博士提供了酵母 AXT3突变
体。感谢山东农业大学王洪刚教授惠赠紫花苜蓿
(Medicago sativa)种子。本研究得到了国家转基因植物
研究与产业化开发专项项目(JY-03-A-02)和国家高技
术研究发展计划(863 计划)项目(2004AA212131)的
支持。
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