全 文 ：２０１６年９月 四川大学学报（自然科学版） Ｓｅｐ．２０１６
第５３卷　第５期 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏｌ．５３　Ｎｏ．５
ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０４９０－６７５６．２０１６．０９．０３１
拟南芥ＡｔＨＨＲ３响应热胁迫应答的初步分析
齐辉辉，蔡潇潇，杨虹伟，王健美，刘志斌，杨　毅
（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都６１００６４）
摘　要：拟南芥基因ＡｔＨＨＲ３编码一个ＲＩＮＧ结构域的Ｅ３连接酶，通过生物信息学分析发
现其可能参与植物热胁迫相关的应答．为了探索其具体的功能，构建了ＡｔＨＨＲ３互补株系，并
在ＤＮＡ水平和转录水平分别鉴定了 ＡｔＨＨＲ３互补株系，用ＲＴ－ＰＣＲ技术分析了 ＡｔＨＨＲ３
在热处理条件下基因表达的变化情况．在热胁迫下分析了野生型、突变体ａｔｈｈｒ３、回复株系幼
苗存活以及种子萌发的表型变化情况，发现突变体ａｔｈｈｒ３表现出对热胁迫的耐受性，并检测
了热胁迫下不同株系的 ＨＳＦ、ＨＳＰ等热相关基因的转录水平的变化，初步的研究表明拟南芥
基因ＡｔＨＨＲ３负调控植物对热胁迫的耐受性．
关键词：ＡｔＨＨＲ３；Ｅ３连接酶；热胁迫；拟南芥；耐热性
中图分类号：Ｑ９４５　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：０４９０－６７５６（２０１６）０５－１１４１－０６
收稿日期：２０１５－１１－２０
基金项目：国家自然科学基金（３１１７１５８６）；９７３计划（２０１５ＣＢ７５５７０２）．
作者简介：齐辉辉（１９９２－），男，河南永城人，硕士研究生，研究方向为植物遗传与分子生物学．Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｈｈ８３５＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者：杨毅．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｙｉ５２８＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ
Ｐｒｉｍａｒｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
ＡｔＨＨＲ３　ｔｏ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ
ＱＩ　Ｈｕｉ－Ｈｕｉ，ＣＡＩ　Ｘｉａｏ－Ｘｉａｏ，ＹＡＮＧ　Ｈｏｎｇ－Ｗｅｉ，ＷＡＮＧ　Ｊｉａｎ－Ｍｅｉ，ＬＩＵ　Ｚｈｉ－Ｂｉｎ，ＹＡＮＧ　Ｙｉ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏ－Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｃｏ－Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ＭＯＥ，
Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００６４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ｇｅｎｅ　ＡｔＨＨＲ３ｅｎｃｏｄｅｓ　ａ　ＲＩＮＧ　ｄｏｍａｉｎ　Ｅ３ｌｉｇａｓｅ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｎａｌ－
ｙｓｉｓ　ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏ，ｉｔ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｍｉｇｈｔ　ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ．
Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｄｅｔａｉｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡｔＨＨＲ３，ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｅ　ｌｉｎｅｓ　ｏｆ　ＡｔＨＨＲ３ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ
ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ＤＮＡ　ｌｅｖｅｌ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ．Ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ＡｔＨＨＲ３ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｔｈｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ａｔｈｈｒ３ｍｕｔａｎｔ
ｐｌａｎｔｓ　ｈａｄ　ａ　ｈｉｇｈｅｒ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｔｈａｎ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ（ｃｏｌ）ａｎｄ　ＡｔＨＨＲ３ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅｓ
ｕｎｄｅｒ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　ａｔｈｈｒ３ｍｕｔａｎｔ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｍｏｒｅ　ｔｏｌｅｒａｎｔ　ｔｈａｎ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ＡｔＨＨＲ３
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅｓ　ｔｏ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ．Ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｍｅ　ＨＳＦｓ　ａｎｄ　ＨＳＰｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｕｎｄｅｒ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ．Ｈｅｎｃｅ，ｔｈｅ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｒｅｖｅａｌ　ｔｈａｔ　ＡｔＨＨＲ３ａｃｔｓ　ａｓ　ａ　ｎｅｇａ－
ｔｉｖｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＡｔＨＨＲ３；Ｅ３ｌｉｇａｓｅ；Ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ；Ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５３卷
１　引　言
随着全球ＣＯ２ 气体的排放量逐渐增加，全球
气候变暖逐渐加剧，研究表明如果农作物不能适应
逐渐升高的气候温度，将会影响光合作用和碳的固
定，从而严重影响农作物的生长和产量［１，２］．因此，
研究植物对于高温耐受性的分子机制，对于我们改
良农作物的品质，提高农作物产量具有重大意义．
泛素化降解途径通过泛素激活酶Ｅ１，泛素结
合酶Ｅ２以及泛素连接酶Ｅ３将泛素叠加到底物
上，然后通过２６Ｓ蛋白酶体降解．作为一种典型的
翻译后修饰调节，泛素化修饰被认为广泛参与植物
对逆境胁迫的响应［３］．拟南芥中大约有１４００多种
Ｅ３连接酶，Ｅ３连接酶在识别特异性底物方面起到
重要的作用［４］．过表达Ｕ－Ｂｏｘ结构域的Ｅ３连接酶
ＡｔＣＨＩＰ增强了拟南芥对冷胁迫的耐受性［５］；
ＣＲＬ４家族的多亚基Ｅ３连接酶 ＨＴＤ１被报道负
调控拟南芥对热胁迫的响应［６］；而油菜中的一个
ＲＩＮＧ结构域的Ｅ３连接酶ＢｎＴＲ１正调控油菜和
水稻的耐热性［７］；研究发现，异源表达水稻中的一
个ＲＩＮＧ结构域的Ｅ３连接酶ＯｓＨＣＬ增强了拟南
芥对获得性热胁迫的耐受性［８］．而拟南芥中ＲＩＮＧ
结构域的Ｅ３却很少有报道其在热胁迫中的作用．
本实验室在前期的研究中，发现了拟南芥中一
个 ＲＩＮＧ 结 构 域 的 Ｅ３ 连 接 酶 ＡｔＨＨＲ３
（Ａｔ３ｇ２８６２０），通过生物信息学预测其可能参与拟
南芥热信号转导．因此，本实验以拟南芥ＡｔＨＨＲ３
为研究对象，在ＤＮＡ水平和转录水平分别鉴定了
ＡｔＨＨＲ３的互补株系，并检测了ＡｔＨＨＲ３在热胁
迫的不同阶段基因表达变化，分析了ＡｔＨＨＲ３在
热胁迫下对种子萌发和幼苗存活率的影响，最后检
测了不同株系在热胁迫下 ＨＳＰ、ＨＳＦ等基因的变
化情况，初步揭示了其在拟南芥响应热胁迫方面的
相关功能．
２　材料与方法
２．１　实验材料
拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｏｌｕｍｂｉａ野生
型（Ｃｏｌ）种子为本实验室所保存，拟南芥突变体
ａｔｈｈｒ３种子购自于拟南芥生物资源中心（ＡＢＲＣ）．
Ｔａｑ　ＤＮＡ 聚合酶、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＳＹＢＧｒｅｅｎ、Ｔｒｉｚｏｌ、反转录试剂盒均购
自于Ｔａｋａｒａ公司，限制性内切酶、Ｔ４Ｌｉｇａｓｅ等均
购自于Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，实验中所用引物由华大基
因合成，其他试剂为进口或国产分析纯．
２．２　实验方法
２．２．１　 引物设计　在拟南芥基因数据库Ｔａｉｒ上
查询并获得拟南芥基因ＡｔＨＨＲ３的序列信息，并
用ｐｒｉｍｅｒ　ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０结合在线引物设计工具Ｏｌ－
ｉｇｏＡｒｃｈｉｔｅｃｔ　ＴＭ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｌｉｇｏａｒｃｈｉｔｅｃｔ．ｃｏｍ）
设计引物如表１．
２．２．２　植物培养　将拟南芥种子加水放在４℃避
光春化２天，在超净台中用７０％的乙醇消毒３ｍｉｎ，
然后用无菌水清洗３次，再用１％的氯化汞消毒
８ｍｉｎ，用无菌水清洗５次，均匀播种在 ＭＳ固体培
养基上，２２℃１６ｈ光照／８ｈ黑暗培养．
２．２．３　ＤＮＡ水平和转录水平的鉴定互补株系　
将Ｔ０ 代转基因株系播种在含有潮霉素抗性的 ＭＳ
固体培养基中，生长一段时间后将根长比较长的株
系移栽到营养土中培养收获Ｔ１ 代种子．按照此方
法筛选到Ｔ３，将Ｔ３ 代得到的种子播种于 ＭＳ固体
培养基中生长７ｄ提取拟南芥总ＲＮＡ并反转录，
进行ＲＴ－ＰＣＲ检测基因表达；取 ＭＳ培养基中的
阳性苗移栽到土壤中生长一个月，用ＣＴＡＢ法提
取拟南芥叶片ＤＮＡ用３５Ｓ引物和基因下游特异
性引物进行ＰＣＲ扩增检测互补株系．
２．２．４　热胁迫下不同时间段ＡｔＨＨＲ３的转录水
平变化　分别在正常条件下、直接４５℃２ｈ、３８℃
２ｈ、２２℃２ｈ以及再继续４５℃２ｈ处理这几个时间
点取样，提取幼苗的总ＲＮＡ并反转录成ｃＤＮＡ用
ＲＴ－ＰＣＲ分析不同时间段ＡｔＨＨＲ３基因的表达
变化情况．
２．２．５　 热胁迫下野生型、突变体、回复株系萌发
率分析　播种前将种子在３８℃处理２ｈ，然后放在
２２℃２ｈ，随后放在５０℃处理３ｈ１５ｍｉｎ将种子消毒
均匀播种于 ＭＳ固体培养基中放在２２℃培养，统
计种子萌发率．
２．２．６　热胁迫下野生型、突变体、回复株系存活率
分析　分别将野生型、突变体、回复株系播种于
ＭＳ固体培养基 ２２℃ 生长 ６ｄ，然后 ４５℃ 加热
１３５ｍｉｎ，然后放在２２℃组培室培养５ｄ统计存活
率．
２．２．７　热胁迫相关基因转录水平的变化　将生长
７ｄ的野生型、突变体、回复株系幼苗３８℃处理２ｈ
分别提取总 ＲＮＡ，反转录，并用 ＲＴ－ＰＣＲ检测热
相关基因的变化情况．
２４１１
第５期 　　 齐辉辉，等：拟南芥ＡｔＨＨＲ３响应热胁迫应答的初步分析 　
表１　引物列表
Ｔａｂ．１　Ｐｒｉｍｅｒｓ　Ｌｉｓｔ
基因（Ｇｅｎｅ） 引物序列（Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）５′→３′
Ｑ－ＰＣＲ　ＨＨＲ３Ｆ ＣＧＴＴＧＴＧＴＣＴＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＣＴＣ
Ｑ－ＰＣＲ　ＨＨＲ３Ｒ ＣＴＣＣＧＡＴＣＴＣＡＡＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣ
Ｑ－ＰＣＲ　ＨＳＦＡ３Ｆ ＣＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＡＣＣＧＧＡＧＣＴＡＧＣＴＴＣＧＴＡＧ
Ｑ－ＰＣＲ　ＨＳＦＡ３Ｒ ＧＣＴＡＧＴＧＣＴＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＴＴＴＧＧＴＴＧ
Ｑ－ＰＣＲ　ＨＳＰ１８．２Ｆ ＣＣＧＴＴＣＴＣＧＣＡＡＧＡＣＴＴＡＴＧＧ
Ｑ－ＰＣＲ　ＨＳＰ１８．２Ｒ ＧＡＡＧＣＧＴＴＴＧＣＣＡＡＣＧＣＡＧＡＡ
Ｑ－ＰＣＲ　Ａｃｔｉｎ　Ｆ　 ＴＴＧＡＣＴＡＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＧＧ
Ｑ－ＰＣＲ　Ａｃｔｉｎ　Ｒ　 ＡＣＡＡＡＣＧＡＧＧＧＣＴＧＧＡＡＣＡＡＧ
３５Ｓ ＧＡＣＧＣＡＣＡＡＴＣＣＣＡＣＴＡＴＣＣ
ＨＨＲ３Ｒ ＴＣＡＡＣＴＧＴＧＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＡＣＡＧＣ
３　结果与分析
３．１　互补株系的鉴定
３．１．１　ＤＮＡ水平鉴定互补株系　分别提取Ｃｏｌ、互
补株系Ｃ－６、Ｃ－７、Ｃ－８、Ｃ－９植株的叶片ＤＮＡ，然后用
烟草花叶病毒３５Ｓ引物和ＡｔＨＨＲ３基因特异性下游
引物进行ＰＣＲ扩增，结果显示在互补株系中能够扩
增出ＡｔＨＨＲ３片段，而在Ｃｏｌ植株中没有ＤＮＡ条带
（如图１），说明ＡｔＨＨＲ３基因成功转入互补株系中．
３．１．２　ｍＲＮＡ水平鉴定互补株系　分别提取上
述Ｃｏｌ、互补株系植株的总ＲＮＡ，然后进行反转录，
用Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＲＣＲ 实验分别检测不同植株中
ＡｔＨＨＲ３基因的表达量，实验结果显示互补株系
植株中的ＡｔＨＨＲ３基因的表达量分别比Ｃｏｌ植株
中分别高２１．２倍、１３６．７倍、１８．６倍、３７．５倍（图
１）．结果表明 ＡｔＨＨＲ３基因成功转入互补株系而
且表达量符合预期可以进行后续的实验．
图１　ＤＮＡ水平和转录水平检测拟南芥ＡｔＨＨＲ３转基因植株
Ｆｉｇ．１　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡｔＨＨＲ３ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｂｙ　ＤＮＡ　ｌｅｖｅｌ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ
３．２　热胁迫下ＡｔＨＨＲ３基因表达分析
基因芯片 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｅＦＰ　Ｂｒｏｗｓｅｒ分析发
现，ＡｔＨＨＲ３与热胁迫相关，因此分别检测了在正
常生长条件下（２２℃）与获得性耐热条件下下不同
时间段（３８℃２ｈ、２２℃２ｈ、４５℃２ｈ）以及基础性耐
热条件（４５℃／Ｂ　２ｈ）ＡｔＨＨＲ３基因的变化情况，结
果显示无论是获得性耐热还是基础性耐热条件下
ＡｔＨＨＲ３相对于正常条件下的表达量明显降低
（图２）．由此猜测 ＡｔＨＨＲ３有可能在拟南芥响应
热胁迫过程中起负调控作用．
３．３　ＡｔＨＨＲ３影响热胁迫下种子的萌发
将春化２ｄ的种子按照下面的条件（图３Ｃ）进
行热胁迫处理，然后消毒灭菌，播种在 ＭＳ固体培
养基上，分别统计野生型、ａｔｈｈｒ３突变体、以及互
补株系的萌发率．可以观察到在没有热胁迫处理条
件下各株系间的萌发率几乎没有差异，而在热胁迫
处理条件下ａｔｈｈｒ３突变体种子的萌发率显著高于
野生型和互补株系种子的萌发率（如图３）．各株系
萌发率统计图显示，各株系随着时间的增加其萌发
率逐渐增高，但是即使到第六天野生型和互补株系
种子萌发率依然没有超过５０％表现出对热胁迫的
敏感性，而ａｔｈｈｒ３突变体种子萌发率则达到了
８０％以上，在一定程度上表现了对热胁迫的耐受
性．
３４１１
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５３卷
图２　热胁迫下ＡｔＨＨＲ３基因的相对表达量
Ｆｉｇ．２　Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｏｆ　ＡｔＨＨＲ３ｕｎｄｅｒ
ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ
３．４　ＡｔＨＨＲ３影响热胁迫下幼苗的存活
将在 ＭＳ固体培养基上生长６天的拟南芥幼
苗按照如下条件（图４Ｂ）处理，然后统计各种株系
的热胁迫下的存活率（图４Ｃ）．从图４中可以明显
看出ａｔｈｈｒ３突变体株系相对于Ｃｏｌ和互补株系表
现出较强的耐热性，从统计图中可以看出热胁迫处
理后ａｔｈｈｒ３突变体幼苗存活率达到４７．３％左右，
而野生型和互补株系存活率不到１０％，由此可以
看出ＡｔＨＨＲ３基因负调控拟南芥对于热胁迫的耐
受性．
图３　热胁迫下拟南芥种子的萌发率
Ａ．正常条件下种子萌发情况Ｂ．热胁迫后种子萌发情况Ｃ．热处理条件草图 Ｄ．各株系种子萌发率
Ｆｉｇ．３　Ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｕｎｄｅｒ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ
Ａ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｕｎｄｅｒ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　Ｂ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｕｎｄｅｒ　ｈｅａｔ
ｓｔｒｅｓｓ　Ｃ．Ｓｃｈｅｍａｔｉｃａｌｙ，ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｓｅｅｄ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｔｏ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　Ｄ．Ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｕｎｄｅｒ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ
３．５　ＡｔＨＨＲ３影响拟南芥中热胁迫相关基因的表
达
遗传和生理上的分析已经证明，ＨＳＦｓ和
ＨＳＰｓ直接调控植物的耐热，当植物植物处于一个
缓和的热胁迫条件下（３８℃），可以非常有效的激活
ＨＳＦ－ＨＳＰ 信号网络，而一些 ＨＳＰ又能通过反馈
调节 ＨＳＦｓ的活性，从而显著提高植物的耐热
性［９－１２］．因此，我们在３８℃２ｈ条件下分别处理了野
生型（Ｃｏｌ）、ａｔｈｈｒ３突变体、互补株系Ｃ－７以及Ｃ－
８，从而检测不同株系中相关 ＨＳＰ和 ＨＳＦ基因表
达的变化情况．
如图５所示，在正常条件下Ｃｏｌ、ａｔｈｈｒ３突变体、
互补株系Ｃ－７、Ｃ－８植株中ＨＳＦＡ３和ＨＳＰ１８．２基因
表达量均比较低，而且没有明显的差异，在３８℃２ｈ
处理过后Ｃｏｌ、ａｔｈｈｒ３突变体、互补株系Ｃ－７、Ｃ－８植
株中ＨＳＦＡ３和ＨＳＰ１８．２基因表达量均明显升高，
但是，相对于Ｃｏｌ和互补株系Ｃ－７、Ｃ－８，ａｔｈｈｒ３突变
体中的 ＨＳＦＡ３和 ＨＳＰ１８．２基因表达上升更为明
显，通过结果可以推测 ＡｔＨＨＲ３通过调节相关的
ＨＳＦ和ＨＳＰ基因的表达量从而参与拟南芥热胁迫
应答，ａｔｈｈｒ３突变体中相关 ＨＳＦ和 ＨＳＰ基因表达
比较高，从而表现出对热胁迫的耐受性．
４４１１
第５期 　　 齐辉辉，等：拟南芥ＡｔＨＨＲ３响应热胁迫应答的初步分析 　
图４　ａｔｈｈｒ３突变体表现出对热胁迫的不敏感性
Ａ．热胁迫后幼苗存活情况Ｂ．热处理草图Ｃ．幼苗存活率
Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ａｔｈｈｒ３ｍｕｔａｎｔ　ｉｓ　ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ
Ａ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｓｅｅｄｉｎｇｓ　ａｆｔｅｒ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｔｏ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　Ｂ．Ｓｃｈｅｍａｔｉｃａｌｙ，ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｓｅｅｄｉｎｇｓ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｔｏ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　Ｃ．Ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｓｅｅｄｉｎｇｓ
图５　热胁迫下野生型、突变体、互补株系中 ＨＳＦＡ３和 ＨＳＰ１８．２的相对表达量
Ｆｉｇ．５　Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｏｆ　ＨＳＦＡ３ａｎｄ　ＨＳＰ１８．２ｉｎ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ、ｍｕｔａｎｔ、ｔｒａｎｓ－
ｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅｓ　ｕｎｄｅｒ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ
４　讨　论
本研究为探索ＡｔＨＨＲ３在拟南芥热胁迫应
答中的功能，分别在ＤＮＡ水平上和转录水平上鉴
定了ＡｔＨＨＲ３互补株系，用３５Ｓ引物和ＡｔＨＨＲ３
下游特异性引物进行ＰＣＲ，结果显示在互补株系
中能扩增出ＡｔＨＨＲ３而在Ｃｏｌ却不能，ＲＴ－ＰＣＲ
显示互补株系中 ＡｔＨＨＲ３的表达量明显高于
Ｃｏｌ，表明ＡｔＨＨＲ３基因成功转入互补株系（图
１）．体内ＡｔＨＨＲ３在热胁迫下基因表达量呈下降
趋势，表明 ＨＨＲ３可能负调控拟南芥耐热（图２）．
于是我们分析了热胁迫下拟南芥种子萌发率和幼
苗存活率，发现ａｔｈｈｒ３突变体无论在种子萌发还
是在幼苗存活率上均高于Ｃｏｌ和互补株系（图４，
图５）．以上结果说明ＡｔＨＨＲ３在拟南芥响应热胁
迫中起负调控作用．
泛素－２６Ｓ蛋白酶体介导的蛋白降解系统在植
物抗逆方面起到了重要的作用，而Ｅ３连接酶能够识
别特结合异性的底物，从而降解特异性的蛋白［４］．目
前，关于Ｅ３连接酶在拟南芥抗逆方面的研究主要集
中在盐胁迫、渗透胁迫等方面．ＡｔＤＲＩＰ１和ＡｔＤＲＩＰ２
负调控拟南芥对盐和干旱的响应［１３］；ＡｔＲＧＬＧ１和
ＡｔＲＧＬＧ２与ＡｔＥＲＦ５３相互作用负调控拟南芥对干
旱的响应［１４］．而Ｅ３连接酶在拟南芥耐热方面的研
究所知甚少，我们在研究中发现了一个参与拟南芥
热胁迫信号转的ＲＩＮＧ结构域的Ｅ３连接酶ＡｔＨ－
ＨＲ３，并做了相关的研究．
早期的研究主要集中在对 ＨＳＰｓ和 ＨＳＦｓ等
方面的研究，研究表明 ＨＳＰ１０１直接参与拟南芥基
础耐热和获得性耐热［１５，１６］；ＨＳＰ７０可以调控结合
５４１１
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５３卷
变性的蛋白促进它们重新折叠［１７］；一些小分子
ＨＳＰ蛋白同样能够起到分子伴侣的作用．研究发
现，ＨＳＦＡ１在热胁迫中起到主要的调控作用，ＨＳ－
ＦＡ２主要受光和渗透诱导，ＨＳＦＡ３同样在热信号
传导通路中起到正调控作用［１８，１９］；鉴于，ＨＳＦｓ和
ＨＳＰｓ在植物耐热方面起到重要的作用因此我们
检测了一些ＨＳＦ和ＨＳＰ基因的变化情况，结果表
明 ＨＳＦＡ３和 ＨＳＰ１８．２基因在ａｔｈｈｒ３突变体表
达量明显高于Ｃｏｌ和互补株系（图５），从而使得
ａｔｈｈｒ３突变体表现的更为耐热．
本研究只是初步揭示了ＡｔＨＨＲ３在拟南芥中的
功能，而对于其具体的信号传导和耐热机制还需要进
一步的研究．随着全球气温的逐渐升高，其所带来的
危害也越来越显著，热胁迫通过破坏植物细胞里面的
稳态平衡等，从而导致农作物减产，更有甚者，一些植
物由于不能适应逐渐升高的温度而濒临灭绝，因此，
研究植物耐热的分子机制，用基因工程的方法提高植
物耐热性也会更加引起科学家的重视．
参考文献：
［１］　 Ｇｉｌｅｓ　Ｊ．Ｈｉｋｅｓ　ｉｎ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｏｚｏｎｅ　ｃｏｕｌｄ　ｓｕｆｆｏｃａｔｅ　ｃｒｏｐｓ
［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３５（７０４８）：１７４．
［２］　 Ｐｅｎｇ　Ｓ，Ｈｕａｎｇ　Ｊ，Ｓｈｅｅｈｙ　Ｊ　Ｅ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｉｃｅ　ｙｉｅｌｄｓ　ｄｅｃｌｉｎｅ
ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈｅｒ　ｎｉｇｈｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｆｒｏｍ　ｇｌｏｂａｌ　ｗａｒｍｉｎｇ［Ｊ］．
Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ，２００４，１０１（２７）：９９７１．
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ＲＩＮＧ　ｆｉｎｇｅｒ　Ｅ３ｌｉｇａｓｅ，ＯｓＨＣＩ１，ｄｒｉｖｅｓ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｅｘ－
ｐｏｒｔ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｈｅｔｅｒｏｇｅ－
ｎｅｏｕｓ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｔｈｅｒｍｏｔｏｌ－
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ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ，２０１４，３７（９）：２１２８．
［１２］　Ｓｃｈａｒｆ　Ｋ－Ｄ，Ｂｅｒｂｅｒｉｃｈ　Ｔ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇｅｒ　Ｉ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ
ｐｌａｎｔ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ（Ｈｓｆ）ｆａｍｉｌｙ：
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ
Ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ－Ｇｅｎｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，
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［１３］　Ｑｉｎ　Ｆ，Ｓａｋｕｍａ　Ｙ，Ｔｒａｎ　Ｌ－Ｓ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ＤＲＥＢ２Ａ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｓ　ＲＩＮＧ　Ｅ３
ｌｉｇａｓｅｓ　ａｎｄ　ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｐｌａｎｔ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ－
ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，２００８，
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［１４］　Ｃｈｅｎｇ　Ｍ　Ｃ，Ｈｓｉｅｈ　Ｅ　Ｊ，Ｃｈｅｎ　Ｊ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ａｒａｂｉ－
ｄｏｐｓｉｓ　ＲＧＬＧ２，ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ　ａｓ　ａ　ＲＩＮＧ　Ｅ３ｌｉｇａｓｅ，
ｉｎｔｅｒａｃｔｓ　ｗｉｔｈ　ＡｔＥＲＦ５３ａｎｄ　ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ
ｐｌａｎｔ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，
２０１２，１５８（１）：３６３．
［１５］　Ｈｏｎｇ　Ｓ　Ｗ，Ｖｉｅｒｌｉｎｇ　Ｅ．Ｍｕｔａｎｔｓ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ　ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ
ｈｉｇｈ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ
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［１６］　Ｈｏｎｇ　ＳＷ，Ｖｉｅｒｌｉｎｇ　Ｅ．Ｈｓｐ１０１ｉｓ　ｎｅｃｅｓｓａｒｙ　ｆｏｒ　ｈｅａｔ
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｂｕｔ　ｉｎｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｇｅｒ－
ｍｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｂｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ｓｔｒｅｓｓ ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，
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［１７］　Ｓｕｎｇ　Ｄ　Ｙ，Ｖｉｅｒｌｉｎｇ　Ｅ，Ｇｕｙ　Ｃ　Ｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｅｘ－
ｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｆｉｌｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｈｓｐ７０
Ｇｅｎｅ　Ｆａｍｉｌｙ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００１，１２６（２）：７８９．
［１８］　Ｃｈａｎ－Ｓｃｈａｍｉｎｅｔ　Ｋ　Ｙ，Ｂａｎｉｗａｌ　Ｓ　Ｋ，Ｂｕｂｌａｋ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．
Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｏｍａｔｏ　ＨｓｆＡ１ａｎｄ　ＨｓｆＡ２
ｃｒｅａｔｅｓ　ｈｅｔｅｒｏ－ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ　ｓｕｐｅｒａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｆｏｒ
ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００９．２８４（３１）：２０８４８．
［１９］　Ｓａｋｕｍａ　Ｙ，Ｍａｒｕｙａｍａ　Ｋ，Ｑｉｎ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｕａｌ　ｆｕｎｃ－
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ＤＲＥＢ２Ａ
ｉｎ　ｗａｔｅｒ－ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ａｎｄ　ｈｅａｔ－ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｓｐｏｎ－
ｓｉｖｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎ－
ａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａ－
ｍｅｒｉｃａ，２００６．１０３（４９）：１８８２２．
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