全 文 ：２０１５年７月 四川大学学报 （自然科学版） Ｊｕｌｙ．２０１５
第５２卷　第４期 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏｌ．５２　Ｎｏ．４
收稿日期：２０１４－０１－０６
基金项目：国家自然科学基金 （３１１７１５８６），国家转基因重大专项 （２０１１ＺＸ０８００９－００３－００２）
作者简介：袁德志 （１９８９－），男，贵州普定人，硕士，研究方向为植物遗传与分子生物学．
通讯作者：杨毅．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｙｉ５２８＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ
ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０４９０－６７５６．２０１５．０７．０２８
拟南芥ＡｔＤＷＤ与ＡＢＩ２相互作用的初步研究
袁德志，李德款，赵　哲，杨　昊，杨　毅
（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都６１００６４）
摘　要：本文以ＲＣＡＲ１为诱饵蛋白通过酵母双杂交 （Ｙ２Ｈ）技术筛选出了ＤＷＤ基因编码
的蛋白，同时在用ＡＢＩ２参与筛选的过程中，同样得到了ＤＷＤ这个基因．进行了ｐｕｌ　ｄｏｗｎ
实验验证它们之间的相互作用，实验结果显示：在体外，ＲＣＡＲ１、ＲＣＡＲ３与ＤＷＤ之间确
实存在相互作用，同时ＡＢＩ２与ＤＷＤ也存在相互作用．其后对ＤＷＤ结构的进行分析和实
验，发现ＡＢＩ２和ＤＷＤ的相互作用区域集中在ＡｔＤＷＤＣ端，大概是１４５～３５０位氨基酸之
间的 ＷＤ４０结构域里．
关键词：酵母双杂交；Ｐｕｌ　ｄｏｗｎ；ＰＰ２Ｃ；ＡｔＤＷＤ
中图分类号：Ｑ９４５　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：０４９０－６７５６（２０１５）０４－０８６５－０６
Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＡＢＩ２　ａｎｄ
ＡｔＤＷＤ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
ＹＵＡＮＤｅＺｈｉ，ＬＩ　Ｄｅ－Ｋｕａｎ，ＺＨＡＯ　Ｚｈｅ，ＹＡＮＧ　Ｈａｏ，ＹＡＮＧ　Ｙｉ
（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｃｏ－Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，
Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００６４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｔＤＷＤ （ＷＤ４０）ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｙｅａｓｔ　ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｂａｉｔ　ｏｆ
ＲＣＡＲ１ｉｎ　ｆｏｒｍｅｒ　ｗｏｒｋ．Ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＡＢＩ２ （ａ　ｋｉｎｄ　ｏｆ　ＰＰ２Ｃ）ｃｏｕｌｄ　ｉｎｔｅｒａｃｔ　ｗｉｔｈ
ＡｔＤＷＤ．Ｄｕｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　ｔｗｏ　ｈｙｂｒｉｄ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｕｓｅｄ　ＧＳＴ　ｐｕｌ　ｄｏｗｎ　ｔｏ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＡＢＩ２ａｎｄ　ＡｔＤＷＤ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ
ＡｔＤＷＤ　ａｎｄ　ＡＢＩ２ｗａｓ　ｅｘｉｓｔ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　１４５～３５０ａａ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃ　ｔｅｒｍｉｎｕｓ　ｏｆ　ＡｔＤ－
ＷＤ　ｉｎｔｅｒａｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＡＢＩ２（ＰＰ２Ｃ）．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｙｅａｓｔ　ｔｗｏ　ｈｙｂｒｉｄ　ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｕｌ　ｄｏｗｎ；ＰＰ２Ｃ；ＡｔＤＷＤ
１　引　言
作为植物激素，ＡＢＡ在植物抗逆机制中不可
或缺，同时ＡＢＡ在植物胁迫应答和生长发育中也
起着十分重要的作用［１，２］．至 ＡＢＡ发现以来，对
ＡＢＡ及其相关作用机理的研究一直是科研的热点
之一，２００９年一类命名为 ＰＹＲ／ＰＹＬｓ （也称为
ＲＣＡＲｓ）的蛋白家族，他们的特点是都包含
ＳＴＡＲＴ结构域，被鉴定为 ＡＢＡ受体蛋白［３］．研
究者们通过研究发现这一类ＲＣＡＲｓ蛋白能够与
ＰＰ２Ｃ （ＡＢＩ１、ＡＢＩ２、ＨＡＢ１和 ＰＰ２ＣＡ／ＡＨＧ３）
发生相互作用，从而抑制 ＰＰ２Ｃ的活性［４－６］．而
ＰＰ２Ｃｓ，包括ＡＢＩ２抑制着下游基因ＳｎＲＫ２ｓ亚家
族的活性，如果ＡＢＩ２受到抑制，那么ＳｎＲＫ２ｓ的
功能就得到了激活，从而磷酸化下游的一些特定
应答元件转录因子，最终启动ＡＢＡ应答基因的表
　 四川大学学报 （自然科学版） 　 第５２卷
达［７］．
本室一直致力于ＡＢＡ信号通路的研究，针对
ＡＢＩ２，我们通过酵母双杂交的方法，针对ＡＢＩ２进
行实验，发现它能够与一种含有多个 ＷＤ４０结构
域的蛋白相互作用，这种蛋白我们命名为 ＡｔＤ－
ＷＤ．
而目前关于ＤＷＤ的研究表明，ＤＷＤ很有可
能在泛素降解体系中有一定的作用，一些研究者
发现ＤＷＤ家族蛋白能够和一种被命名为ＤＤＢ１
的蛋白相互作用，这种蛋白则是一种被命名为
Ｃｕｌｉｎ－ＲＩＮＧ　４（ＣＲＬ４）的泛素连接酶复合物的
重要构成部分，而目前已经有证据表明Ｅ３泛素体
系参与了ＡＢＡ信号转导途径，有科研工作者认为
ＤＷＤ很有可能是ＣＲＬ４的底物受体，在降解过程
中起着连接底物与Ｅ３的重要作用［８］．
为了进一步的确定和探究ＡＢＩ２与ＤＷＤ的相
互作用，我们通过体外表达两种蛋白并进行了
ｐｕｌ　ｄｏｗｎ实验，并根据ＤＷＤ上 ＷＤ４０结构区域
的不同，对其进行节段，通过酵母双杂交以进一
步分析ＡＢＩ２和ＤＷＤ的结合部位在ＤＷＤ上的所
在区域，我们发现，这个作用区域集中在ＡｔＤＷＤ
Ｃ端１４５～３５０位的氨基酸序列中，并且在切除掉
这些区域以后相互作用变得不存在或者明显降低，
希望这些结果能够为后面的研究提供一定的帮助．
２　材料与方法
２．１　材料
各类菌株 （包括克隆菌株，表达菌株）来源
于实验室的现有菌株，ＡＨ１０９酵母菌株来源于
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ． 载 体 （ｐＥＴ２８Ａ，ＧＴＫ，ＰＧＢＫＴ７－
ＲＡＣＲ１，ＰＧＡＤＴ７）均为常用载体，来源于实验
室．ＧＳＴ－ｒｅｓｉｎ、Ｈｉｓ－ｒｅｓｉｎ蛋白质纯化柱以及填料
购自ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｈｉｓ抗体，ＤＭＳＯ采购于Ｓｉｇｍａ
公司．其它常用试剂来源于实验室现有，引物的
合成以及载体特定基因的测序由华大基因完成．
２．２　方法
２．２．１　目的基因的分离与扩增　从拟南芥ｃＤＮＡ
通过 ＰＣＲ 等手段获取目标基因 ＡＢＩ２，ＤＷＤ，
ＲＣＡＲ１的全长基因，引物皆为自己设计并通过华
大基因合成．
２．２．２　载体的构建　构建ｐＥＴ２８Ａ－ＡＢＩ２、ＧＴＫ－
ＡｔＤＷＤ载体，用于原核表达蛋白进行ｐｕｌ　ｄｏｗｎ．
构 建 ＰＧＢＫＴ７－ＡＢＩ２、 ＰＧＡＤＴ７－ＡｔＤＷＤ、
ＰＧＡＤＴ７－ＲＣＡＲ１用于酵母双杂交实验．我们通
过Ｓｍａｒｔ软件对 ＡｔＤＷＤ 的基因结构进行分析，
为了确定ＤＷＤ上的多个 ＷＤ４０机构域中真正起
作用的那一个或者那一些，我们根据 ＷＤ４０结构
区域的不同将ＡｔＤＷＤ的氨基酸序列分成了如下
５个部分 （图１）：ＷＤ１ （１～６１）、ＷＤ２ （６２～
１０３）、ＷＤ３ （１０４～１４４）、ＷＤ４ （１４５～２２９）、
ＷＤ５ （２３０～３５０）．由于预测结果中 ＡｔＤＷＤ与
ＡＢＩ２的相互作用区域可能主要集中于Ｃ端，我们
又对Ｃ端的几个 ＷＤ４０结构域进行了组合，包括
ＷＤ３４ （１０４～２２９）、ＷＤ４５ （１４５～３５０）、ＷＤ３４５
（１０４～３５０）三个部分．然后分别设计引物，构建
如 下 载 体： ＰＧＡＤＴ７－ＷＤ１、ＰＧＡＤＴ７－ＷＤ２、
ＰＧＡＤＴ７－ＷＤ３、 ＰＧＡＤＴ７－ＷＤ４、 ＰＧＡＤＴ７－
ＷＤ５、 ＰＧＡＤＴ７－ＷＤ３４、 ＰＧＡＤＴ７－ＷＤ４５、
ＰＧＡＤＴ７－ＷＤ３４５．
图１　不同结构域的ＡｔＤＷＤ氨基酸片段
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｏｍａｉｎ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ
ＡｔＤＷＤ
２．２．３　蛋白质纯化及 Ｐｕｌ　ｄｏｗｎ　分别将ＧＴＫ－
ＡｔＤＷＤ、ｐＥＴ２８Ａ－ＡＢＩ２以及 ＧＴＫ 空载体转入
到表达菌株Ｒｏｓｅｔｔａ中并置于特定抗性的培养基
上进行单克隆筛选，挑取阳性单克隆过夜培养活
化，然后按照１∶１００接入到特定抗性的５００ｍＬ
ＬＢ培养基中，在摇床内特定条件 （３７℃，２２５ｒ／
ｍｉｎ）下培养２ｈ，然后加入终浓度为０．５ｍＭ 的
诱导剂ＩＰＴＧ，在摇床中特定条件 （２８℃，１８０ｒ／
ｍｉｎ）下，诱导表达７ｈ，收集菌体破碎后将蛋白
质经亲和层析分离，纯化，得到了０．５３６３ｍｇ／ｍＬ
Ｈｉｓ－ＡＢＩ２、０．４９０８ｍｇ／ｍＬ　ＧＳＴ （用作对照组）、
０．４４２０ｍｇ／ｍＬ　ＧＳＴ－ＤＷＤ的原核表达蛋白．分
别取２０μｇ的 ＧＳＴ、ＧＳＴ－ＤＷＤ蛋白质，向其中
各加入４０μＬ谷胱甘肽－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ介质以及
５μｇ的 Ｈｉｓ－ＡＢＩ２蛋白，然后用分别加入Ｉｎｃｕｂａ－
ｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ　Ｔｒｉｓ－Ｃｌ，ｐＨ７．５，１００ｍｍｏｌ
ＮａＣｌ，１ｍｍｏｌ　ＥＤＴＡ－Ｎａ２，１ｍｍｏｌ　ＤＴＴ，０．２％
Ｔｒｉｓｔｏｎ　Ｘ－１００）补足５００μＬ，其后在摇床中特定
６６８
第４期 　　 袁德志，等：拟南芥ＡｔＤＷＤ与ＡＢＩ２相互作用的初步研究 　
条件下 （４℃，６５ｒ／ｍｉｎ）孵育４ｈ．再用 Ｗａｓｈ
ｂｕｆｆｅｒ （５０ ｍｍｏｌ　Ｔｒｉｓ－Ｃｌ，ｐＨ７．５，５００ ｍｍｏｌ
ＮａＣｌ，１ｍｍｏｌ　ＥＤＴＡ－Ｎａ２，１ｍｍｏｌ　ＤＴＴ，０．１％
Ｔｒｉｓｔｏｎ　Ｘ－１００）在摇床内特定条件下 （４℃，５０
ｒ／ｍｉｎ）清洗５次，每次５ｍｉｎ，除去游离的蛋白，
低速离心１ｍｉｎ，得到最终产物．制样，分别在样
品中加入３０μＬ　１×ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ，沸水浴１０
ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取０．２５μｇ量的
Ｈｉｓ－ＡＢＩ２作为５％Ｉｎｐｕｔ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 电泳和
ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测方法来源于文献［９］，转膜以后用
Ｈｉｓ特异的抗体进行检测，最后通过ＤＡＢ显色以
后，用软件Ｂａｎｄｓｃａｎ对结果进行分析．
２．２．４　酶母双杂交　酵母双杂交实验的各个步骤
参考Ｃｌｏｎｔｅｃｈ操作手册和相关文献［１０］，由于有两
组酵母双杂交的实验，分别设立正负对照，ＤＷＤ
与ＡＢＩ２之间相互作用确定，阳性对照为 ＰＧ－
ＢＫＴ７－ＲＡＣＲ１＋ＰＧＡＤＴ７－ＡｔＤＷＤ，阴性对照为
ＰＧＢＫＴ７－ＡＢＩ２ ＋ ＰＧＡＤＴ７ 与 ＰＧＢＫＴ７ ＋
ＰＧＡＤＴ７－ＡｔＤＷＤ．而在酵母共转化检测 ＡＢＩ２与
ＡｔＤＷＤ相互作用部位的试验中，正对照为ＰＧ－
ＢＫＴ７－ＡＢＩ２＋ＰＧＡＤＴ７－ＡｔＤＷＤ，负对照为ＰＧ－
ＢＫＴ７－ＡＢＩ２ ＋ ＰＧＡＤＴ７ 与 ＰＧＢＫＴ７ ＋
ＰＧＡＤＴ７－ＡｔＤＷＤ．将转入质粒后的酵母细胞均
匀涂布在氨基酸缺陷型筛选培养基ＳＤ／Ｌｅｕ－／Ｔｒｐ－
平板上，倒置平板，３０℃培养３～５ｄ，然后挑取
阳性单克隆涂在四缺培养基ＳＤ／Ｌｅｕ－／Ｔｒｐ－／Ｈｉｓ－／
Ａｄｅ－／８ＭＭＯＬ　３ＡＴ平板上，３０℃培养３～４ｄ，
其长出白色圆型光滑菌落的为阳性．其后在培养基
ＳＤ／Ｌｅｕ－／Ｔｒｐ－／Ｈｉｓ－／Ａｄｅ－／８ＭＭＯＬ　３ＡＴ 平板上挑
取的阳性克隆接入缺陷型液体培养基ＳＤ／Ｌｅｕ－／
Ｔｒｐ－中，摇床上特定条件 （３０℃，２２０ｒ／ｍｉｎ），培
养４８ｈ，至菌液 ＯＤ值为０．５～０．６，分别取５μＬ
菌液滴点并稀释１０倍，１００倍并列滴在培养基
ＳＤ／Ｌｅｕ－／Ｔｒｐ－和 ＳＤ／Ｌｅｕ－／Ｔｒｐ－／Ｈｉｓ－／Ａｄｅ－／８ＭＭＯＬ
３ＡＴ平板上，３０℃倒置培养３～５ｄ，观察菌落生
长情况，长出白色菌落的证明有相互作用存在．
３　结果与分析
３．１　验证ＤＷＤ与ＡＢＩ２之间的相互作用
在之前的研究中，我们已经发现 ＲＣＡＲ１能
够与 ＡＢＩ２发生相互作用，ＤＷＤ是否也能够与
ＡＢＩ２发生相互作用，经过酵母实验，如图２所示，
四组实验中第一行三个稀释比例下在二缺培养基
上均能长出菌落，证明酵母共转化质粒均已经成
功进入酵母菌中．作为正对照的ＲＣＡＲ１与ＡＢＩ２
两个转化子在培养基ＳＤ／Ｌｅｕ－／Ｔｒｐ－／Ｈｉｓ－／Ａｄｅ－／
８ＭＭｏｌ　３ＡＴ平板上，长出菌落，而负对照空载的
ＡＤ与ＡＢＩ２，ＢＤ与ＤＷＤ并没有长出菌落，证明
实验控制精确，结果可信，ＡＢＩ２和ＤＷＤ转化子
与正对照出现相似的结果，证明ＤＷＤ和ＲＣＡＲ１
一样能够与ＡＢＩ２相互作用 （图２）．
图２　ＡＢＩ２与ＡｔＤＷＤ酵母共转结果
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＡＢＩ２
ａｎｄ　ＡｔＤＷＤ
３．２　不同物种中的ＤＷＤ的对比分析
ＡｔＤＷＤ的共由３４９个氨基酸构成，ＧｅｎＢａｎｋ
登录号为：ＡＥＥ３６４３５．１，如图３Ａ所示，之前的
研究表明，ＤＷＤ类蛋白的核心结构是由１６个氨
基酸构成的 Ｗ，Ｄ重复序列，这样的核心序列被
称为 ＷＤ４０ （图３Ａ红线标注部分），故我们将该
基因命名为ＤＷＤ，ＡｔＤＷＤ氨基酸序列全长同源
比对结果发现 ＡｔＤＷＤ与很多植物中的ＤＷＤ存
在同源性 （比对物种包括水稻 （Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）、
玉米 （Ｚｅａ　ｍａｙｓ）、蓖麻 （Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍ　ｍｕｎｉｓ））
（图３Ａ）．同样的我们对ＡｔＤＷＤ进行了进化树分
析 （包括蓖麻，杨树 （Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ），大
豆 （Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ），葡萄 （Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ），苜蓿
（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ），拟南芥，烟草 （Ｎｉｃｏｔｉ－
ａｎａｔｏｂａｃｕｍ），水稻，玉米等），结果再一次证明了
拟南芥ＡｔＤＷＤ与这些物种中ＤＷＤ 之间有较高
同源性 （图３－Ｂ），这也说明，可能 ＤＷＤ 对于
ＡＢＩ２的作用不仅仅只是在拟南芥中能够实现．
３．３　蛋白的原核表达和蛋白质纯化
根据前面的方法我们在原核表达纯化后获得
了 ＧＳＴ，ＧＳＴ－ＤＷＤ，Ｈｉｓ－ＡＢＩ２ 三种蛋白，在
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测目的条带实验中我们能够看到如
图４所示的三个明显的蛋白条带，泳道从左至右
依次是Ｈｉｓ－ＡＢＩ２，ＧＳＴ－ＡｔＤＷＤ，ＧＳＴ，这三个蛋
７６８
　 四川大学学报 （自然科学版） 　 第５２卷
白的大小分别是５１ｋＤ、５９ｋＤ、２５ｋＤ（图４），蛋
白浓度测量分别为 ０．５３６３ ｍｇ／ｍＬ　Ｈｉｓ－ＡＢＩ２、
０．４９０８ ｍｇ／ｍＬ　ＧＳＴ （用 作 对 照 组）、０．４４２０
ｍｇ／ｍＬ　ＧＳＴ－ＤＷＤ．这样的蛋白质可以保证我们
后续实验的进行．
图３　不同物种中ＤＷＤ氨基酸序列比对和进化树分析
Ａ：序列比对；Ｂ：进化树分析
Ｆｉｇ．３　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ＤＷＤ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ
Ａ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ；Ｂ：ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ
３．４　ＧＳＴ　ｐｕｌ　ｄｏｗｎ体外验证ＲＣＡＲ１与ＡｔＤＷＤ
的相互作用
由于我们获得了状态良好的目标蛋白，我们
进一步进行体外的相互作用实验，我们通过ｐｕｌ
ｄｏｗｎ实验，获取了 ＧＳＴ与 Ｈｉｓ－ＡＢＩ２，ＧＳＴ 与
ＧＳＴ－ＡｔＤＷＤ的蛋白交联产物，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
电泳后，我们用特异性地 Ｈｉｓ－Ｔａｇ抗体检测，我
们发现，在ｉｎｐｕｔ正常，实验条件完善的情况下，
空载的ＧＳＴ并不能够在实验中结合 ＡＢＩ２ （图５－
Ａ第二条泳道），而ＤＷＤ能够和 ＡＢＩ２相互结合
所以在第三条泳道我们能够看到 ＡＢＩ２的条带；
用软件Ｂａｎｄｓｃａｎ定量分析 ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ实验结
果，将Ｉｎｐｕｔ泳道中的 Ｈｉｓ－ＡＢＩ２相对含量设置为
１００，ＧＳＴ 泳道的 Ｈｉｓ－ＡＢＩ２相对含量为４，而第
三列泳道中的Ｈｉｓ－ＡＢＩ２相对含量为４５ （图５－Ｂ），
这样的结果是具有显著性差异的，也就是说，体
外蛋白ＡｔＤＷＤ和 ＡＢＩ２之间的相互作用是显著
存在的．
图４　ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳
Ｆｉｇ．４　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｒｅｓｕｌｔ　ｍａｐ
８６８
第４期 　　 袁德志，等：拟南芥ＡｔＤＷＤ与ＡＢＩ２相互作用的初步研究 　
图５　ＧＳＴ　Ｐｕｌ　ｄｏｗｎ体外检测 ＡＢＩ２与 ＡｔＤＷＤ之
间的相互作用
Ａ：Ｈｉｓ抗体检测ＧＳＴ－ＡｔＤＷＤ与 Ｈｉｓ－ＡｔＡＢＩ２之间的相互
作用；Ｂ：Ｂａｎｄｓｃａｎ检测ＡＢＩ２的相对含量，将Ｉｎｐｕｔ的值设
为１００
Ｆｉｇ．５　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＡＢＩ２ａｎｄ　ＡｔＤＷＤ　ｂｙ
ＧＳＴ　Ｐｕｌ　ｄｏｗｎ　ａｓｓａｙ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
Ａ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＧＳＴ－ＡｔＤＷＤ　ａｎｄ　Ｈｉｓ－
ＡｔＡＢＩ２ｂｙ　Ｈｉｓ　ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｂ：Ｔｅｓｔｉｎｇ　ＡＢＩ２ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ
ｂｙ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｂａｎｄｓｃａｎ，ｔｈｅ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　Ｉｎｐｕｔ　ｉｓ　ｓｅｔｔｅｄ　ｔｏ　１００
３．５　酵母双杂交实验研究ＡＢＩ２与ＡｔＤＷＤ相互
作用部位
对于 ＡＢＩ２和 ＡｔＤＷＤ相互作用具体区域的
研究，我们需要通过酵母双杂交实验来完成，我
们将实验分为９组，如图６所示，九组试验中第一
行三个稀释比例下在二缺培养基上均能长出菌落，
证明酵母共转化质粒均已经成功进入酵母菌中．
正对 照 组 ＡＢＩ２ 与 ＡｔＤＷＤ 能 够 在 ＳＤ／Ｌｅｕ－／
Ｔｒｐ－／Ｈｉｓ－／Ａｄｅ－／８ＭＭＯＬ　３ＡＴ 平板上长出白色
光滑、丘状隆起状的菌落，负对照空载 ＡＤ，ＢＤ
均不能长出菌落，证明实验结果是可信且可以重
复的，而 转 化 子 ＷＤ１、ＷＤ２、ＷＤ３、ＷＤ４、
ＷＤ５、ＷＤ３４与 ＡＢＩ２在培养基ＳＤ／Ｌｅｕ－／Ｔｒｐ－／
Ｈｉｓ－／Ａｄｅ－／８ＭＭＯＬ　３ＡＴ 平板上不能长出菌落
（ＷＤ１和 ＷＤ２的结果此处未给出），说明 ＷＤ３、
ＷＤ４、ＷＤ５、ＷＤ３４与ＡＢＩ２没有相互作用或者
非常微弱．而 ＷＤ４５，ＷＤ３４５在培养基ＳＤ／Ｌｅｕ－／
Ｔｒｐ－／Ｈｉｓ－／Ａｄｅ－／８ＭＭＯＬ　３ＡＴ 平板上长出阳性
菌落 （图６）说明相互作用较为强烈，也就是证明
了这个相互作用区域集中在 ＷＤ４５的部分，也就
是ＡｔＤＷＤ　Ｃ端１４５～４５０位氨基酸这个部位．
图６　ＡＢＩ２与ＡｔＤＷＤ不同结构域片段的酵母共转结果
Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＡＢＩ２ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ＡｔＤＷＤ
４　讨　论
脱落酸ＡＢＡ是一种植物激素，在植物生长发
育调控过程中，ＡＢＡ的功能是不能够忽视的，尤
其是在植物应对如干旱、低温、高温、盐等多种
胁迫的抗逆和应答时 ＡＢＡ 的作用更是十分关
键［１１］，ＡＢＡ诱导的一些基因大多也受到干旱和
盐碱等胁迫的诱导，这就表明ＡＢＡ在胁迫应答中
有着非常重要的作用［１２］．此外 ＡＢＡ还在气孔开
闭，调节种子休眠等过程中有重要意义［１３－１５］．
９６８
　 四川大学学报 （自然科学版） 　 第５２卷
在已有的研究中我们了解到ＲＣＡＲ１是ＡＢＡ
信号通路的重要受体之一［１６］，ＲＣＡＲｓ能够与
ＡＢＩ２之间存在相互作用，在我们的研究中，我们
发现了ＡＢＩ２能够与ＤＷＤ相互作用，而这种相互
作用将有可能影响到ＡＢＡ信号通路的各个功能，
而这一点是由ＤＷＤ的功能实现的．
本实验中我们发现，ＡＢＡ受体ＲＣＡＲｓ能够
与ＡＢＩ２相互作用，而ＡＢＩ２能够与ＤＷＤ相互作
用，ＡＢＩ２如果受到抑制，下游的ＳｎＲＫｓ将会激
活，这种活性将会磷酸化一类ｂＺＩＰ型转录因子
ＡＢＦｓ／ＡＲＥＢｓ［１７］，而这种转录因子恰恰诱导了
ＡＢＡ应答基因的表达．介于 ＤＷＤ有可能在Ｅ３
体系中起到连接底物受体的关键作用，而Ｅ３泛素
连接酶已被证明参与ＡＢＡ信号转导，这就是说有
可能存在着在 ＡＢＩ２磷酸激酶调节下的泛素体系
降解过程，调节ＲＣＡＲ３从而参与到ＡＢＡ信号通
路中，并最终影响到植物的抗逆等生理过程，
ＡＢＡ信号通路中的ＲＣＡＲｓ，ＡＢＩ２都有可能是通
过ＤＷＤ参与到泛素降解体系中的，当然这需要
我们进一步的实验证明．
参考文献：
［１］ 　Ｈｉｒｏａｋｉ　Ｆ，Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ　Ｃ，Ｚｈｕ　Ｊ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎ
ｖｉｔｒｏ　ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ
ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４６２（３）：６６０．
［２］　 Ｃｈｒｉｓｔｍａｎｎ　Ａ，Ｍｏｅｓ　Ｄ，Ｈｉｍｍｅｌｂａｃｈ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．
Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎｔｏ　ｐｌａｎｔ　ｒｅ－
ｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ（Ｓｔｕｔｔｇ），２００６，８：３１４．
［３］　 Ｉｚａｂｅｌａ　Ｓ，Ｋｌａｕｓ　Ｒ，Ｍｉｃｈａｌ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｌｏｓｅｌｙ　ｒｅｌａｔ－
ｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｄｉｆｆｅｒ　ｉｎ　ｔｈｅｉｒ　ＡＢＡ　ｓｅｌｅｃｔｉｖ－
ｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，２０１０，６１ （１）：
２５．
［４］　 Ｍａ　Ｙ，Ｓｚｏｓｔｋｉｅｗｉｃｚ　Ｉ，Ｋｏｒｔｅ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ
ｏｆ　ＰＰ２Ｃｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｓ　ａｂｓｃｉｓｉｃ
ａｃｉｄ　Ｓｅｎｓｏｒｓ ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３２４ （５９３０）：
１０６４．
［５］　 Ｐａｒｋ　Ｓ　Ｙ，Ｆｕｎｇ　Ｐ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．Ａｂｓｃｉｓｉｃ
ａｃｉｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｔｙｐｅ　２Ｃｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ　ｖｉａ　ｔｈｅ
ＰＹＲ／ＰＹＬ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ＳＴＡＲＴ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｓｃｉ－
ｅｎｃｅ，２００９，３２４ （５９３０）：１０６８．
［６］　 Ｓａｎｔｉａｇｏ　Ｊ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ　Ａ，Ｓａｅｚ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｄｕｌａ－
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｂｙ　ｔｈｅ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ－ｒｅ－
ｃｅｐｔｏｒ　ＰＹＬ５ｔｈｒｏｕｇｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌａｄｅ　Ａ　ＰＰ２Ｃｓ
［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，２００９，６０ （４）：５７５．
［７］　 Ｆｕｊｉ　Ｈ，Ｖｅｒｓｌｕｅｓ　Ｐ　Ｅ，Ｚｈｕ　Ｊ　Ｋ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｄｅｃｕ－
ｐｌｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｒｅｖｅａｌｓ　ｔｈｅ　ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ　ｏｆ　ＳｎＲＫ２ｋｉｎａ－
ｓｅｓ　ｉｎ　ｏｓｍｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｉｎ　ｖｉｖｏ ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２０１１，１０８：１７１７．
［８］　 Ｌｅｅ　Ｊ　Ｈ，Ｔｅｒｚａｇｈｉ　Ｗ，Ｇｕｓｍａｒｏｌｉ　Ｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｈａｒ－
ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ａｎｄ　ｒｉｃｅ　ＤＷＤ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｒｏｌｅｓ　ａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ＣＵＬ４－
ＲＩＮＧ　Ｅ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｌｉｇａｓｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，２００８，
２０：１５２．
［９］　 Ｆｌａｊｏｌｅｔ　Ｍ，Ｒａｋｈｉｌｉｎ　Ｓ，Ｗａｎｇ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　２Ｃｂｉｎｄｓ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｔｏ　ａｎｄ　ｄｅｐｈｏｓ－
ｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ　ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ　ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　３ ［Ｊ］．
Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００３，１００：１６００６．
［１０］　李德款，张亮，彭梅芳，等．ＡＢＡ 受体 ＲＣＡＲｌ／
ＰＹＬ９相互作用蛋白质的筛选及初步研究 ［Ｊ］．四
川大学学报：自然科学版，２０１１，４８：４８６．
［１１］　Ｃｈｉｎｎｕｓａｍｙ　Ｖ，Ｚｈｕ　Ｊ　Ｋ．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｐｌａｎｔ
Ｂｉｏｌ，２００９，１２：１３３．
［１２］　Ｓｅｋｉ　Ｍ，Ｉｓｈｉｄａ　Ｊ，Ｎａｒｕｓａｋａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ
ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ａｒｏｕｎｄ　７，０００Ａｒａｂｉｄｏｐ－
ｓｉｓ　ｇｅｎｅｓ　ｕｎｄｅｒ　ＡＢＡ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ
ｃＤＮＡ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ［Ｊ］．Ｆｕｎｃｔ　Ｉｎｔｅｇｒ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，
２００２，Ｎｏｖ；２ （６）：３０１．
［１３］　Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ　Ｒ　Ｒ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ａｔ　ｔｗｏ　ｎｅｗ　Ａｒａｂｉｄｏｐ－
ｓｉｓ　ＡＢＡ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｌｏｃｉ　ａｒｅ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｂｉ３ｍｕｔａ－
ｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，１９９４，５：７５６．
［１４］　Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ　Ｒ　Ｒ，Ｇａｍｐａｌａ　Ｓ　Ｓ，Ｒｏｃｋ　Ｃ　Ｄ．Ａｂ－
ｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　ｓｅｅｄｓ　ａｎｄ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ［Ｊ］．
Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，２００２，１４：Ｓ１５．
［１５］　Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ　Ｒ　Ｒ，Ｌｙｎｃｈ　Ｔ　Ｊ．Ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ａｂ－
ｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｇｅｎｅ　ＡＢＩ５ｅｎｃｏｄｅｓ　ａ　ｂａｓｉｃ　ｌｅｕ－
ｃｉｎｅ　ｚｉｐｐｅｒ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，
２０００，１２：５９９．
［１６］　ＭｃＣｏｕｒｔ　Ｐ，Ｃｒｅｅｌｍａｎ　Ｒ．Ｔｈｅ　ＡＢＡ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ－Ｗｅ
ｒｅｐｏｒｔ　ｙｏｕ　ｄｅｃｉｄｅ ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ，
２００８，１１：４７４．
［１７］　Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｒ　Ｒ，Ｗａｇｎｅｒ　Ｒ　Ｌ，Ｖｅｒｈｅｙ　Ｓ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ
ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｋｉｎａｓｅ　ＰＫＡＢＡ１ｉｎｔｅｒａｃｔｓ　ｗｉｔｈ
ａ　ｓｅｅｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ－ｂｉｎｄｉｎｇ
ｆａｃｔｏｒ，ＴａＡＢＦ　ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ　ＴａＡＢＦ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００２，１３０（２）：８３７．
０７８