全 文 ：农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology 2007,15 (5):816~820
*基金项目:国家自然科学基金(No.30300222)和西北农林科技大学优秀人才基金(No.042R009)资助。
**通讯作者。Authorforcorespondence.副教授,主要从事植物分子生物学研究。E-mail:.
收稿日期:2007-01-04 接受日期:2007-07-04
·研究论文·
拟南芥Alpha-dioxygenase2原核表达、纯化及亚细胞定位预测*
张美祥 1,张小梅 1,2,范三红 1**,罗龙海 1,闫晓华 1,郭蔼光 1
(1.西北农林科技大学陕西省农业分子生物学重点实验室,杨凌712100;2.河南科技大学农学院,洛阳471003)
摘要:将拟南芥α-dioxygenase2(DOX2)基因编码区克隆到原核表达载体pGEX-5X-1获得重组表达载体 pGEX-DOX2,转
化至大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)pLysS和 BL21(DE3)-RIPLcodon+菌株中进行诱导表达。SDS-PAGE和 Western
blot结果表明,融合蛋白在 BL21(DE3)-RIPLcodon+中得到了高效表达,融合蛋白表观分子量约为 98kD,占菌体总蛋白的
38%。经GST亲和柱层析进一步纯化获得了可溶性重组蛋白;愈创木酚法测试表明,可溶性重组蛋白不具有过氧化物酶活性。
利用 RarecodonCaltor进行的密码子偏爱性分析显示,该基因读码框中含有 88个大肠杆菌稀有密码子,占总密码子(631个)
的 14%;SignalP、CELLOv.2.5、PSLpred和 Softbery-ProtCompVersion6.1等软件分析结果显示,拟南芥 DOX2可能定位于细
胞质。
关键词 α-DOX2;表达;稀有密码子;亲和纯化;亚细胞定位
中国分类号:S188文献标识码:A 文章标号:1006-1304(2007)05-0816-05
Expression,PurificationandPredictionofSubcelularLocalizationof
Arabidopsisα-dioxygenase2
ZHANGMei-xiang1,ZHANGXiao-mei1,2,FANSan-hong1**,LUOLong-hai1,YANXiao-hua1,GUOAi-guang1
(1.KeyLaboratoryforMolecularBiologyofAgricultureofShaanxiProvince,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,
Yangling712100,China;2.ColegeofAgronomy,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,471003,China)
Abstract:TheencodingsequenceofArabidopsisα-dioxygenase2(DOX2)genewasinsertedintopGEX-5X-1toobtain
pGEX-DOX2.TherecombinantvectorwastransformedintoEscherichia.coliBL21(DE3)pLysSandBL21(DE3)-RIPLcodon+,re-
spectively.Afusionproteinabout98kDwasdetectedbySDS-PAGEandWesternblotintheinducedrecombinantBL21(DE3)-RIPL
codon+strain,anditaccountsfor38%ofthetotalbacterialproteins.ThetargetproteinwaspurifiedbytheGSTchromatographycol-
umn,andtheperoxidaseactivityofthepurifiedproteinwastestedusingtheguaiacolmethod,theresultshowedthatthesolublefusion
proteinhadnodetectableperoxidaseactivity.UsingrarecodonCaltorsoftware,88rarecodonsofE.coliwerefoundintheDOX2
ORF.ThesubcelularlocalizationanalysisresultpredictedbySignalP,CELLOv.2.5,PSLpredandSoftbery-ProtCompVersion6.1
indicatedthattheArabidopsisDOX2locatedincytoplasm.
Keywords:α-dioxygenase2;expression;rarecodons;afinitypurification;subcelularlocalization
α-dioxygenase是脂肪酸 alpha氧化通路的关
键成员,是脂肪酸降解的重要蛋白家族(Hamberget
al.,2002a,b)。vanderBiezenetal.(1996)首次利用转
座子标签法从在番茄中分离到一个新基因,该基因
突变导致生长缓慢、植株矮小柔弱、结实率低等,因
而命名为FEEBLY。Sanzetal.(1998)通过差异显示
技术从烟草中分离到参与细菌诱导的超敏反应过程
的新基因,并命名为 PIOX(pathogen-inducedoxyge-
nase),到目前为止研究者已先后从番茄、烟草、拟南
芥、水稻、小麦等植物中分离到 18个同源基因
(Hambergetal.,2005), 并 将 其 统 一 归 类 为 al-
pha-dioxygenase。
拟南芥中脂肪酸alpha-dioxygenase存在两个拷
贝,根据发现先后顺序分别命名为 alpha-dioxyge-
nase1(DOX1)(PoncedeLeonetal.,2002)和 al-
pha-dioxygenase2(DOX2)(Hambergetal.,2005),它
第5期 张美祥等:拟南芥Alpha-dioxygenase2原核表达、纯化及亚细胞定位预测
们蛋白序列的相似性为71.4%。拟南芥DOX1在蛋
白序列、表达模式与最初的从烟草中分离到的 PI-
OX相似,其表达受病原及抗逆过程诱导(Koeduka
etal.,2005),拟南芥DOX2与最初从番茄中分离到
的FEEBLY的蛋白序列更相似,拟南芥DOX1的研
究已经相当深入,其催化特性及代谢通路已基本阐
明,DOX1可将多种碳原子数为 n的脂肪酸氧化成
少一个碳原子n-1的醛,并且伴有碳原子数为 n的
羟过氧化物和碳原子数为n-1的脂肪酸产生(Ham-
bergetal.,1999)。 alpha-dioxygenase可能与醛脱氢
酶及NAD+一起作用为脂肪酸逐步降解成短链的同
系物提供一个通路(Safertetal.,2000)。目前对拟南
芥 DOX2催化特性及其实现生物学功能的途径还
知之甚少,其是否具有类DOX1的催化特性还有待
证实,至少其生物学效应和表达模式与 DOX1有着
根本的不同。本研究建立了拟南芥DOX2基因的原
核表达和纯化体系,对其亚细胞定位进行了预测。
1 材料和方法
1.1 材料
DOX2基因从 ABRC (ArabidopsisBiological
ResearchCenter)获得 (编号 U16142);pMD18-T
SimpleVector购自Takara公司(大连),pGEX-5X-1
载体和 GSTrap亲和柱为 Amersham公司产品 (美
国);LigationKitVersion2.0、TaqDNA聚合酶和限
制性内切酶购自 Takara公司 (大连);BL21(DE3)
pLysS菌株和抗 GST单抗购自天根公司 (北京),
BL21(DE3)-RIPLcodon+、JM109等菌株为本实验室
保存;1kbplusladder和 PCR产物纯化试剂盒为天
根公司产品(北京),质粒提取试剂盒购自优晶公司;
引物由上海生物工程公司合成,测序由上海英骏公
司完成。
1.2 方法
1.2.1 DOX2基因的扩增及表达载体构建 根据
拟南芥 DOX2基因 cDNA序列全长设计特异上下
游引物,扩增其完整ORF。为方便克隆,上下游引物
分别引入了SmaⅠ和XhoⅠ的酶切位点。
上游引物:5-CATCCCGGGTATGGGTTTCTCTCCATCC-3;
下游引物:5-AACCTCGAGTAGTATCCGACGGCTATG-3。
以含有拟南芥 DOX2cDNA的质粒为模板
(U16142),使用上下游引物扩增DOX2基因编码区。
扩增条件为:94℃预变性 2min,94℃变性 45s,60
℃退火 45s,72℃延伸 2.5min,30个循环,72℃延
伸 5min。 用 1%的琼脂糖电泳检测并回收目的片
段 , 克 隆 入 pMD18-TSimpleVector, 命 名 为
pMD-DOX2,筛选并测序鉴定阳性重组子。用 Sma
Ⅰ和XhoⅠ双酶切pMD-DOX2,胶回收目的片段,
再将其与相同酶消化回收的pGEX-5X-1载体连接,
最后获得重组载体pGEX-DOX2。
1.2.2 DOX2基因的诱导表达 将 pGEX-DOX2
分别导入 BL21 (DE3)pLysS和 BL21(DE3)-RIPL
codon+感受态细胞。挑取单菌落接种于在含 100
mg/L氨苄青霉素的 LB培养基中,37℃,180r/min
过夜培养;以10%的接种量接到同样的培养基中,
扩大培养 4h左右,加入终浓度为 1mmol/L的
IPTG,37℃,诱导表达 4h。12000r/min离心 1min
收获菌体,加入上样 bufer,煮沸 10min,进行
SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色,观察照相。
1.2.3 重组蛋白可溶性分析及 Westernblot分析
诱导后的菌体经超声波破碎,上清和沉淀分别用
10%SDS-PAGE分析,采用软件Bandscan5.0对重
组蛋白进行定量。为了进一步对重组蛋白鉴定,对诱
导菌总蛋白进行 10%SDS-PAGE,电泳后,将蛋白
转移至NC膜。以anti-GST单克隆抗体为一抗 (1∶
500稀释),以 goat-anti-mouse-IgG-AP(1∶500稀释)
为二抗,用AP缓冲液稀释的BCIP-NBT显色,进行
Westernblot分析。
1.2.4 DOX2亲和纯化 按上述1.2.2方法对阳性
克隆进行大量诱导表达后用溶菌酶加超声裂解菌
体,4℃,12000r/min离心30min,分别保留上清和
沉淀。上清部分按照 GSTGeneFusionSystem
Handbook进行纯化,以 10倍柱体积的 PBS平衡
GSTrapFF,流速约 1mL/min,将上清液以 0.5
mL/min流速上柱,上样结束后以 20倍柱体积的
PBS洗柱,以10倍柱体积的洗脱液上柱,分别收集,
SDS-PAGE检测纯化结果。
1.2.5 DOX2过氧化物酶活性分析 将纯化的蛋
白 DOX2按不同浓度(0.1~0.9μg)设 5个梯度,分
别加入到 1mL含 0.2mol/L愈创木酚、0.03mol/L
H2O2和0.1mol/LPBS(pH6.0)的反应溶液中。以不
加H2O2的重组蛋白和愈创木酚的PBS溶液调零进
行比色,观测 470nm下吸光值的变化(Safertetal.,
2000)。阳性对照为辣根过氧化物酶。
1.2.6 DOX2基因的稀有密码子分析及亚细胞定
位的生物信息学预测 利用 RarecodonCaltor对
DOX2进行密码子偏爱性分析。利用 SignalP对
DOX2进行信号肽预测分析,用 CELLOv.2.5、PSL-
pred和 Softbery-ProtCompVersion6.1等软件对
DOX2亚细胞定位进行预测对 DOX2进行亚细胞
定位预测分析。
817
农 业 生 物 技 术 学 报 2007年
2 结果
2.1 pGEX-DOX2融合表达载体的构建
根据拟南芥DOX2cDNA设计编码区扩增上下
游引物,上下游引物中分别包含SmaⅠ和XhoⅠ位
点。PCR扩增获得2kb左右的目标片段(图1,A),
胶回收后直接克隆入pMD18-TSimpleVector,获得
pMD-DOX2。将 DOX2编码区从 pMD-DOX2中切
出并与 pGEX-5X-1载体连接,获得表达载体
pGEX-DOX2。图1,B为pGEX-DOX2XhoⅠ和Sma
Ⅰ双酶切鉴定结果,大片段为载体对应条带,小片段
为目的基因对应条带。
图1.DOX2的PCR扩增和pGEX-DOX2酶切鉴定结果
Fig.1.AmplificationofDOX2byPCRandrestrictionanalysis
oftherecombinantplasmidpGEX-DOX2
A.DOX2的PCR扩增。M,1kbplus分子量;1和2,DOX2扩增结
果。B.pGEX-DOX2酶切鉴定。1、2,pGEX-DOX2的SmaⅠ和
XhoⅠ酶切结果;M,1kbplus分子量对照。
A.AmplificationofDOX2byPCR.M,1kbplusladder;1and2,
DOX2.B.restrictionanalysisoftherecombinantplasmid
pGEX-DOX2;1and2,pGEX-DOX2/SmaⅠ+XhoⅠ;
M,1kbplusladder.
2.2 DOX2基因的诱导表达
重组质粒 pGEX-DOX2分别导入 BL21(DE3)
pLysS和 BL21 (DE3)-RIPLcodon+中进行诱导表
达。SDS-PAGE分析表明(图 2),与对照组相比较,
重组质粒在BL21(DE3)pLysS诱导后没有特异蛋白
条带,而在 BL21(DE3)-RIPLcodon+中观测到约 90
kD的特异蛋白条带,与预期大小98kD相符,如5泳
道。在空质粒对照组中约比31kD略小处有特异蛋白
的表达,这与GST的大小26kD也相符,说明重组蛋
白在BL21(DE3)-RIPLcodon+中得到的表达。
2.3 重组蛋白的可溶性分析和Westernblot鉴定
诱导后的菌体经超声波破菌后,分别收集沉淀
和上清,沉淀和上清分别经10%SDS-PAGE分析,
如图3,A示,不可容样品所在的泳道均出现重组蛋
白的特异条带,而在可溶样品所在泳道几乎观测不
到重组蛋白的特异条带,可以确认重组蛋白主要以
包涵体形式存在。经Bandscan5.0软件分析,表达的
重组蛋白约占大肠杆菌总蛋白的38%。为了进一步
确认目的重组条带,进行了 Westernblot鉴定,实验
结果如图 3,B。重组质粒在 BL21(DE3)-RIPL
codon+中诱导表达的泳道出现了特异的信号这表
明:重组蛋白在 BL21(DE3)-RIPLcodon+中得到了
表达,杂交信号出现不止一条带,随着诱导时间的增
加,出现的非特异性小片段的条带数逐渐增加 (图
3,B)。在对照组中也出现了特异的条带(图3,B),此
为GST与GST单抗特异杂交的信号,表明杂交效果
良好。泳道10未检测到与重组蛋白特异杂交的条带
出现,这表明重组质粒在诱导后的 BL21(DE3)
pLysS中没有表达。
2.4 DOX2亲和纯化
重组子经BL21(DE3)-RIPLcodon+诱导表达,
超声破碎、离心,上清部分经 GSTrap纯化,最终纯
化产物通过SDS-PAGE进行分析,如图示,1、2泳道
检测到重组蛋白,除了在约90kD检测到目标条带
以外,还有一些小片段蛋白存在,Westernblot表明
这些小片段也能和GST单克隆抗体杂交,这些小片
段可能为重组蛋白不同程度的降解产物,这与
Westernblot结果基本一致。
2.5 DOX2的过氧化物酶活性分析
分别将不同浓度的重组蛋白加入到1mL含有
愈创木酚和双氧水的反应液中,没有观测到颜色变
化,用分光光度计测定 470nm光吸收随时间的变
化。结果显示吸光值无明显变化,趋近于零。将0.2
μg对照辣根过氧化物酶加入 1mL反应液,随着时
间的增加,颜色变化由无色变为红色,吸光值变化明
图2.重组DOX2的SDS-PAGE分析
Fig.2.SDS-PAGEanalysisforrecombinantDOX2
1,pGEX-5X-1转化BL21(DE3)pLysS对照组;2和3,pGEX-DOX2
转化BL21(DE3)pLys诱导表达;4和6,pGEX-5X-1转化BL21
(DE3)-RIPLcodon+对照组;5,pGEX-DOX2转化BL21(DE3)-RIPL
codon+诱导表达;M,标准蛋白。
1,BL21(DE3)pLysSwithpGEX-5X-1asacontrol;2and3,expressed
proteinofpGEX-DOX2inBL21(DE3)pLysS;4and6,BL21(DE3)
-RIPLcodon+withpGEX-5X-1asacontrol;5,expressedproteinof
pGEX-DOX2inBL21(DE3)-RIPLcodon+;M,marker.
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第5期 张美祥等:拟南芥Alpha-dioxygenase2原核表达、纯化及亚细胞定位预测
显,逐渐上升,最后趋于稳定。表明纯化的重组蛋白
没有过氧化物酶活性。
2.6 DOX2基因稀有密码子分析和亚细胞定位预
测分析
采用 RarecodonCaltor分析 DOX2稀有密码
子,发现DOX2中存在88个大肠杆菌的稀有密码
子,占总密码子的 14%。还发现该基因中
存在连续的密码子(最多连续 3 个)全部
为稀有密码子。对稀有密码子的数量统计
结果显示,其中 RIPL4 个氨基酸总数达
到 58个,占总密码子的近 10%,如图 5A
所示,下划线部分标示的是稀有密码子,图
5B标示的是各稀有密码子出现频率统计。
用 BL21 (DE3)-RIPLcodon+表达 DOX2
补充了大部分(66%)的稀有密码子,这是 DOX2在
BL21(DE3)-RIPLcodon+中能高效表达,而在 BL21
(DE3)pLysS中几乎观测不到表达的原因。
利用软件 SignalP对 DOX2进行信号肽预测,
分析发现DOX2中不存在明显的定位信号,利用软
件CELLOv.2.5和PSLpred对DOX2进行亚细胞定
图3.重组蛋白的可溶性分析和Westernblot鉴定
Fig.3.SolubilityanalysisofrecombinantproteinandWesternblot
A.重组蛋白的可溶性分析。M,标准蛋白;3、8,裂解液沉淀部分;4、9,裂解液上
清部分;5,pGEX-5X-1转化 BL21(DE3)-RIPLcodon+对照组;6、7,pGEX-DOX2
转化BL21(DE3)-RIPLcodon+诱导表达。B.Westernblot鉴定蛋白表达。1、3、5、7,
BL21(DE3)-RIPLcodon+诱导表达的重组蛋白,分别诱导 19、6、4和 2h;2、4、6、8,
pGEX-5X-1转化BL21(DE3)-RIPLcodon+对照组,分别诱导 19、6、4和 2h;10,重
组质粒在BL21(DE3)pLysS中诱导表达。
A.SolubilityanalysisofrecombinantproteinbySDS-PAGE.M,marker;3and8,
precipitateofthelysate;4and9,supernatantofthelysate;5,pGEX-5X-1inducedby
IPTG;6and7,pGEX-DOX2inducedbyIPTG.B.Westernblot.1,3,5and7,the
recombinantproteininBL21 (DE3)-RIPLcodon+ inducedfor19,6,4and2h,
respectively;2,4,6and8,BL21 (DE3)-RIPLcodon+ withpGEX-5X-1asa
controlinducedfor19,6,4and2h,respectively;10,therecombinantproteininBL21
(DE3)pLysS.
图4.重组蛋白GSTrapFF柱纯化结果
Fig.4.Purificationofrecombinantproteinby
GSTrapFFcolumn
M,标准蛋白;1、2,纯化的重组蛋白。
M,marker;1and2,purifiedrecombinantprotein.
图5.DOX2稀有密码子分析(A)和各稀有密码子出现频率(B)
Fig.5.RarecodonanalysisofDOX2(A)andfrequencyofrarecodonoccurence(B)
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农 业 生 物 技 术 学 报 2007年
参 考 文 献
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位分析,结果提示,DOX2定位于细胞质基质;
Softbery-ProtCompVersion6.1预 测 结 果 显 示
DOX2定位于细胞质基质或内质网。
3 讨论
Liuetal.(2004)等利用pGEX-4T-1载体在大肠
杆菌BL21(DE3)pLysS中实现了DOX2同源基因
DOX1的融合表达。本研究最初试图借用该系统表
达 DOX2,实验结果表明,DOX2在 BL21(DE3)
pLysS中检测不到表达。密码子偏爱性分析结果显
示,DOX2中存在大量大肠杆菌稀有密码子,占总密
码子的14%。因此改用补充大肠杆菌稀有密码子的
表达菌株 BL21(DE3)-RIPLcodon+进行表达,该表
达菌株补充了RIPL4 个氨基的稀有密码子,而这
4种密码子占DOX2总密码子数的10%。实验结果
表明 DOX2重组蛋白在 BL21 (DE3)-RIPLcodon+
中可高效表达,目的占菌体总蛋白的 38%,这为后
续 DOX2的活性测定及多克隆抗体的制备提供技
术平台。
植物 DOX均存在类血红素过氧化物酶结构
域,其是否具有过氧化物酶活性?原核表达的拟南芥
DOX1具有微弱的过氧化物酶活性,而原核表达的
水稻脂肪酸alpha-dioxygenase不具备过氧化物酶活
性(Safertetal.,2000)。本研究定性分析结果显示,
融合的DOX2检测不到过氧化物酶活性。上述结果
可能由多种原因导致:其一,真核蛋白在原核系统中
不能正确折叠,但这种可能性较小,因为 DOX2融
合蛋白具有可溶性且能与亲和柱结合。其二,原核系
统的血红素和真核系统的血红素在结构上有所不
同。其三,具有血红素过氧化物酶结构域并不一定具
有过氧化物酶活性,比如水稻脂肪酸alpha-dioxyge-
nase虽检测不到过氧化物酶活性,但仍具有双加氧
活性。其四,DOX需要其它蛋白与之形成复合体才
能发挥其过氧化物酶活性,比如有研究显示豌豆脂
肪酸alpha-dioxygenase与醛脱氢酶形成复合体。另
外,拟南芥DOX1和DOX2表达模式和突变表型不
同,蛋白序列同源性为71.4%,因而不能因为拟南芥
DOX1具有微弱过氧化物酶活性便推断 DOX2一
定具有过氧化物酶活性。
拟南芥DOX1表达主要受病原和逆境诱导,在
超敏坏死斑周围高丰度表达,DOX2则在种子、果荚
及衰老组织中表达,阐明两者生化活性及生物学功
能的实现过程的异同是一个有趣而艰难的过程,本
研究则是向这一目标迈出的重要一步。
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