全 文 ：上海中医药杂志 2011年第 45卷第 8期 SH． J． TCM Aug．，2011;Vol． 45 No． 8
鸟巢蕨水提取液对兔成骨细胞的影响
陈庆玉1，寇冬权1，王 伟1，张 伟1，程少文1，林忠勤1，吕传柱2，彭 磊1，2
1．温州医学院附属第二医院骨科(浙江 温州 325000) ;2．海南医学院附属医院创伤中心(海南 海口 570102)
【摘要】 目的 研究鸟巢蕨水提取液对体外培养成骨细胞增殖及分化作用的影响，探讨其促进骨折愈合、防治骨质疏松的机制。方
法 将不同浓度的鸟巢蕨提取液(分别为 0g /L、1． 0g /L、1． 2g /L、1． 4g /L、1． 5g /L、1． 6g /L、2． 0g /L，共 7 组)与成骨细胞共同体外培养，
进行相应的干预。观察细胞形态，检测成骨细胞增殖与分化指标(包括Ⅰ型胶原蛋白、碱性磷酸酶、骨钙素量、钙盐沉积量和矿化结
节)。结果 与同一时间点的空白组比较，除第 1 天的 1． 0g /L 组外，其余各组的成骨细胞增殖差异均具有统计学意义(P ＜ 0． 01)。
与空白组比较，其余组别平均光密度值、碱性磷酸酶含量、骨钙素含量、钙沉积量差异均具有统计学意义(P ＜ 0． 01)。与空白组比较，
除 1． 0g /L组外，其余组别矿化结节数差异均具有统计学意义(P ＜ 0． 01)。同一时间点 1． 6g /L组与 2． 0g /L组比较，成骨细胞增殖差
异均无统计学意义(P ＞ 0． 05) ;1． 6g /L组与 2． 0g /L组比较，平均光密度值、碱性磷酸酶含量、骨钙素含量、矿化结节数差异无统计学
意义(P ＞ 0． 05) ，钙沉积量差异具有统计学意义(P ＜ 0． 01)。结论 鸟巢蕨水提取液对成骨细胞的增殖分化具有促进作用，适宜浓度
下具有促进成骨细胞增殖分化作用，过高浓度后作用达到饱和。
【关键词】 鸟巢蕨;成骨细胞;骨钙素;骨质疏松
【中图分类号】 R285． 5 【文献标志码】 A 【文章编号】 1007-1334(2011)08-0069-04
Effects of water extract of Neottopteris nidus on osteoblasts
CHEN Qing-yu1，KOU Dong-quan1，WANG Wei1，ZHANG Wei1，CHENG Shao-wen1，LIN Zhong-qin1，
LU Chuan-zhu2，PENG Lei1，2
1． The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Zhejiang;2． The Affiliated Hospital of Hainan Medical College
Abstract:Objective To study the effects of water extracts of Neottopteris nidus on the proliferation and differentiation of osteoblasts in vitro in an attempt to investi-
gate its mechanisms in promoting fractured bones healing and preventing osteoporosis． Methods Culture the osteoporosis and the water extract of Neottopteris nidus
respectively at the concentrations of 0g /L，1． 0g /L，1． 2g /L，1． 4g /L，1． 5g /L，1． 6g /L and 2． 0g /L in vitro;and then observe cell morphology，detect the prolif-
eration and differentiation indicators of osoteoblasts such as type I collagen，alkaline phosphatase，osteocalcin，calcium deposition and mineralized nodules． Re-
sults There was a significant difference in the osoteoblasts proliferation in every experimental group (except the 1． 0g /L on the first day)compared with the con-
trol group at the same time (P ＜ 0． 01) ;there was a significant difference between all the experimental groups and the control group in the average optical density，
alkaline phosphatase content，osteocalcin content and the amount of calcium deposition(P ＜ 0． 01) ;there was a significant difference between all the experimental
groups (except 1． 0g /L group)and the control group in the number of mineralized nodules(P ＜ 0． 01)． Between the 1． 6g /L and 2． 0g /L groups，there was no sig-
nificant difference in the osoteoblasts proliferation at the same time(P ＞ 0． 05) ，and there was no significant difference in the average optical density，alkaline
phosphatase content，osteocalcin content and the number of mineralized nodules(P ＞ 0． 05) ，but there was a significant difference in the amount of calcium deposi-
tion(P ＜ 0． 01)． Conclusion The water extract of Neottopteris nidus can promote the proliferation and differentiation of osteoblasts;specifically，probable concen-
tration of the Extract can promote the proliferation and differentiation of osteoblast，and high concentration of the Extract makes the effect saturated．
Key words:Neottopteris nidus;osteoblasts;osteocalcin;osteoporosis
［基金项目］浙江省卫生厅中医药优秀青年人才基金计划项目
(2010C521002)
［作者简介］陈庆玉，男，硕士生，主要从事骨创伤修复研究工作。
［通讯作者］彭磊，副教授，硕士生导师。
E-mail:xiaobo197518@ 163． com
鸟巢蕨，别名山苏花、七星剑等，为蕨类植物药铁
角蕨科植物巢蕨的全草，具有强壮筋骨、活血祛瘀、清
热解毒、利尿消肿、通络止痛之功效，临床多用于治疗
跌打损伤、骨折、血瘀［1］。在我国海南、广州、云南等
地，当地百姓治疗骨伤时外敷鸟巢蕨药泥于伤处外部，
或结合煎汤内服，能很好地促进骨折愈合［1］。本实验
通过观察鸟巢蕨提取液对成骨细胞增殖分化的影响，
探讨其促进骨折愈合、防治骨质疏松的机制。
1 材料
1． 1 动物 日本大耳白兔仔，购于温州医学院实验动
物中心，动物许可证号:SCXK(浙)2006-0026。
1． 2 药材与试剂 鸟巢蕨药材，购自安徽亳州地区医药
公司，经本校生药研究室鉴定为正品 Neottopteris nidus。
RPMI-1640 培养基，Sigma 公司;胎牛血清，杭州四
季青生物工程材料研究所;胰蛋白酶，华美生物有限公
·96·
DOI:10.16305/j.1007-1334.2011.08.031
上海中医药杂志 2011 年第 45 卷第 8 期 SH． J． TCM Aug．，2011;Vol． 45 No． 8
司;地塞米松，Sigma 公司;β-甘油磷酸钠，Sigma 公司;
维生素 C，Sigma 公司;四环素盐酸盐，Sigma 公司;I 型
胶原免疫组化试剂盒，基因公司。
1． 3 仪器 CO2 培养箱，美国 F． S;超净工作台，上海
上净净化设备有限公司，CA-920-3;倒置相差显微镜，
OLYMPUS公司;37℃水浴恒温振荡器，上海跃进医疗
器械厂，XMTD-8000;扫描电镜，泰思肯贸易(上海)有
限公司;图像分析系统，美国 Image-Pro Plus。
2 方法
2． 1 鸟巢蕨水提取液的制备 取干燥鸟巢蕨 150g，加
双蒸水过液面 2cm，煮沸 3 次，每次 30min。合并滤液，
浓缩至 300ml 后，加 3 倍量 95%乙醇，冰箱静置过夜，
次日减压过滤，并回收滤液中乙醇，继续浓缩滤液得无
醇味的提取物。提取物加双蒸水至 150ml，使药液为含
生药 1g /ml(用 0． 5%NaOH调整 pH为 7． 0) ，置冰箱中
备用。
2． 2 兔成骨细胞的原代培养与纯化［2］ 处死初生兔
仔，75%酒精浸泡 5min，无菌条件下取其颅盖骨，刮去
软组织，无菌 Hank’s 液(含青霉素 3 × 105 IU /L、链霉
素 3 × 105μg /L)冲洗后，剪成约 1mm3 大小的碎块，用
0． 25%胰蛋白酶 37℃搅拌消化 15min，弃消化液，无血
清培养液反复吹打清洗后，将组织块均匀铺在细胞培
养瓶底，加少量含 10%胎牛血清的 1640 完全培养液，
倒置于 37℃含 5% CO2 的培养箱，4h后，小心添加足量
1640 完全培养液，继续培养，每 3 天换液 1 次。细胞长
满瓶底时，用 0． 25%胰蛋白酶消化，细胞悬液先接种到
培养瓶内，5min后轻吸出含未贴壁细胞的培养液，再接
种于另一培养瓶中，重复这一操作 3 次，纯化成骨细
胞。继续培养用第 3 代细胞进行以下实验。
2． 3 细胞鉴定
(1)倒置显微镜下观察:培养 2 天，大部分细胞贴
壁，贴壁后细胞主要呈圆形及鳞片形;2-3 天细胞突起
伸展，长满瓶底时为梭形及方块状，排列致密，随培养
时间延长，可见成骨细胞呈多层生长。
(2)碱性磷酸酶染色:原代细胞培养时于 4 孔培养
板中分别置一盖玻片，分别在培养的第 7 天和 10 天，
用 Gomori钙钴法行碱性磷酸酶染色。
2． 4 指标检测
2． 4． 1 对正常兔成骨细胞增殖的影响 采用 MTT 法
测定鸟巢蕨对正常兔成骨细胞增殖的影响。RPMI-
1640 培养基培养液的成骨细胞消化传代后，调整细胞
浓度为 1 × 105 /ml，加入 96 孔细胞培养板中，每孔加入
180μl该培养液，放入 37℃ 5% CO2 培养箱内培养 24h
后(显微镜下观察细胞生长情况) ，待细胞生长合适后，
弃去 96 孔板中的细胞培养液，加入无血清培养基
180μl，然后分别加入不同浓度药液(分别为 0g /L、
1． 0g /L、1． 2g /L、1． 4g /L、1． 5g /L、1． 6g /L、2． 0g /L，分为
7 个组，其中 0g /L为对照组，其余为不同浓度药液的实
验组，每组 12 个孔，每孔 150μl) ，待其分别作用 6h 后，
每孔加 MTT溶液 20μl继续孵育 4h，终止培养，小心吸
弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃
孔内上清液。每孔加 150μl 二甲基亚砜，震荡 10min，
使结晶物充分溶解。然后选择 490nm 波长，以酶标仪
测定各孔光吸收值(OD值)。
另外培养板板孔中分别置一盖玻片，其他操作同
前，待成骨细胞充分贴壁生长后，弃上清液，用免疫组
化法对玻片上的成骨细胞进行 I 型胶原蛋白进行细胞
免疫化学染色，图像分析仪进行分析检验及各组细胞
平均光密度值测定。
2． 4． 2 细胞功能的表达 将兔成骨细胞密度按 1 ×
105 个 /孔接种于 6 孔培养板中，3 天后换含 10%胎牛
血清、10mmol /L β-甘油磷酸和 50mg /L Vit C 的 DMEM
培养液，同时添加浓度为 0、1． 0、1． 2、1． 4、1． 5、1． 6、
2． 0g /L的鸟巢蕨提取液，所有浓度均平行做 12 份，每 4
天换 1 次培养液及干预药物，不传代，直至 20 天。于
不同时间进行下列各项指标的检测。
(1)碱性磷酸酶活性和骨钙素(Bone gla protein，
BGP)测定:分别取各组(药液浓度分别为 0g /L、
1． 0g /L、1． 2g /L、1． 4g /L、1． 5g /L、1． 6g /L、2． 0g /L，共 7
组)培养至第 5 天的成骨细胞，弃原培养液，用 0． 25%
胰蛋白酶消化，吸出消化液后加入 0． 9% NaCl 吹打使
其游离，放置低温冰箱中反复冻溶至破碎，离心，上清
液行酶免法测定碱性磷酸酶含量，放免法测定骨钙素
含量。
(2)钙含量:培养至第 5 天，将待测各孔培养液(药
液浓度分别为 0g /L、1． 0g /L、1． 2g /L、1． 4g /L、1． 5g /L、
1． 6g /L、2． 0g /L，共 7 组)吸出后，用 PBS 洗 2 遍，加入
1mol /L HCl 1ml 震荡过夜，次日以 10 000 × g 离心
10min，上清液中 Ca2 +浓度用 Sigma 公司生产的专用试
剂盒测定。
(3)矿化结节:培养至第 20 天时用 von Kossa 染色
法显示矿化结节。培养细胞先用 PBS 洗 2 遍，后用
3． 7%甲醛-90%乙醇固定 5 min。加入新鲜配制的 1%
硝酸银后置紫外灯下照射 30min。镜下观察并照相记
录矿化结节形成情况。
2． 5 统计学方法 采用 SPSS16． 0 软件处理，所有数
据用 x ± s表示，组间比较采用 t检验。
3 结果
3． 1 成骨细胞的鉴定 细胞形态观察:倒置相差显微
·07·
上海中医药杂志 2011年第 45卷第 8期 SH． J． TCM Aug．，2011;Vol． 45 No． 8
镜下，培养第 1、第 2 天，大部分细胞贴壁，形状主要为
梭形或长三角形。第 3 天、第 4 天长满瓶底时，细胞为
三角形或多角形(图 1-A) ，6 天时可见细胞呈鳞片状
(图 1-B)。采用 Gomori钙钴法行碱性磷酸酶染色结果
显示:大多数细胞的细胞质及细胞膜上形成灰黑、深黑
色的颗粒状或片状沉淀，证明该细胞有分泌碱性磷酸
酶的活性，是成骨细胞(图 1-C)。
A B C
图 1 原代培养的兔成骨细胞形态
3． 2 对兔成骨细胞增殖的影响 同一时间点与空白
组比较，除第 1 天的 1． 0g /L 组外，其余各组差异均具
有统计学意义(P ＜ 0． 01)。同一时间点 1． 6g /L 组与
2． 0g /L组比较，差异均无统计学意义(P ＞ 0． 05) ，说明
随着剂量加大，鸟巢蕨提取液的作用不再增加(表 1)。
表 1 各组兔成骨细胞增殖情况的比较(n = 12，x ± s)
组别
OD值
1d 3d 5d 7d
空白组 5． 14 ± 0． 19 11． 4 ± 0． 88 16． 1 ± 0． 70 18． 4 ± 0． 62
1． 0g /L组 5． 36 ± 0． 41 14． 5 ± 0． 43＊＊ 19． 2 ± 0． 52＊＊ 22． 2 ± 0． 39＊＊
1． 2g /L组 6． 17 ± 0． 22＊＊ 17． 3 ± 0． 26＊＊ 22． 4 ± 0． 32＊＊ 23． 2 ± 0． 32＊＊
1． 4g /L组 6． 11 ± 0． 13＊＊ 19． 4 ± 0． 30＊＊ 24． 4 ± 0． 27＊＊ 25． 3 ± 0． 24＊＊
1． 5g /L组 6． 08 ± 0． 16＊＊ 20． 3 ± 0． 29＊＊ 25． 3 ± 0． 30＊＊ 27． 0 ± 0． 21＊＊
1． 6g /L组 5． 74 ± 0． 21＊＊ 19． 9 ± 0． 16＊＊ 24． 6 ± 0． 41＊＊ 25． 6 ± 0． 17＊＊
2． 0g /L组 5． 68 ± 0． 18＊＊ 19． 8 ± 0． 17＊＊ 24． 6 ± 0． 19＊＊ 25． 5 ± 0． 19＊＊
注:与同一时间点的空白组比较，＊＊P ＜ 0． 01;与同一时间点的 1． 6g /L组比较，## P ＜ 0． 01。下同。
3． 3 I型胶原蛋白分析结果 与空白组比较，各用药
组细胞体积较大，I型胶原蛋白分泌明显增多。与空白
组比较，其余各组平均光密度值差异均具有统计学意义
(P ＜0． 01)。1． 6g /L组与2． 0g /L组之间平均光密度值差
异无统计学意义(P ＞ 0． 05) ，说明提取液浓度过高具有
一定的抑制作用(表 2)。
表 2 各组兔成骨细胞生长情况比较(n = 12，x ± s)
组别 平均光密度值
空白组 160． 3 ± 9． 327
1． 0g /L组 176． 9 ± 7． 377＊＊
1． 2g /L组 199． 1 ± 8． 926＊＊
1． 4g /L组 218． 0 ± 7． 781＊＊
1． 5g /L组 226． 3 ± 10． 397＊＊
1． 6g /L组 234． 5 ± 8． 274＊＊
2． 0g /L组 235． 1 ± 8． 933＊＊
3． 4 对碱性磷酸酶含量及骨钙素含量的影响 与空
白组比较，各用药组的碱性磷酸酶含量和骨钙素含量
差异均具有统计学意义(P ＜ 0． 01)。1． 6g /L 组与
2． 0g /L组之间比较，碱性磷酸酶含量和骨钙素含量差
异无统计学意义(P ＞ 0． 05) ，说明提取液浓度过高具有
一定的抑制作用(表 3)。
表 3 各组碱性磷酸酶、骨钙素含量比较(n = 12，x ± s)
组别 碱性磷酸酶含量(U /L) 骨钙素含量(ng /ml)
空白组 3． 213 ± 0． 0938 3． 333 ± 0． 0894
1． 0g /L组 4． 091 ± 0． 1034＊＊ 4． 618 ± 0． 0887＊＊
1． 2g /L组 5． 228 ± 0． 0925＊＊ 5． 176 ± 0． 0754＊＊
1． 4g /L组 6． 370 ± 0． 0725＊＊ 6． 287 ± 0． 0946＊＊
1． 5g /L组 7． 406 ± 0． 0713＊＊ 7． 325 ± 0． 0966＊＊
1． 6g /L组 7． 518 ± 0． 0873＊＊ 7． 443 ± 0． 0854＊＊
2． 0g /L组 7． 591 ± 0． 0890＊＊ 7． 506 ± 0． 0987＊＊
3． 5 对钙沉积量及矿化结节数的影响 与空白组比
较，各用药组的钙沉积量差异具有统计学意义(P ＜
0． 01) ;1． 6g /L组与 2． 0g /L组比较，钙沉积量差异具有
统计学意义(P ＜ 0． 01)。与空白组比较，除 1． 0g /L 组
外，其余各用药组矿化结节数差异均具有统计学意义
(P ＜ 0． 01) ，1． 6g /L 组与 2． 0g /L 组比较，矿化结节数
差异无统计学意义(P ＞ 0． 05) ，说明提取液浓度过高具
有一定的抑制作用(表 4)。
·17·
上海中医药杂志 2011 年第 45 卷第 8 期 SH． J． TCM Aug．，2011;Vol． 45 No． 8
表 4 各组成骨细胞钙含量以及矿化结节数比较(n =
12，x ± s)
组别 钙含量值(mmol /ml) 矿化结节数(个)
空白组 76． 31 ± 0． 177 70． 75 ± 6． 58
1． 0g /L组 91． 66 ± 0． 630＊＊ 75． 08 ± 5． 16
1． 2g /L组 102． 6 ± 1． 093＊＊ 78． 83 ± 4． 24＊＊
1． 4g /L组 123． 6 ± 1． 409＊＊ 84． 08 ± 4． 62＊＊
1． 5g /L组 141． 5 ± 0． 957＊＊ 90． 67 ± 5． 31＊＊
1． 6g /L组 147． 6 ± 0． 989＊＊ 91． 58 ± 5． 81＊＊
2． 0g /L组 151． 5 ± 1． 334＊＊## 93． 58 ± 5． 74＊＊
4 讨论
成骨细胞是骨形成过程中最重要的功能细胞，它
不仅分泌骨基质、生成类骨质参与成骨，促进类骨质矿
化，并通过骨保护素等生长因子对破骨细胞的生长发
育、分化及功能起重要作用［3］，因而对骨组织的生长发
育、损伤修复、骨代谢平衡与骨量维持起着关键作用。
成骨细胞数量减少或功能受损都会导致骨代谢异常，
从而引起机体多种疾病，如骨质疏松症等。
成骨细胞在分化过程中形态不一，不同分化阶段
中，碱性磷酸酶、骨钙素、I型胶原可作为成骨细胞的特
征性表型［4］。碱性磷酸酶由成骨细胞产生，是成骨细
胞分化的主要特征性酶之一，可水解有机磷酸酯，提高
局部无机磷离子浓度，促进钙化发生。既可作为成骨
细胞的功能标记物，又可反映其分化成熟程度，保持较
高的 ALP活性和矿化能力是体外成骨细胞分化成熟的
两大典型特征，对其活性检测是鉴定成骨细胞及评价
其功能活性的重要指标之一。骨钙素是成骨细胞合
成、分泌的主要非胶原蛋白，其生理功能是保持骨的正
常矿化，被认为是成骨细胞分化的主要指标之一［5］。
成骨细胞钙含量的测定是评价其对药物反应的有效指
标，可客观反映药物对成骨细胞成骨功能的影响。钙
化结节是成骨细胞经过一定时期增殖而形成，代表成
骨细胞增殖分化成熟并行使成骨的功能。故本研究选
择上述观察指标探讨鸟巢蕨提取液体外对成骨细胞的
影响。成骨细胞生长曲线示其潜伏期约为 1-2 天，2-8
天进入对数增殖期，增殖旺盛，8-10 天进入平台期［6］。
由于 ALP活性测试要求有足够细胞，同时成骨细胞行
使功能形成矿化结节也需要一定量细胞，所以测其矿
化功能时间常选在对数增殖期。
鸟巢蕨是铁角蕨科巢蕨属多年生阴生常绿大型附
生或地生草本观叶植物，其性味苦、温，归肝、肾两经，
有补肾阳、强筋骨、祛风湿的作用，为进一步证实鸟巢
蕨提取液对骨质疏松症的作用，我们采用了体外细胞
实验，这是一种高通量的筛选，实验周期短，在骨质疏
松症的药物筛选中应用较多［7］。近年来以防治骨质疏
松症为目的而探讨各种药物对成骨细胞作用的研究极
为活跃，成骨细胞在体外具有增殖能力已见报道［8］，只
有成骨细胞数量的不断增加才能产生丰富的胶原，从
而通过钙化基质的形成产生更多的骨组织。
本实验结果显示，体外培养的成骨细胞经浓度为
1． 0g /L、1． 2g /L、1． 4g /L、1． 5g /L、1． 6g /L、2． 0g /L 的鸟
巢蕨提取液作用后，其细胞的 OD 值均增加，尤其在
1． 5g /L和 1． 6g /L 剂量组，其吸光值明显增高，与空白
组比较，差异具有统计学意义(P ＜ 0． 01)。其值越高，
表明成骨细胞增殖旺盛，进而说明鸟巢蕨提取液有直
接促进成骨细胞增殖和成熟的作用。同样，在碱性磷
酸酶、骨钙素表达，成骨细胞钙含量及矿化结节数量
上，各用药组比空白组明显增多，差异有统计学意义
(P ＜ 0． 01)。提示鸟巢蕨提取液可促进成骨细胞增殖、
成熟及增强成骨细胞的功能表达。
另外，本实验研究结果还显示，鸟巢蕨提取液对成
骨细胞的增殖及成骨功能的影响与其浓度有密切关
系。在一定范围内(1． 0g /L-1． 6g /L) ，随浓度增加，对
碱性磷酸酶活力、骨钙素的表达，成骨细胞钙含量以及
钙化结节数量有明显促进作用，呈剂量依赖关系，较高
的浓度(2． 0g /L)虽然没有对成骨细胞的增殖和矿化作
用产生抑制作用，但是对其作用已不甚明显，其具体机
制有待于进一步研究。
参考文献:
［1］付书遐．中国主要植物图说蕨类植物门［M］．北京:科学出版社，1957．
［2］ 李建华，尹美珍，李世普，等．兔成骨细胞体外培养体系的研究［J］．
武汉理工大学学报，2007，4(4) :177-179．
［3］ Udagawa N，Takahashi N，Yasuda H，et al． Osteoprotegerin produced
by osteoblasts is an important regulator in osteoclast development and
function［J］． Endocrinology，2000，141(9) :3478-3484．
［4］ 韩立民，刘波，徐彭．淫羊藿总黄酮对成骨细胞增殖的影响［J］．上海
中医药杂志，2003，37(6) :55-57．
［5］ Lian JB，Gundberg CM． Osteocalcin biochemical consideration and clinial
applications［J］． Clin Orthop Rel Res，1987，226 (2) :267-270．
［6］ 杨晓喻，刘长虹，梁星，等．促矿化液对大鼠成骨细胞增殖分化的影
响［J］．华西口腔医学杂，2008，26(6) :656-659．
［7］杨荣平，寿清耀，涂永勤，等．补骨脂提取物对体外培养新生大鼠颅骨
成骨细胞的影响［J］．中药新药与临床药理，2007，18(1) :32-34．
［8］ 邢国胜，谈志龙，淑云，等．补肾健骨汤对成骨细胞增殖及碱性磷酸
酶、骨钙素合成的影响［J］．中草药，2001，32(11) :1020-1022．
编辑:季春来
收稿日期:2011-02-15
·27·