全 文 ：中国农学通报 2012,28(18):174-178
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
在十字花科植物中，存在一个特殊的底物-酶系
统，即硫苷 -黑芥子酶系统 (Glucosinolate-Myrosinase
system) [1]。硫苷的水解是由黑芥子酶(Myrosinase，EC
3.2.3.1)催化完成[2]。编码黑芥子酶的基因家族分为 3
个亚类，即MA(Myrosinase A)，MB(Myrosinase B)和
MC(Myrosinase C)[3-4]。MA黑芥子酶（相对分子量是
75000）以游离的二聚体形式存在，而MB黑芥子酶（相
对分子量是 65000）和MC黑芥子酶（相对分子量是
70000）则是和一些蛋白质结合，以黑芥子酶复合体
基金项目：国家自然基金面上项目(31071455)。
第一作者简介：张伟，男，1986年出生，湖南郴州人，在读硕士，研究方向：植物分子生物学。通信地址：410128湖南农业大学生命科学楼507，E-mail：
alibabacs@163.com。
通讯作者：阮颖，女，1963年出生，浙江绍兴人，博士生导师，博士，研究方向：植物分子细胞生物学。通信地址：410128湖南农业大学生物科学技术学
院，E-mail：Yingruan@hotmail.com。
收稿日期：2012-02-22，修回日期：2012-05-27。
甘蓝型油菜 iMyAP9、iMyAP12基因过表达载体的
构建及转化拟南芥
张 伟 1,2，尹 峰 1,2，何 雯 1,2，魏 然 2，刘春林 2，阮 颖 1
（1湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128；
2作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地，长沙 410128）
摘 要：诱导型黑芥子酶协助蛋白(iMyAP)往往与黑芥子酶和黑芥子酶结合蛋白一起以复合体的形式存
在，对植物的防御系统有着重要的作用。为了研究黑芥子酶协助蛋白在植物响应非生物胁迫方面的功
能，通过以pBI121为载体，分别构建了CaMV35S::iMyAP9和CaMV35S::iMyAP12，浸花法转化拟南芥，
用卡那霉素对转化植株进行筛选，并对抗性苗进行PCR检测，初步得到67株转基因植株；提取转基因拟
南芥中RNA进行RT-PCR表达分析。结果表明，iMyAP9基因和 iMyAP12基因在随机挑选的转基因拟
南芥中获得了有效的表达。拟南芥转基因植株的获得为进一步探讨 iMyAP9基因、iMyAP12基因的生
物学功能奠定了基础。
关键词：油菜；黑芥子酶协助蛋白；iMyAP基因；转基因拟南芥
中图分类号：Q7 文献标志码：A 论文编号：2012-0488
The Over-expression Vector Construction of BnaiMyAP9 and BnaiMyAP12
and Transformation of Arabidopsis thaliana
Zhang Wei1,2, Yin Feng1,2, He Wen1,2, Wei Ran2，Liu Chunlin2, Ruan Ying1
(1College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128;
2Pre-state Key Laboratory for Germplasm Innovation and Resource Utilization of Crop, Changsha 410128)
Abstract: Inducible Myrosinase-associated protein (iMyAP) usually occur in complexes with Myrosinases and
Myrosinases-binding protein plays important roles in the plant’s defense system. To study the functions of
iMyAP in abiotic stress responses, we constructed two plant over-expression vectors CaMV35S::iMyAP9 and
CaMV35S::iMyAP12. Genetic transformation of Arabidopsis was performed by floral dip method. The T0 seeds
were screened on medium with kanamycin and the anti-kanamycin plants were tested by PCR to confirm if
anti-Kan plants were transgenic plants. 67 transgenic plants were obtained. The results of RT-PCR showed
that iMyAP9 and iMyAP12 genes efficiently expressed in the transgenic arabidopsis plants, which the results
lay a foundation for further studying the biological function of iMyAP9 and iMyAP12 genes.
Key words: Brassica napus; Myrosinase-associated protein; iMyAP; transgenic arabidopsis
张 伟等：甘蓝型油菜 iMyAP9、iMyAP12基因过表达载体的构建及转化拟南芥
(Myrosinase complex)的形式存在。在复合体中，第一
个被鉴的非黑芥子酶的蛋白是黑芥子酶结合蛋白
(Myrosinase-binding protein，MBP)[5-6]；第二个被鉴定出
的黑芥子酶协助蛋白(MyAP or MAP)是一个大小为
40 kDa的糖蛋白[7]。随后MyAPs在甘蓝型油菜中被鉴
定[8]。与MPSs/MBPRPs一样，MyAPs存在于甘蓝型油
菜种子黑芥子酶MB和MC的复合体中。但是，在
MBP缺失的植物中不存在复合体结构，当然MyAPs
也不在其中 [9]。MyAPs普遍被认为没有黑芥子酶结
构[8]，不一定会存在复合体中。在转录水平上，甘蓝型
油菜MyAPs在所有的器官都有表达，在未成熟的种子
中表达量最大。在发育 3周的植物当中，根和下胚轴
的表达量要高于真叶和子叶的表达量。在开花时期则
没有发现其在各组织的表达。在甘蓝型油菜中，当植
物受到创伤、茉莉酸诱导处理时，有一个MyAPs大量
表达，所以称之为 iMyAP (inducible-MyAP)[10-11]。在转
基因拟南芥分析甘蓝型油菜 iMyAP的启动子表达的
研究中发现，在未受诱导的情况下，在种子发芽后4天
的下胚轴中有表达。与发芽后 4天的表达量相比，发
芽后7天的表达量没有保持一致性。在未受诱导的开
花时期中，其表达只限于果荚脱落处[11]。这些表达模
式在其他的甘蓝型油菜MyAP基因中不具有代表
性[8]。在亚细胞定位上，拟南芥中，MyAPs附于膜上，
位于内质网[12]，也有报道称MyAPs在液泡中[13]。瑞典
乌普萨拉遗传研究中心的 Jan[10]从苷蓝型油菜中克隆
到了一个完整的 iMyAP基因，iMyAP9和 iMyAP12是
iMyAP基因家族中的2个基因。
诱导型黑芥子酶协助蛋白(iMyAP)与黑芥子酶和
黑芥子酶结合蛋白一起以复合体的形式存在，对植物
的防御系统有着重要的作用。然而黑芥子酶协助蛋白
在植物响应非生物胁迫方面的功能还有很大的未知
性。本研究以pBI121为载体，分别构建了CaMV35S::
iMyAP9和CaMV35S::iMyAP12，并转化拟南芥，为研
究 iMyAP9基因和 iMyAP12基因的生物学功能奠定了
基础。
1 材料与方法
1.1 载体、菌株与材料
植物表达载体pBI121、大肠杆菌菌株DH5α、农杆
菌菌株 GV3101、甘蓝型油菜‘湘油 15号’和拟南芥
Col-0均由湖南农业大学植物资源利用实验室提供。
1.2 试剂
琼脂糖(Agarose)来自西班牙 Biowest；LongAmp
Taq DNA polymerase购自 NEB公司；限制性内切酶
BamH Ⅰ、Xba Ⅰ和 RevertAidTM First Strand cDNA
Synthesis Kit购自Fermentas；TA克隆载体pMD19-T和
DNA ligase kit购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂
盒、质粒抽提试剂盒购自Axygen公司；引物由南京金
斯瑞生物科技有限公司合成；其他常用试剂均为分析
纯购自上海国药。
1.3 表达载体的构建
1.3.1 目的基因的扩增与测序 根据GenBank上公布
的 油 菜 iMyAP9 基 因 (Y10155.1)、iMyAP12 基 因
(Y10156.1)的序列，采用 primer premier5软件设计引
物。引物序列：iMyAP9F：TCTAGA ATGGCAACCAC
CTTCAGTTTAGC，iMyAP9R：GGATCCCTACATAGA
TTCACTGGCACTGACG；iMyAP12 F：TCTAGAATG
GCACCCAACTTCAGTTTAGC，iMyAP12R：GGATC
C CTACATAGATTCACTGGCACTGA CG。
提取甘蓝型油菜‘湘油15号’经创伤处理2 h后的
叶片RNA，然后进行RT-PCR反转录成 cDNA（方法参
照 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 说明
书）。然后以 cDNA为模板，用 Long Amp Taq DNA
polymerase 和相对应的引物扩增 iMyAP9 基因和
iMyAP12基因的全长CDS。PCR反应参数为：94℃预
变性30 s，94℃变性10 s，58℃退火50 s，65℃延伸90 s，
共30个循环，最后65℃终延伸10 min，PCR产物4℃保
存。用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物并连接到
TA克隆载体 pMD19-T上分别命名为 pMD19-iMyAP9
和 pMD19-iMyAP12，获得的重组子经 PCR和酶切检
测后送到金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.3.2 重组质粒 CaMV35S::iMyAP9 和 CaMV35S::
iMyAP12的构建 用质粒抽提试剂盒从阳性克隆菌里
提取pMD19-iMyAP9和pMD19-iMyAP12质粒。然后
分别对 pMD19-iMyAP9、pMD19-iMyAP12 质粒和
pBI121载体进行BamHⅠ、XbaⅠ的双酶切，酶切体系
为：BamHⅠ 15 U，XbaⅠ 15 U，1xTango buffer，37℃酶
切 2 h。使用DNA凝胶回收试剂盒回收约 1152 bp的
目的基因条带和pBI121载体。
用DNA Ligase kit将回收的目的基因和载体进行
连接，所加目的基因与载体的比例为 4:1，16℃连接
1 h。将连接产物转入DH5α感受态细胞中，在含有
50 mg/L卡那霉素(Kan)的LB平板上进行筛选。
1.3.3 重组质粒 CaMV35S::iMyAP9 和 CaMV35S::
iMyAP12的酶切验证 对PCR检测为阳性的菌落提质
粒进行酶切检测，酶切体系同1.3.2。
1.4 拟南芥的遗传转化
用 冻 融 法 将 构 建 好 CaMV35S::iMyAP9 和
CaMV35S::iMyAP12重组质粒转入农杆菌 GV3101
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中，得到转化菌株。将已制备好的CaMV35S::iMyAP9
和CaMV35S::iMyAP12质粒的农杆菌菌液，在转化前
1天加入含 50 mg/L卡那霉素(Kan)，100 mg/L利福平
(Rif)，30 mg/L庆大霉素(Gen)的YEB培养液中于摇床
28℃，220 r/min培养过夜，第 2天菌液至饱和。4℃
6000 r/min离心 5 min，弃上清，加入 5 mL 10 mmol/L
MgSO4·7H2O悬浮菌液，再加入 5 μL 200 μmol/L乙酰
丁香酮(ACS)静置 2 h。将处理好的菌液加入 100 mL
渗透培养基中（MS0221 0.22 g、蔗糖 0.5 g、Silwet-77
50 μL）中，将拟南芥莲座以上部分浸没于培养基中，浸
染2 min后将拟南芥放在恒温室暗培养24 h，第2天在
正常光照下继续培养约15天后收集种子。
1.5 抗性苗的筛选与检测
将收集的种子于4℃低温春化2天，经0.1% HgCl2
消毒 20 min后铺于含Kan (50 mg/L)的 1/2MS培养基
中进行抗性苗的筛选。CTAB法提取15天后抗性苗叶
片的DNA，进行 PCR检测。对 PCR检测为阳性植株
提取RNA进行RT-PCR检测。
2 结果与分析
2.1 iMyAP9基因、iMyAP12基因的克隆与鉴定
从甘蓝型油菜‘湘油15号’经创伤处理2 h后的叶
片 cDNA中扩增 iMyAP9基因和 iMyAP12基因，分别
得到2条大小均为1152 bp的特异性片段，经测序后与
预期结果相符（图1）。
2.2 植物表达载体的构建与鉴定
将 CaMV35S::iMyAP9和 CaMV35S::iMyAP12重
组质粒经BamHⅠ、XbaⅠ双酶切后，电泳图片中出现
2 条 1152 bp 左右的条带，分别为 iMyAP9 基因、
iMyAP12基因的目的条带（图 2），表明植物表达载体
CaMV35S::iMyAP9和CaMV35S::iMyAP12构建成功。
2.3 拟南芥转基因植株的抗性筛选及检测
将拟南芥Col-0经浸花转化后15天收集的种子平
铺于含 50 mg/L Kan的MS培养基中进行抗性苗的筛
选。筛选14天后，由图3可以看出，野生型Col-0和未
转化成功的植株逐渐黄化最后直至白化死亡；抗性植
株则叶片呈绿色，根系发达，正常生长。共筛选到 67
株 抗 性 植 株 ，其 中 CaMV35S::iMyAP9 35 株 ；
CaMV35S::iMyAP12 32株。
将抗性植株分别按单株从培养基中转移至蛭石
里继续生长，待叶片长得大些，提取植株的叶片DNA，
进行DNA的 PCR检测。从图 4、图 5可以看出，Col-0
没有条带扩出；抗性植株则扩出大小为1152 bp的阳性
条带，为转基因植株。
2.4 拟南芥转基因植株RT-PCR检测
对于提取DNA进行 PCR检测呈阳性的植株，各
选取 4株提取 RNA，进行 RT-PCR结果都有检测到
iMyAP基因的反转录产物（图 6、图 7），说明 iMyAP基
因在拟南芥中得到了有效表达。
3 结论
本研究从甘蓝型油菜叶片中克隆了 iMyAP家族
中的 2个基因 iMyAP9、iMyAP12的全长 CDS，并以
pBI121载体为基础分别构建了植物过量表达载体
CaMV35S::iMyAP9和 CaMV35S::iMyAP12。将载体
转化农杆菌GV3101后通过浸花法转化拟南芥，在经
过卡那霉素的抗性筛选得到抗性苗，经 PCR 和
RT-PCR检测后，初步得到了转基因植株。拟南芥转基
因植株的获得为进一步探讨 iMyAP9基因、iMyAP12
基因的生物学功能奠定了基础。
1500 bp
1000 bp
M 1 2 3 4
M为100 bp plus Marker；2为 iMyAP9基因扩增条带；
3为 iMyAP12基因扩增条带；1、3为阴性对照
图1 油菜 iMyAP9基因、iMyAP12基因的克隆
1500 bp
1000 bp
M 1 2 3 4
M为100 bp plus Marker；1为CaMV35S::iMyAP9双酶切；
2为CaMV35S::iMyAP9重组质粒；3为CaMV35S::iMyAP12双酶切；
4为CaMV35S::iMyAP12重组质粒
图2 CaMV35S::iMyAP9和CaMV35S::iMyAP12
重组质粒双酶切验证
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张 伟等：甘蓝型油菜 iMyAP9、iMyAP12基因过表达载体的构建及转化拟南芥
4 讨论
在拟南芥的遗传转化中，乙酰丁香酮(AS)起着重
要作用，其作用机理主要是通过诱导农杆菌Vir区基
因的活化与表达，促进T-DNA的加工与转移，从而使
农杆菌 T-DNA更易进入植物基因组并与其整合 [14]。
在众多研究中，AS 的有效使用浓度一般在 50~
200 μmol/L，浓度太高则会影响转化效率，或对植物体
产生毒害作用。张天宇等[15]在苜蓿转化过程中向农杆
菌液体培养基及共培养基中都加入10 mg/L的AS时，
GUS阳性率、抗性愈伤率和抗性芽再生率均高于其他
处理，但当AS浓度大于20 mg/L时则抑制转化。本研
究在拟南芥转化中使用的AS浓度是200 μmol/L，获得
了较多的阳性植株。
iMyAP9基因和 iMyAP12基因大小均是 1152 bp，
同源性达到了97%；两者编码的氨基酸均是383个，同
源性达到了 95%。iMyAP展示出与 ENOD8，EP4a以
1为野生型Col-0抗性筛选；2为转化完收集种子抗性筛选
图3 抗性苗的筛选
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1500 bp
1000 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1500 bp
1000 bp
M为100 bp plus Marker；1~12为抗性植株；13为Col-0；14为空白对照；15为阳性对照
图4 CaMV35S::iMyAP9转基因植株PCR检测（部分）
M为100 bp plus Marker；1~12为抗性植株；13为Col-0；14为空白对照；15为阳性对照
图5 CaMV35S::iMyAP12转基因植株PCR检测（部分）
1500 bp
1000 bp
M 3 6 7 8 CK M
1500 bp
1000 bp
1 5 7 16 CK
M为100 bp plus Marker；3、6、7、8为 iMyAP9转基因拟南芥；
CK为野生型拟南芥Col-0
图6 3、6、7、8号 iMyAP9转基因植株的RT-PCR检测
M为100 bp plus Marker；1、5、7、16为 iMyAP12转基因拟南芥；
CK为野生型拟南芥Col-0
图7 1、5、7、16号 iMyAP12转基因植株的RT-PCR检测
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及其他富含脯氨酸蛋白如之前报道过的 seed-MyAP
的特性有很大的相似性。在GenBank数据库里，可以
找到 2种跟MyAP相似性较强的蛋白：一类是来自于
紫苜蓿的螺旋式蛋白；另一个是来自于拟南芥的脂酶
Arab-1，与 iMyAP和 seed-MyAP之间的氨基酸序列的
相似性高达 24%。现已知道Arab-1蛋白属于一类具
有多个保守氨基酸残基特征的脂酶亚家族[16-17]。可以
推测 iMyAP基因的功能可能与酯酶相关。笔者分别
构建了CaMV35S::iMyAP9和CaMV35S::iMyAP12载
体来进一步探讨 iMyAP基因的功能。尹峰等 [18]已经
将 pHB::iMyAP12过表达载体转入甘蓝型油菜‘湘油
15号’，但是油菜生长周期较长，研究其功能需要较长
的时间。拟南芥和油菜同属十字花科而且又是很好的
模式生物，笔者将新构建好的CaMV35S::iMyAP9和
CaMV35S::iMyAP12载体转入拟南芥，先在拟南芥中
进行研究，为今后在油菜里的研究提供一个参考。
iMyAP9基因和 iMyAP12基因的功能以及二者之间是
否存在功能上的差异，这些问题将在下一步工作中研
究。
参考文献
[1] Giamoustaris. The effect of modifying the glucosinolate content of
leaves of oilseed rape (Brassica napus sspolefera) on its interaction
with specialist and generalist pests[J]. Ann. Appl. Biol,1995(126):
347-363.
[2] Bussy A. Sur la formation de I’huiIe essentieIIe de moutarde[J]. J
Pharm,1840(27):464-471.
[3] Chen S, HaIkier B A. FunctionaI expression and characterization of
the myrosinase MYR1 from Brassica napus in Saccaromyces
cerevisiae[J]. Prot Exp Pur,1999(17):414-420.
[4] Ue J P, Lenman M, FaIk A, et al. The gIucosinolate-degrading
enzyme myrosinase in Brassicaceae is encoded by a gene family[J].
PIant Mol Biol,1992,18(2):387-398.
[5] Lehman M, Rodin J, Josefsson L G, et a1. Immunological
characterization of rapeseed myrosinase[J]. Eur J Biochem,l990,194
(3):747-753.
[6] Falk A, Taipalensuu J, Ek B. Characterization of rapeseed
myrosinase-binding protein[J]. Planta,1995,195(3):387-395.
[7] Falk A, Ek B, Rask L. Characterization of a new myrosinase in
Brassica napus[J]. Plant Mol Biol,1995(27):863-874
[8] Taipalensuu J, Falk A, Rask L. A wound-and methyl
jasmonate-inducible transcript coding for a myrosinase-associated
protein with similarities to an early nodulin[J]. plant physiol,1996,
110(2):483-491.
[9] Eriksson S, Andreasson E, EKbom B, et al. Complex formation of
myrosinase isoenzymes in oilseed rape seeds are dependent on the
presence of myronsi-nase-binding proteins[J]. Plant Physiol,2002
(129):1592-1599.
[10] Jan T, Erik A, Susanna E, et al. Regulation of the wound - induced
myrosinase associated protein transcript in Brassica napus plants[J].
Eur J Biochem,1997(247):963-971.
[11] Erik A, Jan T, Lars R, et al. Age-dependent wound in duction of a
myrosinase associated protein from oilseed rape (Brassica napus)
[J]. Plant Molecular Biology,1999(41):171-180.
[12] Zhang Z Y, Ober J A, Kliebenstein D J. The gene controlling the
quantitative trait locus EPITHIOSPECIFIER MODIFIER1 alters
glucosinolate hydrolysis and insect resistance in Arabidopsis[J].
Plant Cell,2006(18):1524-1536.
[13] Chen S, Collum R P, Sarry J E, et al. Vacuolar proteomics revealed
important properties of the myrosinase-glucosinolate system[A]. In:
Abstracts of the First International Conference on Glucosinolates,
Jena, 10-14 September,2006.
[14] Hooykaas P J J, schilperoort R A. Agrobacterium and plant genetic
engincering[J]. Planl Mol Biol,1992(19):15-18.
[15] 张天宁.农杆菌介导的拟南芥 rd29A基因转化菖蓿的研究及柳树
组织培养再生技术初探[D].兰州:甘肃农业大学,2007.
[16] Brick D J, Brumlik M J, Buckley J T, et al. A new family of
lipolytic plant enzymes with members in rice,arabidopsis and maize
[J]. FEBS Lett,1995(377):475-480.
[17] Upton C, Buckley J T. A new family of lipolytic enzymes[J]. Trends
Biol,1995(20):178-179.
[18] 尹峰,胡燕,彭琦,等.iMyAP基因过表达载体转化甘蓝型油菜[J].分
子植物育种,2010,8(4):708-712.
·· 178