全 文 ：西北农业学报　2008 , 17(5):306-309 , 329
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
F3′5′H基因的克隆 、表达载体构建与矮牵牛遗传转化＊
司爱君1 ,祝建波1＊ ,李吉莲1 , 2 ,邓福军2＊
(1.石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室 ,新疆石河子　832003;2.新疆农垦科学院 ,新疆石河子　832000)
摘　要:类黄酮 3′5′羟基化酶(Flavonoid-3 , 5- hydro xy lase;F3′5′H)是花色素苷代谢途径中的一个关键性
酶 ,能使花色素的合成趋向于形成蓝色的飞燕草色素。从蓝紫色矮牵牛的花瓣中提取总 RNA , 利用 RT-
PCR技术克隆得到了约 1.7kb 的 F3′5′H 片段。 F3′5′H 的 cDNA 序列分析结果表明 , 克隆得到的序列与原
序列同源性达到 99.34 %,开放读码框为1 521 bp , 编码 507个氨基酸。将推算的氨基酸序列与NCBI 登录的
氨基酸序列进行分析比较 ,发现与文献报道的存在 2个氨基酸差异 ,氨基酸同源率为 99.6 %。将此基因构建
到含有 35S 启动子的植物表达载体 PBI-F3′5′H 上 , 并通过农杆菌介导法对粉红色矮牵牛进行了遗传转化 ,
初步鉴定获得了转基因植株。
关键词:矮牵牛;类黄酮 3′5′羟基化酶基因;转化
中图分类号:Q943.2　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2008)05-0306-04
Cloning and Construction of Plant Expression Vector and Transformation of
Flavonoid-3 ,5- hydroxylase Gene in Petunia hybrida
SI Ai-jun1 , ZH U Jian-bo1＊ , LI Ji-lian1 , 2 and DENG Fu-jun2＊
(1.Key Laboratory of Agricu ltural Biotechnology , College of Life Sciences , Shih ezi University , Shihezi Xin jian g　832003 , China;
2.Xinjiang Academy of Agricu lture and Reclam at ion Science , Shihezi Xinjiang　832000 , China)
Abstract:Flavonoid-3 ,5- hydroxylase(F3′5′H)is the key enzyme in the biosynthesis of anthocya-
nins , which can dive rt the production of delphinidin pigments.The to tal RNA was isolated f rom he
purple flowe r of Petunia hybrida .A specific F3′5′H fragment of the expected size w as amplified by
reverse t ranscription po lymerase chain reaction and sequenced .The DNA sequence analy sis indicated
that the cloned 1.7kb cDNA of F3′5′H fragment including an open reading frame o f 1521bp by which
encodes a predicted poly peptide of 507 amino acids.Compared w ith the F3′5′H gene in Gegebank ,
the homology of nucleot ide sequence could reach 99.34%, and 99.6%at the amino acid sequence , on-
ly tw o amino acid differences .A const ruct of F3′5′H in a sense-orientation driven by CaMV 35S pro-
moter w as const ructed and transformed into pink f lowe r of Petunia hybrida by using Agrobacterium
tume f acien mediated method.The transgenic plants w ere confimed that F3′5′H gene w as interated in-
to genome o f pink Petunia hybrida by preliminary ident ification.
Key words:Petunia hybrida;Flavonoid-3 , 5- hydro xylase;T ransfo rmation
　　植物花色形成是由于花瓣细胞存在决定花瓣
颜色的 3类主要色素 , 即类黄酮(Flavoniods)、类
胡萝卜素(Caro tenoids)和甜菜色素(Betalains)
[ 1-2] ,类黄酮是植物 3大色素中最常见的调控花色
的色素。参与花色形成的类黄酮主要有两大类:
花色素苷(A nthocyanin)和花黄色素(Anthoxan-
thin),而花瓣片中花色素苷所占比例能决定花瓣
的最终颜色 ,形成粉红色 、红色 、紫罗兰色及蓝
＊　收稿日期:2008-03-11　　修回日期:2008-03-28
作者简介:司爱君(1981-),女 ,硕士生 ,研究方向为植物基因工程。 E-mai l:siaijun1002@163.com
＊通讯作者。 E-mai l:zjbshz@126.com
色[ 3] 。当前 ,对控制蓝色花形成的代谢途径的解
析是分子生物学研究的热点 。安田齐(1989)、
Holton and Co rnish(1995)和 Tanaka(1998)等认
为 ,植物生成蓝色花必需同时具备以下条件:蓝色
花色素苷 、辅助色素(Copigment)的存在和液泡
中较高的 pH 值。根据羟基的位置和数目 ,花色
素苷主要分为 3 种类型:天竺葵色素苷(Pelar-
gonidin)、花青素色素苷(Eyanidin)和飞燕草色素
苷(Delphinidin),并且随着羟基数目的增加 ,色素
苷的蓝色也逐渐加深 。其中飞燕草色素苷羟基数
目最多 ,是控制形成蓝色的主要色素苷类型[ 4-5] 。
类黄酮 3′5′羟基化酶(Flavonoid-3 , 5-
hydro xy lase;F3′5′H)是飞燕草色素苷代谢途径
中的一个关键性酶[ 6] ,属于细胞色素 p450家族 ,
它主要催化无色的二氢黄酮醇 B 环 3 端 , 5 端羟
化 ,形成蓝紫色翠雀素的直接前体二氢杨梅黄酮 ,
从而最终决定了花卉的颜色[ 4-5] 。大多数天然蓝
色花是由于 F3′5′H 基因的有效表达所致 ,因此 ,
通过导入 F3′5′H 基因来补充某些花卉合成蓝色
色素的能力 ,已成为目前基因工程技术创造蓝色
花卉的主要途径 。
本试验从蓝紫色矮牵牛花瓣提取 RNA ,利用
RT-PCR的方法成功克隆了编码 F3′5′H 基因的
cDNA 全序列 ,并将其构建成由 CaMV35S 启动
子调控的植物表达载体 PBI-F3′5′H ,通过农杆菌
介导法转化粉红品系矮牵牛 ,已获得经过 PCR检
测呈阳性的转化植株 ,这为培育蓝色花矮牵牛植
物材料奠定了基础。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　植物材料　矮牵牛(Petunia hybrida)为
蓝紫色和粉红色品系 ,由石河子园林处提供。
1.1.2　菌株和质粒　转化受体菌分别为大肠杆
菌 DH5α和根癌农杆菌(Agrobacterium tume fa-
ciens)GV3101 ,植物表达载体为 PBI-121 ,均为石
河子大学生物技术中心实验室保存 。植物转化质
粒为 PBI-F3′5′H 。
1.1.3　试剂和酶　Triozl提取液 、pGM-T 连接
试剂盒为北京天根生物技术公司产品;琼脂糖凝
胶回收试剂盒 、DNA M arker 购自百泰克生物技
术公司;反转录试剂盒(M-Mulv)、Taq DNA 聚合
酶 、T4 DNA ligase 购自 Ferm rntas;限制性内切
酶 EcoR I 、BamH I 、S acI 购自大连宝生物技术
公司购自大连宝生物技术公司;其他试剂均为国
产或进口分析纯 ,引物合成和测序均由上海生物
工程公司完成 。
1.2　方法
1.2.1　F3′5′H 基因的克隆和表达载体的构建　
取蓝紫色矮牵牛花冠 , 于液氮中研磨 , 用 RNA-
plant提取 RNA ,以总 RNA 为模板 , o lig o (dT)
为引物 ,在 M-Mulv 反转录酶的作用下合成 cD-
NA 第一链 , -70℃保存备用。
根据 NCBI上公布的的编码 F3′5′H 的 cD-
NA 序列 , 设计合成一对特异引物 , 在其 5 端引
物的上游加入 BamH Ⅰ酶切位点 ,在其 3 端引物
的上游加入 Sac Ⅰ酶切位点。
F3′5′H 上游引 物:5 -`GGA TCC
BamH Ⅰ GGC-
CA TATACGT T TTCCT TTAG TC-3
下游引物:5 -`TCTAGA
Sac Ⅰ TGCGCTTCA TG-
TACTCCT T TTAA TATC-3
以反转录得到的 cDNA 第一链为模板 , 进行
PCR扩增。PCR 循环参数为:94℃ 5 min , 94℃
30s , 58℃30 s , 72℃1 min 45 s;72℃7 min , 共
30个循环。PCR 扩增产物在 0.8%琼脂糖凝胶
电泳检测 ,用 DNA 回收试剂盒回收 ,然后将回收
产物与 pGM-T EasyVector载体连接。通过蓝白
斑筛选 , 挑取独立白色菌落摇菌 ,小量法提取质
粒 DNA , 通过酶切鉴定筛选出阳性重组子 ,重组
质粒命名 pGM-F3′5′H ,由上海生工生物工程公
司进行序列测定。
用 BamH Ⅰ和 SacⅠ双酶切载体 pGM-F3′5′
H , 用相同的酶双酶切 pBI121载体 ,分别回收目
的片段和载体片段 , 用 T4 DNA连接酶连接载体
和目的基因片段 , 转入 DH5α, 获得重组质粒
PBI- F3′5′H ,进行酶切鉴定和核苷酸序列分析。
1.2.2　矮牵牛再生体系的建立及农杆菌转化　
矮牵牛再生体系的建立 　矮牵牛的再生在梁冰
等[ 9]建立的体系上略有改进。
采取农杆菌叶盘法进行植物转化　用冻融法
将质粒 PBI-F3′5′H 转入根癌农杆菌(Agrobacte-
rium tume f acien s)GV3101。挑取经转化含有目
的基因的单菌落 , 在含抗生素(利福平10 mg/L ,
庆大 50 mg/ L 和卡那霉素 50 mg/L)的 LB液体
培养基中 , 28℃培养过夜。按 1∶100比例 ,吸取
200 μL 菌液至 20 mL LB中活化 ,摇至 OD260为
·307·5 期　　　　　　　　　　司爱君等:F3′5′H 基因的克隆 、表达载体构建与矮牵牛遗传转化
0.2左右 。
将矮牵牛叶片预培养 3 d ,在材料切口刚开始
膨大时即可进行侵染 ,浸染时间为 10 min 。叶片
与农杆菌共培养 2 ～ 3 d 后 ,用含头孢 500 mg/L
的无菌水冲洗叶片 ,于灭菌的滤纸上沾干 ,也是近
轴面朝下 ,置含头孢 500 mg/L 的诱导分化培养
基上延迟筛选 5 ～ 7 d ,再放入分化培养基(含头孢
500 mg/L +卡那 50 mg/ L)中诱导分化出苗 。分
化苗移至生根培养基中生根 ,形成完整植株。
1.2.3　转化植株 PCR检测　生根的试管苗移到
沙质基质成活后 ,用 CTAB方法提取矮牵牛叶片
的 DNA ,用作模板 ,以特异性引物进行 PCR扩
增 ,将 PCR产物在 0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测 。
2　结果与分析
2.1　矮牵牛 F3′5′H基因的序列分析
从蓝紫色矮牵牛中扩增出一条约 1.7 kb 的
片段 ,其大小与已公布的相吻合 ,初步确定为 F3′
5′H , PCR 产物的电泳图谱见图 1 。将扩增的
PCR 产物连到 pGM-T 载体上 , 并对其中 pGM-
F3′5′H 的两个克隆进行酶切鉴定 ,也切出了约
1.7 kb 大小的片段 ,结果证明 PCR 扩增的片段
已克隆到 T 载体上 ,结果见图 2。
LaneM.DNA Marker DL2000 , Lane2.Negat ive com paris on ,
Lane3.Amplif ication of F3′5′H- PCR
图 1　PCR产物凝胶电泳
Fig.1　Amplif ication of PCR
　　测序结果用 DNAMAN 软件序列拼接 ,并登
陆 NCBI 采用 BLAS T 进行比对。分析结果表
明 ,F3′5′H 基因的编码框长度为 1 521 bp , 与
NCB I 登录的 cDNA 序列(D14588)相似性为
99.34% ,编码 507个氨基酸 。根据 F3′5′H cD-
NA 的测序结果推算氨基酸序列 ,并与 NCBI 登
录的氨基酸序列进行分析比较 ,发现推算的氨基
酸序列与文献报道的存在 2 个氨基酸差异 ,氨基
酸同源率为 99.6 %。
Lane 1-2.pGM-F3′5′H/ EcoR I ;LaneM.DNA MarkerⅢ
图 2　PGM-F3′5′H的酶切鉴定
Fig.2　Restriction enzyme digestion identif ication
of pGM-F3′5′H
2.2　植物表达载体 pBI-F3′5′H的构建
重组质粒 PBI-F3′5′H 经 BamH Ⅰ和 Sac Ⅰ
双酶切 ,出现了 1.7 kb 的 DNA 片段 ,与 PCR扩
增片段一致 , 表明 F3′5′H 基因已正向插入在
PBI-F3′5′H 载体的 35S启动子的下游。
LaneM.DNA MarkerⅢ;Lane2 , 3.PBI- F3′5′H/ BamHⅠ+ SacⅠ
图 3　PBI- F3′5′H酶切鉴定结果
Fig.3　Restriction enzyme digestion identif ication
of PBI- F3′5′H
2.3　转基因抗性植株的获得
矮牵牛叶片经过农杆菌的浸染及共培养后 ,
若立即放到附加卡那霉素的筛选培养基上 ,会使
转化外殖体芽的分化率降低。因为卡那霉素对植
物细胞具有强烈的毒害作用 ,部分转化细胞在没
有形成抗性愈伤组织之前抵抗卡那霉素的能力较
弱 ,抑制了细胞分裂和不定芽的形成。因此 ,将共
培养后的矮牵牛叶片转入只含 500 mg/L 头孢的
分化培养基上进行延迟筛选 7 d ,再将叶片转至含
卡那霉素 50 mg/L 的分化培养基上进行抗性愈
伤的筛选 。培养 20 d 后转化外殖体开始有愈伤
·308· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　17 卷
组织及不定芽长出 ,初步认定为转基因芽 ,并做进
一步生根筛选。对照矮牵牛叶片在含卡那霉素
80 mg/L 的培养基上培养会逐渐变黄 、白化和死
亡 ,不能产生不定芽 。
LaneM.DNA Marker DL2000;Lane2.Negat ive com paris on;
Lane3 , 4 , 5 , 6.Transgenic plants
图 4　对照及 F3′5′H转化植株的 PCR检测
Fig.4　PCR tested of transgenic plants
　　将获得的抗性芽转入含卡那霉素 50 mg/L
的继代培养基上进行增殖和筛选培养 ,部分抗性
芽继续增殖且生长健壮 ,其他的非抗性芽在此培
养基上枯黄 、死亡。如此连续筛选 2代 ,将筛选得
到的抗性植株置含卡那霉素 30 mg/L 的生根培
养基中进行生根筛选 ,一个月后抗性株系陆续生
根。未转化的对照植株在含卡那霉素 30 mg/L
的生根培养基中完全不能生根 。
2.4　转 F3′5′H 基因矮牵牛的 PCR 检测
提取上述生根抗性植株的总 DNA ,取 2 μg
作模板 ,以农杆菌重组质粒为阳性对照 ,以未转基
因的植株作为阴性对照 ,用特异性引物进行 PCR
扩增 ,结果见图 4。转化出的阳性矮牵牛植株经
PCR 扩增后 ,得到一条约 1.7kb 的特异 PCR 扩
增片段 ,与预期大小一致 ,而阴性对照植株未出现
该特异性片段 ,初步证明 , F3′5′H 基因已整合到
抗性矮牵牛的基因组中。
3　讨论
通过引入外源基因而改变植物花色 ,已在多
种植物上获得成功 。Florigene 公司和 Sunto ry
公司向缺失 DFR 的白色香石竹中导入矮牵牛
F3′5′H 和 DFR 基因 ,成功得到紫色转基因植
株[ 7] 。Florigene 公司还将矮牵牛 F3′5′H 和
Cy tb5基因同时转入红色香石竹 ,得到开深紫色
花的转基因植株(Winkel-Shirley , 2001);向含有
天竺葵色素和花青素的月季品种中引入 F3′5′H
基因 ,使花色转变为蓝色 [ 8] ;将龙胆中编码 F3′5′
H 的基因转入矮牵牛中 ,花色由粉红色变为品
红 ,而转入烟草中 ,花色仅有略微的改变[ 6] 。
本试验利用 RT-PCR 技术从蓝紫色矮牵牛
的花瓣中克隆得到了控制花色的类黄酮 3′5′羟基
化酶基因 ,并利用组成型表达的启动子构建了植
物表达载体 ,用于不含该基因的粉红色矮牵牛品
系的转化 ,这样可以有效消除其他调控因子对该
基因表达的影响 。当前 ,商品化的矮牵牛品种多
为杂合品种 ,通过分离后代的遗传分析 ,有助于解
析 F3′5′H 基因与其他基因的相互关系 ,找出影
响花色形成的关键因素。
试验还发现 ,矮牵牛遗传转化存在转化率低 、
有假阳性植株及转基因植株不容易生根的现象。
初步分析认为:①外植体在转化前进行预培养是
必要的 ,通过预培养 ,细胞正处于分裂状态 ,更容
易整合外源 DNA 。 ②转化材料的再生能力比非
转化材料的再生能力低得多。经过侵染后的外植
体在进行筛选时 ,需要在原来的分化培养基中加
入抑菌抗生素和选择标记抗生素 ,这不可避免地
会影响转化材料的再生。外源基因转入受体植物
细胞并整合到基因组时 ,其表达产物的积累有一
个过程。因此试验中可采用延迟筛选 ,即共培养
结束后过几天再加入选择压力 ,以利于转化细胞
的早期生长 ,可得到较高转化率 。③再生芽由非
转化细胞分化 ,是造成假阳性植株产生的主要原
因。由于不定芽的再生常起源于多细胞 ,其中有
些细胞可能是转化细胞 ,有些则可能是非转化细
胞 ,因此会出现较多的嵌合体。受转化细胞代谢
产物的影响 ,一些邻近的非转化细胞在不同程度
上也可能对选择压产生耐受性 ,分化长出假抗性
芽。另外 ,试验以矮牵牛叶片为外植体 ,在生长过
程中 ,随着体积的不断膨大 ,部分外植体会上翘而
脱离筛选培养基 ,这部分外植体受培养基中抗生
素的抑制作用小 ,造成假阳性的非转化芽增加。
因此 ,在生根过程中仍需加入选择压进一步筛选 ,
淘汰假阳性芽 。通过转基因技术初步获得转化植
株 ,下一步将在此基础上进一步研究 F3′5′H 基
因对花色的影响 ,以期得到花色变异植株 ,为今后
利用基因工程技术改良花色研究奠定基础。
(下转第 329页)
·309·5 期　　　　　　　　　　司爱君等:F3′5′H 基因的克隆 、表达载体构建与矮牵牛遗传转化
种玉米醋均具有降低机体脂肪总含量的作用 ,同
一条件下的对比发现 ,麸皮黑曲玉米醋的降血脂
作用强于麸皮玉米醋 ,更强于玉米醋 ,从而说明在
发酵过程中添加麸皮和黑曲可以明显提高成品醋
的降血脂作用。
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·329·5 期　　　　　　　　　　　　　张战国等:麸皮 、黑曲对玉米醋功能性的强化作用