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2014,43(3): 202 ~ 205.
Subtropical Plant Science
大孔树脂分离纯化有柄石韦总黄酮的工艺优化
刘 静，程丹丹，辛晓伟，高德民，张宏萌
（山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355）
摘 要：以总黄酮解吸率和滤液中总黄酮含量为指标，通过正交实验设计优选大孔树脂分离纯化有柄石韦总黄
酮的最佳工艺。结果表明，D-101 型大孔树脂分离纯化总黄酮的优选工艺条件为：上样液质量浓度 0.5 mg·mL-1，
pH为 6，洗脱剂乙醇浓度为 50%，洗脱速率 2 mL·min-1。该优化方法稳定可行，结果可靠，提取的滤液中总黄
酮含量达 76.40%。
关键词：大孔吸附树脂; 有柄石韦; 总黄酮; 分离纯化
Doi: 10.3969/j.issn.1009-7791.2014.03.004
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2014)03-0202-04
Optimization of Separation and Purification Procedure of Total Flavonoids in
Pyrrosia petiolosa by Macroporous Adsorption Resin
LIU Jing, CHENG Dan-dan, XIN Xiao-wei, GAO De-min, ZHANG Hong-meng
(School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong China)
Abstract: To select the optimum purifying process of total flavonoids in Pyrrosia petiolosa,
orthogonal experiment was designed with the desorption rate of total flavonoids and the content of
total flavonoids as indexes. The results showed that the best separation conditions were determined as:
sample concentration 0.5 mg·mL-1 at pH 6, eluent concentration 50%, elution rate 2 mL·min-1 by
D-101 macroporous resin. The concentration of total flavonoids in the filtrate could reach 76.40%, and
the method was stable and feasible, and the result was reliable.
Key words: macroreticular resin; Pyrrosia petiolosa; total flavonoids; separation and purification
有柄石韦Pyrrosia petiolosa为水龙骨科Polypodiaceae石韦属植物，具有利尿通淋、清热止血、清肺
泄热之功效。有柄石韦药材主含三萜类、黄酮类、甾体及挥发油等活性成分，具有镇咳祛痰、抑菌、
抗病毒、抗炎利尿、抗氧化、增强免疫、护肾等药理作用[1—2]。黄酮类化合物具有抗炎抑菌、降血糖、
抗氧化、抗辐射、抗癌、抗肿瘤以及增强免疫力等药理作用[3]，故分离纯化石韦总黄酮对促进石韦的
临床应用具有重要意义。
大孔吸附树脂广泛应用于中药化学成分分离纯化[4]。大孔树脂分离纯化黄酮类化合物可得到良好
效果[5]。目前大孔树脂分离纯化石韦总黄酮的研究鲜见报道。本研究通过不同极性大孔树脂对石韦总
黄酮吸附性能的比较，筛选出最佳树脂型号，并优选最佳分离纯化工艺。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
DJ-2000000670 超声波清洗机，Y201304032 上海菁海电子天平，N1205003 紫外可见分光光度计，
上海树立 FXB101-1 型电热鼓风干燥箱，菏泽鑫源 RE52D-101 旋转蒸发器。芦丁标准品（上海金穗生
收稿日期：2014-04-15
基金项目：山东中医药大学 2013 年 SRT 项目
作者简介：刘静，本科生，中药学专业。E-mail: yxy012yjs@126.com
注：张宏萌为通讯作者。E-mail: zyx00913@163.com
第 3 期 刘静,等：大孔树脂分离纯化有柄石韦总黄酮的工艺优化 ﹒203﹒
物科技有限公司，20130917），AB-8、D-101、HPD-100 大孔树脂（安徽三星树脂科技有限公司），
氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、盐酸均为分析纯，水为纯化水。
1.2 材料
有柄石韦 Pyrrosia petiolosa 采自山东蒙山。标本经山东中医药大学药学院高德民副教授鉴定，保
存于山东中医药大学标本馆，凭证标本号为 20132206。
1.3 方法
1.3.1 总黄酮提取 称取一定量的有柄石韦干燥粉末（过 40 目筛），石油醚脱脂后以 70%乙醇、料液
比 1∶10 超声提取 60 min，提取液浓缩备用。
1.3.2 大孔树脂筛选
1.3.2.1 大孔树脂预处理 取AB-8、D-101、HPD-100 三种大孔树脂各 40 g, 按以下顺序处理：95%乙醇
充分浸泡 24 h，蒸馏水洗至无醇味；5% HCl溶液浸泡过夜，蒸馏水洗至中性；5% NaOH溶液浸泡过夜，
蒸馏水洗至中性；湿法装柱，95%乙醇清洗至流出液澄清为止，蒸馏水洗至无醇味，备用[6—7]。
1.3.2.2 大孔树脂对有柄石韦总黄酮静态吸附性能比较 取处理好的三种大孔树脂，分别置于 500 mL
锥形瓶中，精确加入上述有柄石韦总黄酮提取液（测得总黄酮含量为 5.40 mg·mL-1）100 mL，充分混
匀，室温下放置 24 h，待充分吸附后过滤，测定滤液中石韦总黄酮的质量浓度，计算树脂饱和吸附量
及吸附率。静态饱和吸附后滤出树脂用蒸馏水清洗干燥后，分别置于 500 mL锥形瓶中，加 95%乙醇
100 mL洗脱，充分混匀，室温下放置 24 h，过滤，测定洗脱液中石韦总黄酮的质量浓度，计算解吸率
及滤液浓度。药液中黄酮含量采用分光光度法，以芦丁为标准品，在 510 nm波长处测定。
饱和吸附量＝(初始质量浓度－吸附后质量浓度)×吸附液体积/树脂量。
吸附率＝吸附量/上样量×100%
解吸率＝(洗脱液质量浓度×洗脱液体积)/吸附量×100%
洗脱液总黄酮纯度＝(洗脱液中总黄酮质量浓度×洗脱液体积)/洗脱液干膏质量×100%
1.3.2.3 大孔树脂对有柄石韦总黄酮动态吸附性能比较 将大孔树脂湿法装柱，加入 4.12 mg·mL-1上样
液 100 mL，用蒸馏水洗至流出液近无色，再用 95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，测定洗脱液中总黄酮
含量，计算树脂吸附量、吸附率、解吸率。
1.3.3 上样液质量浓度考察 取备用D-101 型大孔树脂湿法装柱，分别加入 0.5 mg·mL-1上样液 100 mL，
0.625 mg·mL-1上样液 80 mL，1.0 mg·mL-1上样液 50 mL，1.67 mg·mL-1上样液 20 mL，完全吸附后，用
蒸馏水洗至无色，50%乙醇以 2 mL·min-1 洗脱速度进行洗脱，收集洗脱液，分别测定洗脱液中总黄酮
含量，计算转移率和滤液中总黄酮含量。
洗脱液总黄酮转移率＝(洗脱液中总黄酮质量浓度×洗脱液体积)/(上样液总黄酮质量浓度×上样
液体积)×100%; 洗脱液总黄酮含量＝(洗脱液中总黄酮质量浓度×洗脱液体积)/洗脱液干膏质量×
100%。
1.3.4 分离纯化条件的考察 将D-101 大孔树脂进行
预处理并湿法装柱，上样液 0.5 mg·mL-1 100 mL，以流
速、上样液pH值、洗脱液浓度等因素设计正交实验，
以总黄酮解吸率、滤液中总黄酮浓度为指标，对大孔树
脂分离纯化总黄酮进行工艺优选（表 1），并选用L9(34)
正交表安排试验。
表 1 正交试验因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
因素 水平 流速(A)/BV·h-1 乙醇浓度(B)/% pH (C)
1 1 50 3.0
2 2 70 4.5
3 3 90 6.0
2 结果与分析
2.1 大孔树脂对有柄石韦总黄酮的静态吸附性能
三种大孔树脂对有柄石韦总黄酮静态吸附性能实验结果见表 2。由表 2 可知，AB-8、D-101 型树
脂对总黄酮吸附量、吸附率均较大，且无明显差异，HDP-100 型树脂的解吸率较大，D-101 型树脂纯
第 43 卷 ﹒204﹒
化后滤液中黄酮含量较高，故 D-101 型树脂对总黄酮静态吸附性能较好。
表 2 三种大孔树脂对有柄石韦总黄酮的静态吸附性能
Table 2 The static performance of three kinds of macroporous resin for Pyrrosia petiolosa total flavonoids
型号 吸附量/mg·g-1 吸附率/% 解吸率/% 滤液浓度/%
AB-8 13.15 97.67 60.64 67.13
D101 13.31 98.70 60.60 69.82
HDP-100 10.89 80.78 73.55 68.42
2.2 大孔树脂对有柄石韦总黄酮的动态吸附性能
三种大孔树脂对有柄石韦总黄酮静态吸附性能实验结果见表 3。由结果可得，HDP-100 型树脂对
总黄酮吸附率较大，但解吸率较小。AB-8、D-101 型树脂对总黄酮的吸附量、吸附率无显著差异。D-101
型树脂对总黄酮解吸率、所得石总黄酮滤液浓度最高。
通过树脂对有柄石韦总黄酮动、静态吸附性能的比较，D-101 型大孔树脂对总黄酮具有较好分离
纯化作用。
表 3 大孔树脂对有柄石韦总黄酮的动态吸附性能比较
Table 3 The dynamic performance of three kinds of macroporous resin for Pyrrosia petiolosa total flavonoids
型号 吸附量/mg·g-1 吸附率/% 解吸率/% 滤液浓度/%
AB-8 10.03 97.46 70.90 68.58
D101 10.04 97.64 81.06 79.15
HDP-100 10.14 98.48 69.64 69.11
2.3 上样液质量浓度对有柄石韦总黄酮分离纯化效果的影响
上样液质量浓度对有柄石韦总黄酮分离纯化效果
的影响结果见表 4。由表中数据可确定最佳的上样液浓
度为 0.5 mg·mL-1，上样液体积 100 mL。
2.4 分离纯化条件优化
正交试验结果见表 5、表 6。由此可见，最佳工艺条
件是：A2B1C3，即上样液pH值为 6，50%乙醇，洗脱速
率 2 BV·h-1。三个因素对有柄石韦总黄酮分离纯化的影响程度依次为：洗脱液浓度>洗脱速率>pH值。
表 4 上样液质量浓度的考察
Table 4 The sample concentration
浓度/mg·mL-1 转移率/% 总黄酮浓度/%
0.5 86.02 73.14
0.625 80.08 71.25
1.0 75.21 67.09
1.67 71.05 63.14
表 5 正交试验设计及结果分析
Table 5 Arrangement and results of orthogonal test
因素 试验号
A B C
解吸率/% 滤液中总黄酮浓度/%
1 1 1 1 82.00 70.70
2 1 2 2 76.11 63.27
3 1 3 3 70.80 62.31
4 2 1 2 81.60 64.86
5 2 2 3 84.40 72.97
6 2 3 1 77.51 65.12
7 3 1 3 78.00 63.62
8 3 2 1 65.34 59.21
9 3 3 2 75.24 66.34
K1 196.29 199.18 195.03
K2 202.95 195.45 194.47
K3 189.18 193.77 198.90
k1 65.43 66.39 65.01
k2 67.65 65.15 64.82
k3 63.06 64.59 66.30
R 4.49 1.80 1.29
﹒205﹒第 3 期 刘静,等：大孔树脂分离纯化有柄石韦总黄酮的工艺优化
2.5 工艺验证
以D-101 型大孔树脂装柱(2 cm×
20 cm)，装柱高度为 10 cm，以 100 mL
质量浓度为 0.5 mg·mL-1上样液(pH 6)
上样，50%乙醇以 2 BV·h-1洗脱速率洗
脱，重复试验 3 次，总黄酮解吸率为
83.65%±0.56%，洗脱液中总黄酮浓度
为 76.40%±0.72%，实验结果可靠，稳定。
表 6 方差分析
Table 6 Analysis of variance
因素 偏差平方和 自由度 均方 F P
A 0.012 2 0.006 1.714 >0.05
B 0.009 2 0.0045 1.286 >0.05
C 0.001 2 0.0005 0.143 >0.05
3 结语
在中药有效成分的提取纯化方面应用大孔吸附树脂较多的有皂苷类、黄酮类和生物碱类等。大孔
吸附树脂具有吸附性能好、化学性质稳定、不受酸碱影响、价格低廉、可重复利用和操作简单的优点，
中药和天然药物经大孔吸附树脂处理后，可除去大部分糖类和水溶性杂质，相对于萃取分离，能节约
试剂，且分离效率高。
有柄石韦是常用中药，药材资源相对匮乏。临床上常出现非药用石韦替代药用石韦的现象，严重
影响了临床疗效。黄酮类成分为有柄石韦的有效成分之一，对其含量测定是确保药品质量的基础。通
过对AB-8、D-101、HPD-100 型三种树脂的筛选，以及上样液浓度、洗脱条件等因素对石韦总黄酮分
离纯化工艺影响的研究，获得分离纯化石韦总黄酮的最佳工艺条件：D-101 型树脂，上样液质量浓度
0.5 mg·mL-1, 洗脱剂乙醇浓度为 50%，pH为 6，洗脱速率 2 BV·h-1。该实验为石韦的进一步研究提供科
学依据。
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