全 文 ：２０１４年３月 四川大学学报（自然科学版） Ｍａｒ．２０１４
第５１卷　第２期 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏｌ．５１　Ｎｏ．２
收稿日期：２０１３－０２－２２
基金项目：国家自然科学基金（３１１７１５８６）；国家转基因重大专项（２００９ＺＸ０８００９－０８０Ｂ）．
作者简介：谢林峰（１９８７－），男，重庆人，硕士，研究方向为植物遗传与分子生物学．Ｅ－ｍａｉｌ：ｘ＿ｊｕｓｔｉｎ＠１２６．ｃｏｍ．
通讯作者：杨毅．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｙｉ５２８＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ
ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０４９０－６７５６．２０１４．０２．０３５
拟南芥ＳＹＴＡ基因Ｔ－ＤＮＡ插入
纯合突变体的鉴定及表型分析
谢林峰，罗　勤，张　亚，赵　哲，杨　毅
（四川大学生命科学学院与生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都６１００６４）
摘　要：通过ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ在ＤＮＡ和ＲＮＡ水平上筛选鉴定ＳＹＴＡ基因Ｔ－ＤＡＮ插入失
活纯合突变体，当对野生型与突变体种子进行４５℃／４ｈ与５０℃／１ｈ热激后，野生型种子萌发
率分别达到１００％与８６％，而突变体种子萌发率分别只有８３％与２７％．当对野生型与突变体
植株幼苗进行热激处理后，其存活率与叶片萎黄率相差不大，说明ＳＹＴＡ基因能显著提高拟
南芥种子的耐热性，但拟南芥幼苗的耐热性不受ＳＹＴＡ基因的影响．
关键词：钙离子；ＳＹＴＡ；膜修复；耐热
中图分类号：Ｑ３７　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：０４９０－６７５６（２０１４）０２－０４１３－０６
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＹＴＡ
Ｇｅｎｅ　Ｔ－ＤＮＡ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ　ｍｕｔａｎｔ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ＸＩＥ　Ｌｉｎ－Ｆｅｎｇ，ＬＵＯ　Ｑｉｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｙａ，ＺＨＡＯ　Ｚｈｅ，ＹＡＮＧ　Ｙｉ
（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｃｏ－Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，
Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００６４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｎｅ　ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ　Ｔ－ＤＮＡ　ｍｕｔａｎｔ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｔ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ　ｌｅｖｅｌｓ　ｂｙ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ＲＴ－
ＰＣＲ．Ａｆｔｅｒ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔ　ｓｅｅｄｓ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ａ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　４５℃／４ｈａｎｄ　５０℃／
１ｈ，ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｒｅａｃｈｅｄ　１００％ａｎｄ　８６％，ｍｕｔａｎｔ　ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｎｌｙ
８３％ａｎｄ　２７％．Ｗｈｅｎ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ａ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｈｅｉｒ
ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｌｅａｆ　ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ　ｒａｔｅ　ｗｅｒｅ　ａｌｍｏｓｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ．Ｔｈｅ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｎｔ　ａｎｄ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ
ａｆｔｅｒ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｓｈｏｗｓ　ｔｈａｔ　ＳＹＴＡｇｅｎｅ　ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｓｅｅｄｓ’ｔｈｅｒ－
ｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ．Ｂｕｔ　ｓｙｔａ　ｍｕｔａｎｔ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｄｏｎ’ｔ　ｅｘｈｉｂｉｔ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｂａｓａｌ　ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ａｎｄ　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｔｈｅｒ－
ｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃａｌｃｉｕｍ；ＳＹＴＡ；Ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｒｅｓｅａｌｉｎｇ；Ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ
１　引　言
质膜是细胞内外环境的生物屏障，是维持细
胞完整性必不可少的结构．如果质膜受到损坏后
没能得到适当的修复，细胞将很快死亡且无法得
到恢复［１］．事实上，质膜的损坏与修复活动存在
于许多动物细胞中，如哺乳动物的骨骼肌与心肌
细胞［２］．在自然界中，植物在其生命周期会遭遇
到变化的自然环境，所以植物必须进化出一套精
密复杂的机制以感知外界信号从而做出最适当的
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５１卷
响应［３－６］，如提高植物耐盐性相关的ＳＯＳ基因；抗
渗透压相关的ＯＳＭ１／ＳＹＰ６１基因；耐冷性相关的
ＩＣＥ１基因；以及抗氧化胁迫的 ＥＮＨ１ 基因
等［７－１４］．虽然植物在上述非生物胁迫下生长其质
膜会受到损坏，但没有明确的报告说明上述抗逆
基因参与植物细胞质膜的修复过程．Ｓｙｎａｐｔｏｔａｇ－
ｍｉｎｓ（ｓｙｔ）家族蛋白是一种钙离子感受器，其Ｎ端
含有一个单跨膜区域，Ｃ端含有两个钙离子结合
区域（Ｃ２Ａ和Ｃ２Ｂ）．现已知哺乳动物中有１６种
Ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎｓ基因同型物［１５］．ＳＹＴ１作为最具
代表性的一种，其主要功能是参与神经细胞神经
递质的释放过程．神经递质释放是由Ｃａ２＋内流以
诱导突触囊泡发生胞吐而引起的，而Ｃａ２＋需与细
胞内部的Ｃａ２＋感受器相结合起来来协同控制囊泡
胞吐释放，ＳｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎＡ可能作为快速同步释
放的Ｃａ２＋感受器而发挥作用［１６］．在拟南芥中有五
种ｓｙｔ基因的同源基因（ＳＹＴ１，－１， －４，和－５；
ＳＹＴ３基因的ｃＤＮＡ全长序列在其功能区域有一
个终止密码子）．在此篇文章中我们把ＳＹＴ１命名
为ＳＹＴＡ．现已证明，在拟南芥中ＳＹＴＡ 是与质
膜修复系统有关的依赖于钙离子的植物耐冷的一
个正调控因子．此外当拟南芥根部细胞处于高盐
环境压力中时，ＳＹＴＡ 参与细胞质膜完整性与稳
定性的维持．本实验通过购买美国Ｓａｌｋ研究院遗
传分析实验室 ＡｔＳＹＴＡ（Ａｔ２ｇ２０９９０）基因的 Ｔ－
ＤＮＡ插入突变体，筛选得到纯合体后，测定突变
体与热胁迫相关的一些指标，从了进一步证实
ＳＹＴＡ基因在植物质膜修复上的作用．
２　材料与方法
２．１　试验材料
２．１．１　植物材料　拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
Ｌ）为 Ｃｏｌｕｍｂｉａ生态型．拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔ－
ｈａｌｉａｎａ）ＡｔＳＹＴＡ（Ａｔ２ｇ２０９９０）基因的 Ｔ－ＤＮＡ插
入突变体ＳＡＩＬ＿７７５＿Ａ０８购自美国Ｓａｌｋ研究院遗
传分析实验室（Ｓａｌｋ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｌａｂｒａｔｏｒｙ）．种子经７０％乙醇１ｍｉｎ，０．１％氯化
汞７ｍｉｎ，无菌水洗５次消毒后，４℃低温处理３～
４ｄ．然后播种在 ＭＳ培养基上，转至温度２２℃／
１８℃（日／夜）和１６ｈ／８ｈ（日／夜）光周期下，白炽
灯光照培养．
２．１．２　酶与试剂　 ＤＮＡ聚合酶购于ＴａＫａＲａ公
司．ＲＮＡ提取试剂盒购于 ＴｒａｎｓＧｅｎ公司．反转
率试剂盒购于ＴｏＹｏＢｏ公司．组织试剂购于Ｓｉｇ－
ｍａ公司．引物合成与测序由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ生物技术
有限公司完成．
２．２　试验方法
２．２．１　纯合突变体ＤＮＡ水平的鉴定　当植株生
长到７ｗ时，取叶片用ＣＴＡＢ法提取植物基因组
ＤＮＡ． 在 ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｎａｌ．ｓａｌｋ．ｅｄｕ／上 查 到
Ａｔ２ｇ２０９９０ 基 因 特 异 的 引 物 ＬＰ （５＇－ＡＧ－
ＧＴＣＴＣＧＣＧＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧＧ－３＇），ＲＰ（５＇－ＧＣ－
ＣＴＣＣＴＧＡＣＡＡＧＴＡＴＡＧＧＧＧ－３＇）与 Ｔ－ＤＮＡ 的
ＬＢ１（５＇－ＧＣＣＴＴＴＴＣＡＧＡＡＡＴＧＧＡＴＡ　ＡＡＴ－
ＡＧＣＣＴＴＧＣＴＴＣＣ－３＇）一起进行ＰＣＲ扩增（引物
序列由网站ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｎａｌ．ｓａｌｋ．ｅｄｕ／提供），筛选
出ＳＹＴＡ的纯合突变体，并确定确切的 Ｔ－ＤＮＡ
插入位点．
２．２．２　ＲＮＡ水平的鉴定　用ＲＮＡ提取试剂盒
提取同批生长的野生型与突变体植株的ＲＮＡ，后
用反转率试剂盒对其进行反转率．得到的ｃＤＮＡ
用突变基因 Ａｔ２ｇ２０９９０的特异引物 ＬＰ（５＇－ＡＴ－
ＧＧＧＣＴＴＴＴＴＣＡＧＴＡＣＧＡＴＡＣＴＡＧ－３＇和ＲＰ（５＇－
ＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＧＴＣＴＣ－３＇）进行
扩增，同时以ａｃｔｉｎ基因表达为对照，ａｃｔｉｎ基因引
物为（５＇－ＧＴＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＣＡＡＴＣＣＡ－３＇）
和 （５＇－ＧＴＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＣＡＡＴＣＣＡ－３＇）．
４８℃／４５ｓ，７２℃／１ｍｉｎ４０ｓ，２８个循环，扩增产物
用１．０％的琼脂糖凝胶电泳分析．
２．２．３　植株热胁迫后的表型分析
（ｉ）种子萌发率分析　将在４℃下春化３ｄ后的
野生型与突变体种子进行热处理，处理条件为：
５０℃／１ｈ；４５℃／４ｈ．然后将其进行消毒，并与未经
过热处理的种子一起播种于１×ＭＳ平板上．置于
２２℃环境下生长．每１２ｈ统计一次种子萌发率的
情况．设计３个重复．
（ｉ）苗存活率分析　将生长６ｄ的苗至于人工
气候箱中进行热处理以检测其基础性耐热与诱导
性那热情况．处理条件为：基础性耐热３９℃／４ｈ；
诱导性耐热３９℃／９０ｍｉｎ，２２℃／２ｈ，４５℃／２ｈ．为
了减小植株受到的光氧化与高湿度压力，气候箱
中相对湿度为６０％且为避光．热处理４ｄ后统计苗
存活率，设计３个重复．
３　结果与分析
３．１　Ｔ－ＤＮＡ插入位置与Ａｔ２ｇ２０９９０基因缺失纯
合突变体的鉴定
用基因的两端引物ＬＰ与ＲＰ扩增后，纯合野
４１４
第２期 　　 谢林峰等：拟南芥ＳＹＴＡ基因Ｔ－ＤＮＡ插入纯合突变体的鉴定及表型分析 　
生型中有一条带，条带大小为１０２７ｂｐ．与此对应
的纯合突变体中没有，当用ＲＰ与ＬＢ１一起扩增
时纯合突变体中有一条特异条带，条带大小在４４５
～７４５ｂｐ之间．而杂合子中同时存在上述两条带
（图１，ｂ），上述获得的条带大小与预期结果一致．
经过访问网站ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｎａｌ．ｓａｌｋ．ｅｄｕ／得知，Ｔ－
ＤＮＡ插入在Ａｔ２ｇ２０９９０基因的第１０个外显子处
（图１，ａ）．突变体植株和野生型植株的ａｃｔｉｎ基因
都能正常表达，在野生型中Ａｔ２ｇ２０９９０基因正常
表达，获得的扩增条带大小为１４０４ｂｐ，与预期结
果一致．但在突变体中Ａｔ２ｇ２０９９０基因并无表达
（图１，ｃ），表明 Ｔ－ＤＮＡ 的插入使得突变体中
Ａｔ２ｇ２０９９０基因完全被敲除，这一株材料是 Ｔ－
ＤＮＡ插入Ａｔ２ｇ２０９９０基因的纯合突变体．
图１　纯合突变体的鉴定
Ａ．Ａｔ２ｇ２０９９０基因突变通过ｐＤＡＰ１０１载体在第１０个
外显子插入；Ｂ．琼脂糖凝胶电泳：１～２．野生型；３～４．突
变体；５～６．杂合体：１，３，５泳道引物为ＬＰ与ＲＰ（获得的
目的条带为１０２７ｂｐ）；２，４，６泳道引物为ＲＰ与ＬＢ１（获得
的目的条带在４４５－７４５ｂｐ之间）；Ｃ．ＲＴ－ＰＣＲ 分析结果：
Ａｔ２ｇ２０９９０表 示 野 生 型 与 突 变 体 ＲＮＡ 反 转 录 后 用
Ａｔ２ｇ２０９９０基因引物扩增（获得的目的条带为１４０４ｂｐ），ａｃ－
ｔｉｎ表示用ａｃｔｉｎ引物扩增
Ｆｉｇ．１　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ　ｍｕｔａｎｔ
Ａ．Ｔｈｅ　Ａｔ２ｇ２０９９０ｇｅｎｅ　ｉｓ　ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｏｆ
ｔｈｅ　ｐＤＡＰ１０１ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｅｎ　ｅｘｏｎ；Ｂ．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ａｇａｒ　ｇｅｌ　ｅ－
ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：１～２．Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ；３～４．Ｍｕｔａｎｔ；５～６．ｈｅｔ－
ｅｒｏｚｙｇｏｔｅ：１，３，５．Ｌａｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ
ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒ（ＬＰ）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒ（ＲＰ）ｏｆ　ｇｅｎｅ（ｔｈｅ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　ｂａｎｄ
ｉｓ　１０２７ｂｐ）；２，４，６．Ｌａｎｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＲＰ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ＬＢ１ｏｆ
Ｔ－ＤＮＡ（ｔｈｅ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　ｂａｎｄ　ｉｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　４４５－７４５ｂｐ）；Ｃ．ＲＴ－
ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ；Ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｉｃｔｕｒｅ　Ａｔ２ｇ２０９９０ ｍｅａｎｓ　ｃｏｌ（ｗｉｌｄ
ｔｙｐｅ）ａｎｄ　Ｍｕｔａｎｔ＇ｓ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅ　ｉｎｔｏ　ｃＤＮＡ
ｂｙ　ＯｌｉｇｏｄＴ　ｐｒｉｍｅｒ，ｔｈｅｎ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　Ａｔ２ｇ２０９９０ｇｅｎｅ
ｓｐｅｃｉａｌ　ｐｒｉｍｅｒ　ｐａｉｒ（ｔｈｅ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　ｂａｎｄ　ｉｓ　１４０４ｂｐ），ａｃｔｉｎ　ｍｅａｎｓ
ＲＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｃｔｉｎｐｒｉｍｅｒ　ｐａｉｒ
３．２　植株种子受热激后萌发率与生长状况分析
如图２所示为植株种子受热激４５℃处理４ｈ
后的萌发率与植株生长情况．如图（图２，ａ，ｂ，
ｃ），未受热激的ＳＹＴＡ 基因缺失突变体种子的萌
发速率，最终萌发率与同样未受热激的野生型一
致．而受到热激后的种子，其萌发速率显著下架．
其中突变体种子的萌发速率比野生型受到更大影
响（图２，ｂ）．
又如图３所示为植株种子受５０℃处理１ｈ后
的萌发率与植株生长情况（图３，ａ，ｂ，ｃ，ｄ）．未
受热激的ＳＹＴＡ 基因缺失突变体种子的萌发速
率，植株生长状况与同样未受热激的野生型一致．
而受到热激后的种子，其萌发速率且最终萌发率
显著下降，从而导致植株的生长泄后．其中突变
体种子的萌发率与植株生长情况比野生型受到更
大影响．未受热激的野生型与突变体种子，其最
终萌发率达到１００％，而受到热激后的野生型种
子，其萌发率下降为８６％，而突变体种子的萌发
率只有２７％（图２，ｂ，ｃ）．这些结果说明拟南芥
ＳＹＴＡ基因会增强拟南芥种子的耐热性．
３．３　植株幼苗受热激后存活率分析
图４所示为植株幼苗受热激后的存活率情况，
从中可以看出无论是对植株进行基础性耐热处理
还是诱导性耐热处理，野生型植株与ＳＹＴＡ基因
缺失突变体植株的存活率与植株萎黄率几乎一致，
及其耐热性无明显区别．说明ＳＹＴＡ 基因对拟南
芥苗期的耐热性无明显影响．
４　讨　论
Ｓｙｔ基因家族广泛的存在于真核生物中．其
蛋白定位于细胞膜上．在动物细胞中，Ｓｙｔ作为钙
离子感受器具有依赖于钙离子的促进膜融合的功
能，如对细胞膜的重新封闭与修复功能．在植物
细胞中，最近已经证明拟南芥中Ｓｙｔ基因家族同
源基因，ＳＹＴＡ参与依赖于钙离子的膜修复过程，
并且能显著提高植株的耐冷性和耐盐性．其作用
机制主要为当植物处于寒冷与高盐环境中时，其
细胞膜会受到一定的损伤，这时，胞外及其胞内
细胞器中的钙离子会大量的涌入细胞质中，ＳＹ－
ＴＡ的Ｃ２Ａ结构将于钙离子子结合而其Ｃ２Ｂ结构
域具有依赖于钙离子的磷脂绑定功能．此时．ＳＹ－
ＴＡ将通过其Ｃ２Ｂ结构域的磷脂绑定功能捕获胞
质中的小泡，使其与细胞质膜融合，从而达到修
复细胞质膜，保持质膜完整性的目的．现研究表
明，高温胁迫将通过对植物细胞膜的完整性与流
动性的破坏及过氧化物的积累，细胞新陈代谢的
失衡与蛋白质的降解与失活等造成对植物的伤害．
５１４
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５１卷
图２　突变体种子４５℃热处理后萌发率情况
将在４℃下避光春化３ｄ后的野生型与ｓｙｔａ突变体种子一部分进行４５℃，４ｈ的热激处理，一部分不作处理，然后播散于平板
上，至于２４℃下每日光照１６ｈ的坏境中生长．指定时间间隔对其萌发率进行测定．Ａ．种子未受高温处理及高温处理后，７ｄ后的生
长情况．Ｂ．Ｃ．种子萌发率情况．野生型与ｓｙｔａ突变体种子萌发率在热激后差异显著Ｐ＜０．０５
Ｆｉｇ．２　ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｈｅａｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（４５℃）
Ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ，ｓｙｔａｓｅｅｄｓ（３ｄｉｎ　ｔｈｅ　ｄａｒｋ　ａｔ　４℃）ｗｅｒｅ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　４５℃ｆｏｒ　４ｈｏｒ　ｉｎ－
ｃｕｂａｔｅｄ　ａｔ　２４℃（ｎｏｒｍａｌ），ｓｏｗｎ　ｏｎｔｏ　ｐｌａｔｅｓ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ
ｕｎｄｅｒ　ａ　１６ｈｄａｉｌｙ　ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ　ａｔ　２４℃．Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ａｓｓｅｓｓｅｄ　ａｔ　ｔｈｅ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｉｎｔｅｒｖａｌｓ．Ａ，Ｉｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ
ｓｅｅｄｓ／ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　７ｄａｆｔｅｒ　ｈｅａｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｂ，Ｃ．ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｄａｔａ　ｆｒｏｍ　ｔｈｒｅｅ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｍｅａｎ＋ＳＥ，ｎ＝５５，Ａｌ
ｍｅａｎ　ｖａｌｕｅｓ　ａｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｕｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｓｙｔａａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｐ＜０．０５）
图３　突变体种子５０℃热处理后萌发率情况
将在４℃下避光春化３ｄ后的野生型与ｓｙｔａ突变体种子一部分进行５０℃，１ｈ的热激处理，一部分不作处理，然后播散于平板
上，至于２４℃下每日光照１６ｈ的坏境中生长．指定时间间隔对其萌发率进行测定．Ａ，Ｂ种子未受高温处理及高温处理，１４ｄ后的
生长情况．Ｃ，Ｄ．种子萌发率情况．野生型与ｓｙｔａ突变体种子萌发率在热激后差异显著Ｐ＜０．０５
Ｆｉｇ．２　ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｈｅａｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（４５℃）．
Ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ，ｓｙｔａ　ｓｅｅｄｓ（３ｄｉｎ　ｔｈｅ　ｄａｒｋ　ａｔ　４℃）ｗｅｒｅ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　５０℃ｆｏｒ　１ｈｏｒ　ｉｎ－
ｃｕｂａｔｅｄ　ａｔ　２４℃（ｎｏｒｍａｌ），ｓｏｗｎ　ｏｎｔｏ　ｐｌａｔｅｓ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ
ｕｎｄｅｒ　ａ　１６ｈｄａｉｌｙ　ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ　ａｔ　２４℃．Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ａｓｓｅｓｓｅｄ　ａｔ　ｔｈｅ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｉｎｔｅｒｖａｌｓ．Ａ，Ｂ．Ｉｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ
ｓｅｅｄｓ／ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　１４ｄａｆｔｅｒ　ｈｅａｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｃ，Ｄ．ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｄａｔａ　ｆｒｏｍ　ｔｈｒｅｅ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｍｅａｎ＋ＳＥ，ｎ＝５５．
Ａｌ　ｍｅａｎ　ｖａｌｕｅｓ　ａｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｓｙｔａａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｐ＜０．０５）
６１４
第２期 　　 谢林峰等：拟南芥ＳＹＴＡ基因Ｔ－ＤＮＡ插入纯合突变体的鉴定及表型分析 　
图４　植株幼苗受热激后存活率情况
ｓｙｔａ突变体幼苗没有表现出减弱的基础性耐热和诱导性耐热性质．Ａ，将生长１０ｄ的野生型和ｓｙｔａ突变幼苗置于光照２２℃常
温下４ｈ．Ｂ，将生长１０ｄ的野生型和ｓｙｔａ突变幼苗置于暗处，相对湿度为６０％的环境中，并给予４ｈ４５℃的热激处理．Ｃ，将生长
１０天的野生型和ｓｙｔａ突变幼苗３９℃热激９０ｍｉｎ，经过２ｈ２２℃的恢复后，幼苗被置于４５℃下热激２ｈ，环境与Ｂ中一致．图片为热
激处理后４ｄ苗的图片．
Ｆｉｇ．２　ｌｉｖａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｓｅｅｄｉｎｇｓ　ａｆｔｅｒ　ｈｅａｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｓｙｔａｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｄｏｎ’ｔ　ｅｘｈｉｂｉｔ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｂａｓａｌ　ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ａｎｄ　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ．ａ，Ｔｅｎ－ｄａｙ－ｏｌｄ　Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ，
ｓｙｔａｓｅｅｄｌｉｎｇｓ（ｎｏｒｍａｌ）ｗｅｒｅ　ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ　ｉｎ　ｌｉｇｈｔ　ａｔ　２２℃ｆｏｒ　ｔｈｅ　４－ｈ　ｐｅｒｉｏｄ　ｂ，Ｔｅｎ－ｄａｙ－ｏｌｄ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ，ｓｙｔａｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ
ａ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　４５℃／４ｈｉｎ　ｔｈｅ　ｄａｒｋ　ａｔ　６０％ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｈｕｍｉｄｉｔｙ　ｃ，Ｔｅｎ－ｄａｙ－ｏｌｄ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ，ｓｙｔａｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ａ
ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　３９℃ｆｏｒ　９０ｍｉｎ．Ａｆｔｅｒ　ａ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｐｅｒｉｏｄ　ｏｆ　２ｈａｔ　２２℃，ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｐｏｓｅｄ　ｔｏ　ａ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｏｆ　４５℃ｆｏｒ　２
ｈ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ　ａｂｏｖｅ．Ｉｌｕｓｔｒａｔｅｄ　ａｒｅ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　４ｄａｆｔｅｒ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．
而植物的耐热性在很大程度上取决于依赖于钙离
子的细胞完整性与流动性的维持．现已有大量报
道证实，受到热激后的植物细胞，其胞质内会有
大量钙离子的积累，且钙离子作为一种信号因子，
将启动细胞内一系列生理活动的变化，进而促进
植物的热胁迫耐受性．
如上所诉，因为冷，高盐，高温胁迫会引起植
物细胞相似的生理活动，所以本研究设计了拟南
芥野生型植株与ｓｙｔａ突变体植株的种子和幼苗的
热激实验，以探索ＳＹＴＡ 基因在植株耐热方面的
作用．结果表明，当野生型与突变体种子在受到
热激后，其突变体种子的萌发率与萌发速率显著
下降，而野生型下降不明显，说明ＳＹＴＡ 能显著
提高拟南芥种子的耐热性，推测其作用机制与细
胞耐盐，耐冷的作用机制一致．然而比较有趣的
是，当对拟南芥野生型与ＳＹＴＡ 突变体植株幼苗
进行热激后，野生型与突变体幼苗的存活率与叶
片萎黄率几乎一致．说明ＳＹＴＡ 基因可能只在拟
南芥植株种子萌发阶段参与植株的耐热性活动，
而在植株幼苗期不参与此活动或不表现出耐热特
性．具体原因可能有两点：１．ＳＹＴＡ 基因在植株
种子萌发阶段大量表达而在其幼苗阶段表达量减
少以至于不足以对植株的耐热性造成影响；２．在
拟南芥的幼苗期，有其他与ＳＹＴＡ 功能相似的基
因参与植株的耐热性活动，单纯突变掉ＳＹＴＡ 基
因并不能对植株的耐热性产生影响．当然，其具
体作用机制还需要进一步的研究证明．
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