全 文 ：２０１６年７月 四川大学学报（自然科学版） Ｊｕｌ．２０１６
第５３卷　第４期 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏｌ．５３　Ｎｏ．４
ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０４９０－６７５６．２０１６．０７．０３２
拟南芥ＡｔＴＲ１在盐胁迫应答中的功能初探
刘巧红，杨　亮，刘志斌，李旭锋，杨　毅
（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都６１００６４）
摘　要：本研究主要探索油菜中 Ｅ３泛素连接酶 ＢｎＴＲ１在拟南芥中的同源基因 ＡｔＴＲ１
（Ａｔ３ｇ４７５５０）的功能．通过体外泛素化实验证明ＡｔＴＲ１具有Ｅ３连接酶活性．基因表达分析显
示该基因受２００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ显著诱导，说明该基因可能在响应盐胁迫中发挥一定的功能．
为了更深入的探究该基因在植物耐盐中的作用，构建了植物表达载体ｐＺＨ０１－ＡｔＴＲ１转化突
变体．在含有潮霉素的培养基上筛选阳性苗，并利用荧光定量ＰＣＲ检测表明ＡｔＴＲ１基因已经
成功转入突变体中．
关键词：Ｅ３连接酶；表达谱分析；回复突变ＡｔＴＲ１／ａｔｔｒ１
中图分类号：Ｑ９４５　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：０４９０－６７５６（２０１６）０４－０８９５－０５
收稿日期：２０１５－０３－０２
基金项目：国家自然科学基金（３１１７１５８６）；９７３计划（２０１５ＣＢ７５５７００）
作者简介：刘巧红（１９９０－），女，甘肃定西人，硕士研究生，研究方向为植物遗传与分子生物学．Ｅ－ｍａｉｌ：７２９３８０５５２＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者：杨毅．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｙｉ５２８＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ
Ｆｉｒｓｔ　ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＡｔＴＲ１ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ
ＬＩＵ　Ｑｉａｏ－Ｈｏｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｌｉａｎｇ，ＬＩＵ　Ｚｈｉ－Ｂｉｎｇ，ＬＩ　Ｘｕ－Ｆｅｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｙｉ
（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｃｏ－ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，
Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００６４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｗｏｒｋ，ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡｔＴＲ１（Ａｔ３ｇ４７５５０），ｔｈｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ　ｏｆ　Ｅ３ｌｉｇａｓｅ　ＢｎＴＲ１ｉｎ　Ａｒ－
ａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｗａｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｅｌｆ－ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｏｓｓｅｓｓ　ａｎ　Ｅ３ｌｉｇ－
ａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ＡｔＴＲ１ｗａｓ　ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｓａｌｔ
（２００ｍｍｏｌ　ＮａＣｌ）．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｍａｙ　ｐｌａｙ　ａ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｓａｌｔ
ｓｔｒｅｓｓ．Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｓａｌｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｖｅｃｔｏｒ　ｐＺＨ０１－ＡｔＴＲ１ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ　ｉｎｔｏ　ｍｕｔａｎｔｓ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｅｒｅ
ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅｉｒ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ｇｒｏｗ　ｏｎ　ａ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ．ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ
ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｐｌａｎｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＡｔＴＲ１ｇｅｎｅ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｏｆ　ａｔｔｒ１ｍｕｔａｎｔ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｅ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｌｉｇａｓｅｓ；ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅ；ＡｔＴＲ１／ａｔｔｒ１ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｌｉｎｅｓ．
１　引　言
植物在生长发育的过程中会受到各种各样的
逆境胁迫，包括生物胁迫和非生物胁迫．在胁迫的
条件下，植物的生长发育会受到严重的影响［１］．其
中，盐胁迫是目前影响植物生长和农作物产量的重
要非生物逆境因子之一，例如土壤盐渍化严重影响
植物的生长发育，造成可耕地面积的减少和农作物
的减产［２］．中国有约２．７×１０７　ｈｍ２的土地盐渍化，
其中７×１０６　ｈｍ２为农田［３］．盐渍化土地面积的不
断扩大及耕地面积的减少已经给农业生产造成了
重大的损失，因此，利用转基因手段获得抗盐的转基
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５３卷
因植物，提高农作物产量、培育耐盐作物新品种已经
成为当今植物生物技术领域研究的热点之一［４］．
植物通过对基因表达的不同水平进行调控从
而应对各种非生物胁迫，如转录调控、转录后调控、
翻译调控和翻译后修饰［５］．泛素化修饰作为重要的
蛋白质翻译后修饰，在植物响应非生物胁迫的过程
中起了重要的作用．对蛋白质进行多聚泛肽链修饰
介导底物通过泛素－２６Ｓ蛋白酶体途径（Ｕｂｉｑｕ－
ｉｔｉｏｎ－２６Ｓｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ　ｐａｔｈ　ｗａｙ），通过泛素结合酶
（Ｅ１）、泛素结合酶（Ｅ２）和泛素连接酶（Ｅ３）把小分
子泛素结合到底物蛋白质的赖氨酸（Ｌｙｓ）残基上，
底物蛋白可能被接上单个泛素或多聚泛肽链，是一
种调节真核细胞进程重要的必不可少的调节机
制［６］．例如，调节许多细胞周期、细胞信号转导、
ＤＮＡ修复、蛋白质运输以及生物和非生物胁迫应
答过程［７］．在整个泛素化途径中，泛素连接酶Ｅ３
起着决定底物的关键性作用［８］．根据结构的不同可
以分为两大类：单亚基Ｅ３和多亚基Ｅ３．单亚基
Ｅ３包括 ＨＥＣＴ、ＲＩＮＧ 和 Ｕ－ｂｏｘ三种结构域类
型［９］．
在众多类型的Ｅ３中，具有 ＲＩＮＧ结构的Ｅ３
在植物应答生物和非生物胁迫中起着重要作用．
ＡｔＡＩＲＰ１（Ａｒｏｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ＡＢＡ　ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
ＲＩＮＧ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１）正调控ＡＢＡ介导的干旱反应［１０］；
ＨＯＳ１ 降 解 ＩＣＥ１ 负 调 控 植 物 冷 胁 迫［１１］；
ＡＴＡＩＲＰ３（Ａｒｏｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ＡＢＡ　ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
ＲＩＮＧ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３）正调控盐和干旱胁迫［１２］．ＲＩＮＧ
结构域家族的特点是具有环指结构域（Ｒｉｎｇ　ｆｉｎｇｅｒ
ｄｏｍａｉｎ），每个环指结构域连有两个锌离子，并且
对Ｅ３连接酶的活性是必需的［１３］．根据ＲＩＮＧ结构
域的不同进一步划分为 ＲＩＮＧ－Ｈ２（Ｃ３Ｈ２Ｃ３）、
ＲＩＮＧ－ＨＣ （Ｃ３ＨＣ４）、ＲＩＮＧ－Ｖ、ＲＩＮＧ－Ｃ２ 和
ＲＩＮＧ－Ｄ等．Ｕ－ｂｏｘ　Ｅ３连接酶的结构和ＲＩＮＧ　Ｅ３
很相似，但是锌离子对于这种结构的稳定性不是必
需的．
本实验室在前期研究从油菜中克隆到新的Ｅ３
连接酶ＢｎＴＲ１发现其正调控热胁迫应答［１４］，本研
究中的Ａｔ３ｇ４７５５０与ＢｎＴＲ１的核苷酸序列相似
性高达８６％，且蛋白质的氨基酸序列中都含有一
个锌指拉链的结构功能域（ＲＩＮＧｖ），故本实验室
将该基因命名为ＡｔＴＲ１．为研究该基因与植物抗
逆性的关系，构建了原核表达载体ｐＧＥＸ６ｐ－１－Ａｔ－
ＴＲ１，热激转化至大肠杆菌ＢＬ２１，成功表达ＧＳＴ－
ＡｔＴＲ１融合蛋白，体外泛素化实验证明其具有Ｅ３
连接酶活性．进一步构建植物表达载体ｐＺＨ０１－
ＡｔＴＲ１，转化根癌农杆菌ＥＨＡ１０５菌株，通过花序
侵染的方法获得转基因植物，为今后深入探究此
Ｅ３连接酶的功能奠定了基础．
２　实验材料与方法
２．１　实验材料
野生型拟南芥Ｃｏｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ－０），拟南芥突变
体种子ａｔｔｒ１（ｓａｌｋ＿０９０８２３ｃ），原核表达载体
ｐＧＥＸ６ｐ－１、植物表达载体ｐＺＨ０１、ＪＭ１０９菌株、农
杆菌ＥＨＡ１０５均由本实验室保存．Ｅ１和Ｅ２购自
Ｂｏｓｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ公司，泛素 Ｕｂ购自Ｓｉｇｍａ公司．
限制性内切酶ＢａｍＨⅠ和ＥｃＩ１３６Ⅱ、ＳａｌⅠ、Ｔ４
ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ购自ＴａＫａＲａ公司，ＲＮＡ提取试剂盒
购自天根生化科技有限公司，反转录试剂盒购自
ＴａＫａＲａ公司，ＳＹＢＧｒｅｅｎ购自Ｂｉｏ－ｒａｄ公司，引物
合成与测序由华大生物技术有限公司合成．
２．２　实验方法
２．２．１　植物培养　种子先用２０％消毒水消毒灭
菌１５ｍｉｎ，之后用灭菌的ｄｄＨ２Ｏ清洗５次均匀散
布在１／２ＭＳ培养基（含０．８％琼脂），４℃春化２天
后转移到２２℃培养室培养５～７ｄ移栽到土里．培
养条件为 ２２～２４℃，１４ｈ 光照／１０ｈ黑暗，湿度
５０％．
２．２．２　引物设计　从 ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．
ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｃ／）查询获得ＡｔＴＲ１的序列，及根据突
变 体 号 从 ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｎａｌ．ｓａｌｋ．ｅｄｕ／ｔｄｎａｐｒｉｍ－
ｅｒｓ．２．ｈｔｍｌ查询相应的信息，用 Ｐｒｉｍｅｒ　ｐｒｅｍｉｅｒ
５．０设计引物．
２．２．３　非生物胁迫处理及荧光定量 ＰＣＲ　１／２
ＭＳ培养基上生长两周的幼苗分别３８℃热处理１
ｈ、３ｈ、５ｈ，２００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ的１／２ＭＳ中处理０
ｈ、６ｈ、１２ｈ、２４ｈ．液氮速冻提取总ＲＮＡ．
２．２．４　蛋白诱导表达及纯化　利用表１所示引物
进行扩增，将ＡｔＴＲ１通过ＢａｍＨⅠ和ＳａｌⅠ连接到原
核表 达 载 体 ｐＧＥＸ６ｐ－１．构 建 好 的 重 组 载 体
ｐＧＥＸ６ｐ－１－ＡｔＴＲ１热激转化到大肠杆菌ＢＬ２１，３７℃
摇菌ＯＤ６００值达０．４～０．６，加入ＩＰＴＧ至终浓度为
０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，１６℃摇菌诱导１６ｈ，超声波破碎细胞，
用亲和层析的方法纯化ＧＳＴ－ＡｔＴＲ１融合蛋白．
６９８
第４期 　　 刘巧红，等：拟南芥ＡｔＴＲ１在盐胁迫应答中的功能初探 　
表１　实验使用引物
Ｔａｂ．１　Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ａｓｓａｙ
用途 ＡｔＴＲ１（Ａｔ３ｇ４７５５０） Ｔｕｂｉｎ２／Ａｃｔｉｎ
突变体引物
ＬＰ：５′－ＧＴＣＴＧＣＴＴＣＣＡＡＧＡＡＡＴＧＡＣＧ－３′
ＲＰ：５′－ＧＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＴＣＧＡＡＡＡＡＧＣ－３′
ＬＢ１．３：５′－ＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＧＧＡＡＣ－３′
半定量ＰＣＲ引物
Ｆ：５′－ＡＴＧＧＣＴＧＡＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴＡＴＧＴＡ－３′
Ｒ：５′－ＴＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＡＴＴＡＣＡＣＣＡＡＣ－３′
Ｆ：５′－ＡＧＣＡＴＧＧＴＧＴＴＧＴＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＧ－３′
Ｒ：５′－ＣＣＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＴＴＧＴＧＧＴＧＡＡ－３′
定量ＰＣＲ引物
Ｆ：５′－ＴＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡ－３′
Ｒ：５′－ＧＧＡＴＧＡＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＣＡＡ－３′
Ｆ：５′－ＡＣＡＴＣＣＣＡＣＣＴＡＣＴＧＧＴＣＴＧＡＡＧ－３′
Ｒ：５′－ＧＣＡＴＣＴＴＧＧＴＡＴＴＧＣＴＧＧＴＡＣＴＣＴ－３′
ＰＣＲ扩增引物
Ｆ：５′－ＡＴＧＧＣＴＧＡＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴＡＴ－３′
Ｒ：５′－ＴＣＡＡＡＣＴＧＧＴＧＴＴＧＧＧＡＣ－３′
原核表达引物
Ｆ：５′－ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴＡＴ－３′
Ｒ：５′－ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＡＡＣＴＧＧＴＧＴＴＧＧＧＡＣ－３′
回复突变引物
Ｆ：５′－ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴ－３′
Ｒ：５′－ＧＡＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＴＧＧＧＡＣＡＴＴＧＧＡ－３′
注：Ｆ为正向引物；Ｒ为反向引物；下划线所示为酶切位点．
２．２．５　植物表达载体构建及农杆菌介导花序侵染
法转化拟南芥　以反转录产物ＣＤＮＡ为模板，以
特异性引物进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ产物经琼脂糖电
泳后用Ｂｉｏｍｅｄ公司的ＰＣＲ纯化试剂盒纯化回收
扩增片段．将回收片段和植物表达载体ｐＺＨ０１分
别经ＢａｍＨⅠ和ＥｃＩ１３６Ⅱ双酶切，回收目的片段
和ｐＺＨ０１，用Ｔ４ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ进行连接，将连接产
物转化到大肠杆菌感受态ＪＭ１０９中，从ＬＢ＋Ａｍｐ
的培养基上挑选单菌落接种到含Ａｍｐ的液体 ＬＢ
中摇菌培养，用菌落ＰＣＲ法检测转化子．挑选阳性
菌提取重组质粒，通过双酶切检测重组子是否连接
上．将通过菌落ＰＣＲ法和双酶切检测后确认含有
插入片段的质粒命名为ｐＺＨ０１－ＡｔＴＲ１，取阳性菌
菌液送上海华大基因有限公司测序．
提取ｐＺＨ０１－ＡｔＴＲ１质粒，用反复冻融法导入
农杆菌 ＥＨＡ１０５ 中，获得转化载体 ＥＨＡ１０５／
ｐＺＨ０１－ＡｔＴＲ１，并用菌落ＰＣＲ法鉴定出阳性转化
子．采用侵花序法通过农杆菌介导将ｐＺＨ０１－Ａｔ－
ＴＲ１整合到拟南芥基因中，被侵染花序的植物暗
箱中培养１６～２４ｈ后，使植物处于正常的生长条件
下生长，待成熟后收集种子烘干用于后续的筛选试
验．
２．２．６　转录水平鉴定突变体和回复突变纯合子　
Ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ：从生长两周的野生型、突
变体和回复突变幼苗提取总ＲＮＡ为模板进行转
录为ＣＤＮＡ，进行ＰＣＲ扩增，条件为：９５℃预变性
５ｍｉｎ；９５℃变性１０ｓ，６０℃退火１０ｓ，７２℃延伸２０
ｓ，４５个循环．半定量内参为Ａｃｔｉｎ．
Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ：植物总 ＲＮＡ 反转录为 ＣＤ－
ＮＡ，再使用ｑ－ＰＣＲｍｉｘ－ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ反应体系为：
１０μＬ　ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎⅠ，２．５μＬ＋２．５μＬ　Ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ＋
Ｒ）（２ｐｍＭ），４μＬ　ｃＤＮＡ模板，１μＬ　ｄｄＨ２Ｏ．加样后
通过Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ－ＰＣＲ检测基因的表达量，ｑ－ＰＣＲ实
验程序为：９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃ 变性１０ｓ，６０℃
退火１０ｓ，７２℃延伸２０ｓ，４５个循环．定量内参为
Ｔｕｂｌｉｎ２．
３　结果分析
３．１　ＡｔＴＲ１的生物信息学分析
ＡｔＴＲ１基因位于拟南芥第３号染色体上，全
长２０８３ｂｐ，包含７个外显子，开放阅读框长６９９
ｂｐ．编码２３２个氨基酸，蛋白大约２５ｋＤａ．在Ｓｍａｒｔ
Ｄｏｍａｉｎ上预测ＡｔＴＲ１含有一个ＲＩＮＧｖ结构域，
不含有其他结构域，ＲＩＮＧ结构域氨基酸序列分析
显示ＡｔＴＲ１属于Ｃ４ＨＣ３型（图１Ａ），对 ＡｔＴＲ１
进行同源比对，发现除拟南芥外，在油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ
ｎａｐｕｓ）、芜菁（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ）等其他物种能找到
氨基酸序列相似性较高的同源序列（图１Ｂ，Ｃ）．
３．２　非生物胁迫下的表达谱分析
为了分析ＡｔＴＲ１对植物非生物胁迫的响应，
本文对生长两周的野生型拟南芥幼苗分别用ＮａＣｌ
和热处理后检测其表达量变化．如图２所示，在
２００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理６ｈ时，与对照相比，Ａｔ－
ＴＲ１的表达量提高了２倍，随着处理时间的增加，
ＡｔＴＲ１表达量逐渐上升，在２４ｈ时达到４．５倍；高
温３８℃热处理１ｈ、３ｈ、５ｈ检测ＡｔＴＲ１的表达量与
对照相比无明显的变化．结果表明，ＡｔＴＲ１明显受
ＮａＣｌ的诱导，而不受热胁迫诱导．
７９８
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５３卷
图１　结构预测与同源性比对
Ａ．蛋白结构预测；Ｂ．同源性比对；Ｃ．同源基因进化树
Ｆｉｇ．１　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｂｌａｓｔ
Ａ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ；Ｂ．Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｂｌａｓｔ；Ｃ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｌｅｖｅｎ　ＡｔＴＲ１ｈｏｍｏｌｏｇｓ
３．３　ＡｔＴＲ１蛋白的Ｅ３连接酶活性检测
通过ＩＰＴＧ诱导，ＧＳＴ亲和纯化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
电泳检测在５０ＫＤ左右有单一的条带，没有其他
杂带（图Ａ），可以满足下游的实验要求．我们用纯
化 的 ＧＳＴ－ＡｔＴＲ１ 融 合 蛋 白，与 ｈｕｍａｎ　Ｅ１
（ＵＢＡ１），ｈｕｍａｎ　Ｅ２（ＵＢＣＨ５Ｂ）和 ｈｕｍａｎ　Ｈｉｓ－
ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ进行不同的组合配成泛素反应体系，进
行 Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ和泛素抗体检测，发现，只有融合
蛋白ＧＳＴ－ＡｔＴＲ１和Ｕｂ、Ｅ１、Ｅ２都存在的情况下
形成明显的拖尾现象，是泛素连接反应最直观的反
应，而分别缺少Ｕｂ、Ｅ１、Ｅ２和ＧＳＴ－ＡｔＴＲ１的条件
下，均无法形成泛素拖尾条带．这说明Ｅ１、Ｅ２和
ＧＳＴ－ＡｔＴＲ１是形成泛素条带的必要蛋白，同时也
证明ＧＳＴ－ＡｔＴＲ１具有Ｅ３连接酶活性．
３．４　Ｔ－ＤＮＡ插入突变体纯合株系鉴定
在植物的基因功能分析方面，特别是模式植物
拟南芥中，突变体可直观表现出该基因缺失后造成
的功能缺陷，为基因功能提供直接的证据．所以为
了分析ＡｔＴＲ１基因功能，我们从拟南芥突变体种
子库 ＡＢＲＣ购买了相关突变体（ＳＡＬＫ＿０９０８２３ｃ，
其插入位点见图４Ａ）．播种，生长四周后取叶片并
提取总 ＤＮＡ．在插入位置前后设计引物，ＬＰ和
ＲＰ，同时设计了 Ｔ－ＤＮＡ序列上的一条通用引物
ＬＢｂ１．３，并以基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，
图２　非生物胁迫下相对表达量
ＡｔＴＲ１分别受ＮａＣｌ和热胁迫的诱导表达分析．２周幼苗经２００
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理０、６ｈ、１２ｈ和２４ｈ，高温（３８℃）处理１ｈ、３ｈ、５ｈ．
柱形图上的星号表示差异显著（＊Ｐ＜０．０５ａｎｄ＊＊Ｐ＜０．０１）
Ｆｉｇ．２　Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｕｎｄｅｒ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ．
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＡｔＴＲ１ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｓａｌｔ　ａｎｄ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ．２－ｗｅｅｋ－
ｏｌｄ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　２００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ　ｆｏｒ　０，６ｈ，１２ｈ
，２４ｈａｎｄ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｆｏｒ　１ｈ、３ｈ、５ｈ．Ａｓｔｅｒｉｓｋｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｓｔａｔｉｓｔｉ－
ｃａｌｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　０ｈａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｔｉｍｅ，ｄｅｔｅｒ－
ｍｉｎｅｄ　ｂｙ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ　ｔｅｓｔｓ，＊Ｐ＜０．０５ａｎｄ＊＊Ｐ＜０．０１．
８９８
第４期 　　 刘巧红，等：拟南芥ＡｔＴＲ１在盐胁迫应答中的功能初探 　
图３　体外泛素化分析
Ａ．ＡｔＴＲ１蛋白的表达及纯化．Ｂ．ＧＳＴ－ＡｔＴＲ１融合蛋白在Ｅ１，
Ｅ２，以及带Ｈｉｓ标签的泛素分子存在的条件下进行体外Ｅ３连
接酶活性分析．样品经过１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后，进行 Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ，随后用泛素抗体进行孵育，分析目的条带．
Ｆｉｇ．３　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｅｌｆ－ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ
Ａ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＧＳＴ－ＡｔＴＲ１ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏ－
ｔｅｉｎ．Ｂ：ＧＳＴ－ＡｔＴＲ１ｗａｓ　ａｓｓａｙｅｄ　ｆｏｒ　Ｅ３ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓ－
ｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｅ１，Ｅ２ａｎｄ　Ｈｉｓ　ｔａｇ　ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ．Ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｒｅｓｏｌｖｅｄ
ｂｙ　１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ．Ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂａｎｄｓ　ｗｉｔｈ
ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ａｎｔｉ－Ｕｂ　ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ．
在ＤＮＡ水平上对突变体进行纯合鉴定．如图４所
示，当筛选为纯合突变株系时，使用引物ＬＰ和ＲＰ
进行ＰＣＲ时没有条带，而使用ＬＢｂ１．３和ＲＰ时有
条带，野生型作为对照．此外，为了进一步验证这个
Ｔ－ＤＮＡ插入纯合突变体，确实造成了基因表达受
阻．我们用半定量ＲＴ－ＰＣＲ对其ＲＮＡ表达水平进
行了检测．ＲＴ－ＰＣＲ的结果显示，突变体中ＡｔＴＲ１
基因的表达量显著降低，说明Ｔ－ＤＮＡ插入成功打
断了ＡｔＴＲ１的转录，突变体材料可用于后续分析．
３．５　转基因植物的Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ鉴定
为了分析ＡｔＴＲ１的基因功能，我们首先构建
了植物表达载体ｐＺＨ０１－ＡｔＴＲ１，经农杆菌转化，花
序浸染后得到Ｔ０代转基因种子，并经潮霉素板筛
选得到转基因苗（图５Ａ）．得到Ｔ１代的种子后，将
Ｔ２代播种在卡那板上，可以观测分离得到的纯合
株系，纯合株系幼苗移苗生长４周提取叶片ＲＮＡ
检测转基因株系中ＡｔＴＲ１的表达量并将其中表达
量最高和相对较高的株系用于后续的研究．如图
５Ｂ所示，ＡｔＴＲ１的表达量在转基因株系分别有不
同倍的提高，我们选择了表达量较高的株系
ＣＯＭ３－２、ＣＯＭ４－８和ＣＯＭ７－２，其中，株系ＣＯＭ４－
８和ＣＯＭ７－２的表达量较野生型提高了２倍左右，
株系ＣＯＭ３－２较野生型提高了１．７倍左右．此结
果说明突变体中含有ＡｔＴＲ１基因片段，我们获得
了回复突变纯合株系做进一步的表型分析．
图４　拟南芥ＡｔＴＲ１纯合突变体（ＳＡＬＫ＿０９０８２３ｃ）的
鉴定
Ａ．Ｔ－ＤＮＡ插入突变体ａｔｔｒ１（ｓａｌｋ＿０９０８２３ｃ）结构图．黑色矩
形代表编码区域，实线代表内含子，倒三角形表示Ｔ－ＤＮＡ插
入．Ｂ和Ｃ．利用基因组ＰＣＲ及反转录ＰＣＲ对野生型及突变
体分别进行ＤＮＡ水平及ＲＮＡ水平鉴定．Ｃｏｌ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ生
态型－０，Ａｃｔｉｎ为内参．
Ｆｉｇ．４　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｔｔｒ１Ｔ－ＤＮＡ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｍｕ－
ｔａｎｔ　ｐｌａｎｔｓ
Ａ：Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅａｔｔｒ１（ｓａｌｋ＿０９０８２３ｃ）ａｌｅｌｅ
ｗｉｔｈ　Ｔ－ＤＮＡ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ．Ｇｒａｙ　ｂａｒｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓ，ａｎｄ
ｓｏｌｉｄ　ｌｉｎｅｓ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ　ｉｎｔｒｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＡｔＴＲ１ｇｅｎｅ．Ｔ－ＤＮＡ　ｉｎｓｅｒ－
ｔｉｏｎｓ　ａｒｅ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｒｉａｎｇｌｅｓ．Ｂ　ａｎｄ　Ｃ：Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　ＰＣＲ　ａｎｄ
ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ａｔｔｒ１ｐｌａｎｔｓ　ａｔ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ
ｌｅｖｅｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｌ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ－０．Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
Ａｃｔｉｎ　ｍＲＮＡ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｃｏｎｔｒｏｌ．
图５　回复突变ＡｔＴＲ１／ａｔｔｒ１的纯合筛选
Ａ．阳性苗在筛选培养基中的生长状况；Ｂ．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检
测ＡｔＴＲ１在野生型、突变体及回复突变中的表达量．柱形图
上的星号表示差异显著（＊Ｐ＜０．０５ａｎｄ＊＊＊Ｐ＜０．００１）
Ｆｉｇ．５　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ　ＡｔＴＲ１／ａｔｔｒ１ｃｏｍ－
ｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｌｉｎｅｓ
Ａ：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｓｅｅｄｌｉｎｇ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｍｅｄｉｕｍ．
Ｂ：Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＡｔＴＲ１ｉｎ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ，ｍｕｔａｎｔ，ａｎｄ
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｐｌａｎｔｓ．Ａｓｔｅｒｉｓｋｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ，ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ
ｂｙ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ　ｔｅｓｔｓ，＊Ｐ＜０．０５ａｎｄ＊＊＊Ｐ＜０．００１．
９９８
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５３卷
４　讨　论
生物体内蛋白功能的实现，离不开各种形式的
蛋白翻译后的修饰过程．其中泛素化过程近年来引
起了越来越广泛的关注，与蛋白质磷酸化信号传导
作用相似，泛素化在细胞生命活动的许多进程中发
挥着至关重要的作用［１５］．可参与调控细胞生命活
动的各个生理代谢过程，不仅调节植物生长和发
育，同时对植物响应外界生物与非生物胁迫的过程
是不可或缺的［１６］．泛素Ｅ３连接酶在蛋白质的翻译
后修饰中起着决定底物特异性的关键作用，在植物
体内Ｅ３连接酶参与多种生物胁迫和非生物胁迫
应答反应［１７］．
本实验室在前期研究发现Ｅ３连接酶ＢｎＴＲ１
在热胁迫中起正调控作用，同源比对发现 ＢｎＴＲ
与拟南芥中的 Ａｔ３ｇ４７５５０（ＡｔＴＲ１）氨基酸序列相
似性高达８６％，生物信息学分析显示这两个蛋白
氨基酸序列中都含有一个 ＲＩＮＧ 结构域，属于
Ｃ４ＨＣ３型．在ＳＭＡＲＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｍａｒｔ．ｅｍ－
ｂｌ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／）预测出ＢｎＴＲ１的Ｃ端有跨膜
结构域（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｄｏｍａｉｎ，ＴＭＤ），而 Ａｔ－
ＴＲ１没有类似的结构域，推测Ｃ端结构域的不同
可能导致这两个蛋白的生物学功能不同．表达谱结
果显示ＡｔＴＲ１受 ＮａＣｌ诱导显著但不受热诱导，
而ＢｎＴＲ１受热胁迫诱导显著，ＡｔＴＲ１和ＢｎＴＲ１
对同一种逆境因子的响应表现出了一定的差异性，
暗示它们参与不同的胁迫应答．为了验证 ＡｔＴＲ１
是否具有Ｅ３活性，我们从大肠杆菌中诱导表达并
纯化了带ＧＳＴ标签的ＡｔＴＲ１蛋白，并进行了体外
泛素化实验．结果表明，当Ｅ１、Ｅ２及 ＧＳＴ－ＡｔＴＲ１
共同存在的情况下会形成多聚泛素化条带，证实
ＡｔＴＲ１具有Ｅ３连接酶活性．前人研究发现ＲＩＮＧ
结构与植物抗逆密切相关［１８］，在许多已知的Ｅ３连
接酶中，许多 ＲＩＮＧ结构的 Ｅ３连接酶参与调解
盐、干旱、热等非生物胁迫的细胞应答［１９－２１］，为研
究该基因与植物抗逆性的关系，构建了植物表达载
体ｐＺＨ０１－ＡｔＴＲ１，经农杆菌转化，花序侵染得到转
基因植物，通过Ｒｅａｌｔｉｍｅ－ＰＣＲ鉴定ＡｔＴＲ１的表达
量．结果显示ＣＯＭ４－８和ＣＯＭ７－２两个株系中Ａｔ－
ＴＲ１表达量较野生型提高２倍多，ＣＯＭ３－２较野生
型高达１．７倍．本研究成功获得了突变体及回复突
变纯合株系种子，为后续研究该基因的功能奠定了
基础．
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００９
第４期 　　 刘巧红，等：拟南芥ＡｔＴＲ１在盐胁迫应答中的功能初探 　
ｌａ－Ｚｏｓｔｅｒ　Ｖｉｒｕｓ　ＯＲＦ６１ｐ　Ｈａｓ　Ｅ３Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　Ｌｉｇａｓｅ
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ｓｉｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ａｎｄ　Ｃｅｌｓ，２０１１，３１（３）：２０１．
［１７］　Ｌｏｒｉｃｋ　Ｋ　Ｌ，Ｊｅｎｓｅｎ　Ｊ　Ｐ，Ｆａｎｇ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．ＲＩＮＧ　ｆｉｎ－
ｇｅｒｓ　ｍｅｄｉａｔｅ　ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ（Ｅ２）－ｄｅ－
ｐｅｎｄｅｎｔ　ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａ－
ｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．ＵＳＡ，１９９９，９６（２０）：
１１３６４．
［１８］　Ｋｉｍ　Ｓ　Ｊ，Ｋｉｍ　Ｗ　Ｔ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ＲＩＮＧ　Ｅ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｌｉｇａｓｅ　ＡｔＡＴＬ７８ｉｎｃｒｅａｓｅｓ　ｔｏｌｅｒ－
ａｎｃｅ　ｔｏ　ｃｏｌｄ　ｓｔｒｅｓｓ　ａｎｄ　ｄｅｃｒｅａｓｅｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ
ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｆｅｂｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１３，５８７（１６）：
２５８４．
［１９］　Ｃｏｓｃｏｙ　Ｌ，Ｓａｎｃｈｅｚ　Ｄ　Ｊ，Ｇａｎｅｍ　Ｄ．Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｃｌａｓｓ　ｏｆ
ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ　Ｅ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ
ｌｉｇａｓｅｓ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ
ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｅｌ，２００１，１５５（７）：
１２６５．
［２０］　Ｃｌｏｕｇｈ　Ｓ　Ｊ，Ｂｅｎｔ　ＡＦ．Ｆｌｏｒａｌ　ｄｉｐ：ａ　ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｍｅｔｈ－
ｏｄ　ｆｏｒ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９８，１６
（６）：７３５．
［２１］　Ｌｅｅ　Ｈ，Ｘｉｏｎｇ　Ｌ，Ｇｏｎｇ　Ｚ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ＨＯＳ１ｇｅｎｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｃｏｌｄ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓ－
ｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｎｃｏｄｅｓ　ａ　ＲＩＮＧ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｈａｔ　ｄｉｓ－
ｐｌａｙｓ　ｃｏｌｄ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｎｕｃｌｅｏ－－ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ
［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ，２００１，１５（７）：９１２．
１０９