全 文 ：第 27卷第 4期 江 西 农 业 大 学 学 报 Vo.l 27, No. 4
2005年 8月 Acta Ag ricu lturae Unive rsitatis Jiangx iensis Aug, 2005
文章编号:1000 - 2286(2005)04 - 0481 -05
笋瓜韧皮部特异性启动子的克隆分析及
新型植物表达载体构建
胡桂兵1, 2 ,张上隆 1* ,徐昌杰 1 ,林顺权 2
(1.浙江大学 果树科学研究所 , 浙江 杭州 310029;2. 华南农业大学 园艺生物技术研究所 , 广东 广州 510642)
摘要:根据已报道具韧皮部组织特异性的笋瓜韧皮部蛋白 2(PP2)基因序列设计引物 , 以山西本地种笋瓜叶片
基因组 DNA为模板 , 用 PCR法扩增得到了长度为 966 bp的 PP2基因启动子片段 ,克隆入 pUCm - T载体后 , 经
鉴定获得了新的重组质粒 pUCm - PSP,测序和序列分析表明与两个已报道的片段分别有 95%和 99%的同源
性 ,推测具有相似的启动子功能。分别用限制性内切酶 P st I和 Bg l II双酶切重组质粒 pUCm - PSP和由
CaMV35S组成型启动子驱动 GFP报告基因的双元植物表达载体 pCAMBIA1302, 分别回收 pUCm - PSP重组质
粒中的 PSP小片段和 pCAM BIA1302植物表达载体中去掉 GFP报告基因上游 C aMV35S组成型启动子的大片
段 ,经连接 、转化和鉴定后 ,构建了由 PSP驱动报告基因 GFP的新型植物表达载体 pHZ03。利用细胞感受态法
将新植物表达载体分别导入根癌农杆菌 EHA105、GV3101、LBA4404和发根农杆菌 Ri15834中 , 为进一步研究
其表达功能奠定了基础。
关键词:笋瓜;韧皮部特异性启动子(PSP);植物表达载体;绿色荧光蛋白(GFP)
中图分类号:Q782;S642. 9　　文献标识码:A
C lon ing and Analysis of the Phloem Spec ific Promoter from
Cucurbita maxima and Construction ofNew P lant Expression Vector
HU Gui - bing
1, 2 , ZHANG Shang - long1* , XU Chang - jie1 , LIN Shun - quan2
　　(1. Fru it Science Institu te o fZhejiang University, H angzhou 310029, China;2. Institu te of B iotechno logy
in Horticultural P lan ts, Guangdong Prov ince, G uangzhou 510642, Ch ina)
　　Abstract:A pair o f p rime rs w as designed acco rding to the sequence of phloem pro tein 2 (PP2), which
show s ph loem - specificity from Cucubita max ima , and a 966bp fragment o f PP2 gene in the promo ter reg ion
w as amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the genom ic DNA o f a loca lC. maxima cv. variety
as the templa te. The fragmen tw as cloned into pUCm -T vector, and a new recombined vecto r named pUCm
- PSP w as ob tained afte r ana ly zed w ith PCR and restriction d igestion. The re sults of sequence ana ly sis indica-
ted tha t this fragment had 95% and 98% homo logy compa red w ith two repo rted p romo te rs, respective ly. This
resu lt suggested that it m igh t have the same function as o ther PSP. A new p lant expre ssion vector named
pHZ03 in w hich the reporter geneGFP is droved by PSP w as constructed after cu tting two vectors pUCm - PSP
and pCAMBIA1302 w ith tw o restriction enzymes Pst I andBgl II, subsequently recovering the sma ll PSP frag-
men t from pUCm - PSP recomb ined vector and the long fragmen t excised C aMV35S promote r in the upper
收稿日期:2005 - 03 - 30
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30100125)、浙江省自然科学基金资助项目(301291)和广东省农业重大专项
资助项目(2002A208020202, 2003A2010202)
作者简介:胡桂兵(1969 -), 男 ,副教授 , 在职博士生。 *通讯作者:张上隆(1935 -),男 ,教授 。
DOI牶牨牥牣牨牫牳牫牰牤j牣j jau牣牪牥牥牭牨牨牥
　江 西 农 业 大 学 学 报 第 27卷
region o fGFP repo rter gene from pCAMB IA1302 plan t expression vector, and then ligation, transfo rmation and
identifica tion. The recomb ined plan t expression vectorw as transferred intoAgrobacterium tum efaciens strains o f
LBA4404, GV 3101, EHA105 and A. rh izogenes strain o f 15834 by using cell competen t method, and the
foundation has been set up for further research w ork in expression and function of this p romo te r.
Key words:Cucurbita maxima;phloem specific promoter (PSP);plant exp ression vector;g reen fluo res-
cence pro tein (GFP)
韧皮部是植物维管组织的一部分 ,由于负责植物体内糖等有机养料从叶到其它组织器官的运输而
成为许多植物病虫害 ,特别是细菌 、真菌和病毒等植物病源和刺吸式昆虫的直接侵害目标 。随着分子生
物学的迅速发展及转基因技术的日趋成熟 ,利用基因工程技术提高植物抗病虫的能力从而培育抗病虫
植物新品种 ,已成为解决问题的重要手段 ,但目前植物基因工程中常用的启动子是黄瓜花叶病毒
(CaMV)35S的组成型表达启动子 ,它控制抗病或抗虫基因在植物体内各部位平均表达 ,难以在受侵害
的靶组织如韧皮部形成较高的作用浓度 ,如果利用韧皮部特异表达启动子 (phloem spec ific promo ter,简
称 PSP)调节目的基因在韧皮部高效特异地表达 ,可能会更经济 、更有效地发挥某些目的基因的作用。
韧皮部蛋白 (ph loem pro tein,简称 PP)是南瓜属植物中表达浓度可高达 110 mg /mL的一种特异蛋
白 。 1992年 , Bostw ick等从笋瓜幼苗 cDNA文库中筛选出编码 PP2一个亚基的 cDNA ,原位杂交发现
PP2mRNA特异性地定位于韧皮部伴胞中 ,免疫细胞化学定位则表明 PP2蛋白分布于伴胞和筛管分子
中 ,是一种独特的结合几丁质的凝集素 ,具有韧皮部组织特异性[ 1] 。 1994年W ang等从西葫芦 cDNA文
库中筛选出一个编码 PP2 cDNA , 该 cDNA编码的蛋白与 Bow stw ick报道的笋瓜 PP2蛋白只有 9个氨基
酸残基的差别 ,二者 cDNA同源性及由 cDNA推导的氨基酸同源性达 96%[ 2] 。同年 , Bostw ick等分析了
南瓜属的几个不同品种 ,发现 PP2由一个小的基因家族(2 ～ 8个基因 )编码 , PP2 mRNA高度保守[ 3] 。
国内近几年对驱动 PP2基因的启动子开展了一些克隆和功能方面的初步研究 [ 4, 5] ,但这些研究均以缺
点较为明显的 GUS基因作为标记基因 ,结果的可靠性有待进一步检验 。
本研究是在前人研究的基础上 ,先利用 PCR克隆技术 ,从山西本地种笋瓜基因组中克隆出了 PP2
基因启动子片段 ,然后用克隆到的 PSP替代含绿色荧光蛋白 (GFP)标记基因的双元植物表达载体
pCAMB IA1302中组成型表达的 CaMV35S启动子 ,获得由 PSP驱动报告基因 GFP的新型植物表达载体
pCAMB IA1302 -PSP(命名为 pHZ03),最后利用细胞感受态法直接将重组的植物表达载体分别导入多
种农杆菌中 ,以期为充分利用 GFP的优点来研究此启动子的功能奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
1. 1. 1　菌种和质粒　大肠杆菌(E scherichia coli)TG1、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA 4404、
EHA105、GV 3101和发根农杆菌 (A. rh izogenes)Ri15834均由本实验室保存;UN IQ - 10柱式 PCR产物纯
化试剂盒 、PCR产物克隆试剂盒和 UN IQ - 10柱式 DNA胶回收试剂盒均购于上海生工生物工程技术服
务有限公司;pCAMB IA1302植物表达载体由美国佛罗里达大学柑桔研究和教育中心 (CREC)郑启发博
士惠赠 。
1. 1. 2　植物材料　山西本地栽培品种笋瓜 (Cucurbitamax ima)种子由浙江大学蔬菜研究所王永勤博士
提供。
1. 1. 3　试剂　PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;TaqDNA聚合酶购自宝生物工程
(大连)有限公司;限制性内切酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　PSP的克隆分析　(1)基因组 DNA的提取:取种子播种后长出的幼叶为试材 ,用改良 CTAB
法 [ 6]提取其基因组 DNA。 (2)引物和 PCR反应体系:参照文献 [ 4]进行。 (3)目的片段重组入质粒载
体:用 UN IQ - 10柱式 PCR产物纯化试剂盒将 PCR产物纯化后与 PCR产物克隆试剂盒中的 pUCm -T
克隆载体连接 ,连接产物转化大肠杆菌 TG 1菌株感受态细胞 ,通过蓝白筛选 、PCR和酶切鉴定获得重组
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第 4期 胡桂兵等:笋瓜韧皮部特异性启动子的克隆分析及新型植物表达载体构建
　　　　图中的样品分别为(从左至右):DL2000 m arker;特异引物 PCR产物;
pUC19对照质粒;pUCm -PSP重组质粒 DNA;pUCm -PSP重组质粒
DNA用 EcoRⅠ和 H ind Ⅲ双酶切产物;pUCm -PSP 重组质粒 DNA用
BamHⅠ和 Hind Ⅲ双酶切产物;pUCm - PSP重组质粒 DNA用 P stⅠ和
BglⅡ双酶切产物
图 1　PCR扩增片段重组入 pUCm -T
F ig. 1　PCR fragment recom bined into pUCm -T vec to r
质粒[ 7] 。 (4)DNA序列测定:委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行。 (5)序列分析:把有关
序列输入 http:/ /www. eb.i ac. uk /clustalw /index. h tm l网站中的检索窗口 ,用 CLUSTALW 软件进行序列
同源性分析 。
1. 2. 2　由 PSP驱动报告基因 GFP的新型植物表达载体构建　将重组质粒 pUCm - PSP和 CaMV35S组
成型启动子驱动 GFP报告基因的 pCAMB IA1302植物表达载体用限制性内切酶 P stI和 Bg lII双酶切 ,琼
脂糖凝胶电泳分离所需片段 , UN IQ - 10柱式 DNA胶回收试剂盒分别回收所需目的片段。利用 PCR产
物克隆试剂盒中的 T4 DNA连接酶将 PSP定向插入到 pCAMB IA1302植物表达载体中 GFP报告基因的
上游。将连接产物转化大肠杆菌 TG1感受态细胞 ,经 PCR、酶切和测序鉴定后 ,获得新型植物表达载
体 。
1. 2. 3　重组植物表达载体转化农杆菌　各取 1管保存的农杆菌 LBA4404、EHA105、GV3101和 Ri15834
菌株感受态细胞 ,加入 1 μg纯化的质粒 DNA ,摇匀后置 -20 ℃冰箱内 30m in,使其结冰;然后取出置于
42 ℃水浴 2 m in,冰上 2 m in,加入 800 μL YEP液体培养基;再在 42 ℃水浴 2m in,离心管侧放于 28 ℃
恒温摇床 , 175 ～ 190 r /m in转速培养 4 ～ 5 h;经 4 500 r /m in离心浓缩至 100 μL,涂布于含 75 mg /L R if、
100mg /L S tr和 100 mg /L Kan的 LB平板上 , 28 ℃培养直至形成单菌落 ,取各个农杆菌单菌落的悬浮
液 ,用预先设计的 PSP、潮霉素磷酸转移酶 (HYG)筛选基因 、GFP标记基因和农杆菌上的附着蛋白
(ChvA)基因等引物经 PCR扩增(扩增产物分别为 982 bp、852 bp、490 bp和 994 bp)后 ,获得可用于遗
传转化研究的农杆菌 。
2　结果与分析
2. 1　PSP的克隆分析
2. 1. 1　 PSP 的克隆 　以改良
CTAB法提取的山西本地种笋瓜
幼叶基因组 DNA为模板 ,用所设
计的一对 5’端引物上含 Hind III
限制性内切酶序列 、3’端引物上
含 BamH I限制性内切酶序列的
引物进行 PCR扩增 ,得到与预计
长度一致的约 1kb的条带 ,将经
纯化的 PCR产物与 pUCm -T载
体连接 ,用连接产物转化大肠杆
菌 TG1菌株感受态细胞 ,在含氨
苄青霉素 、X - ga l和 IPTG的 LB
平板上涂布获得白色菌落 。随机
挑取一些白色单菌落 ,用无菌水
悬浮后 ,用 PSP引物进行 PCR扩
增 ,取扩增为阳性的菌液划板 ,再
挑取长出的单菌落用液体 LB培
养基培养 ,提取质粒 DNA经长度和多种组合的限制性内切酶 (EcoRⅠ和 Hin d Ⅲ、BamHⅠ和 Hin d Ⅲ、
P stⅠ和 Bg lⅡ )双酶切鉴定 ,获得了新的重组质粒 ,命名为 pUCm -PSP(图 1)。
2. 1. 2　PSP的序列及分析　测定重组质粒中插入片段的序列 ,表明所克隆的片段长 966 bp,把此序列
以及已报道的 2个序列[ 1, 4]编成文本文件输入 EMBL的网站 ,用 CLUSTALW软件进行了序列同源性分
析 ,结果表明 ,新克隆的片段与两个已报道的片段分别均有 95%和 99%的同源性 ,差别很小 ,推测新克
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　　　　图中的样品分别为 (从左至右):DL2000 m arker;pUCm - PSP重
组质粒 DNA用 P stⅠ和 Bg lⅡ双酶切产物;pCAMB IA1302载体
DNA用 PstⅠ和 BglⅡ双酶切产物;pHZ03重组载体 DNA用 Pst
Ⅰ和 Bg lⅡ双酶切产物;λDNA /HindⅢ marker
图 2　pHZ03重组植物表达载体酶切检测图
F ig. 2　The new recombined plan t expression vec to r pHZ03 and its orig ina l
vector digested by tw o restric tion enzym es P stⅠ and BglⅡ
隆的片段具有相似的启动子功能。
2. 2　由 PSP驱动报告基因 GFP的新型植物表达载体构建
分别提取重组质粒 pUCm - PSP和由 CaMV35S组成型启动子驱动 GFP报告基因的 pCAMB IA1302
植物表达载体的 DNA ,同样用限制性内切酶 Pst I和 Bg l II双酶切 ,琼脂糖凝胶电泳分离所需片段 ,用
UN IQ - 10柱式 DNA胶回收试剂盒分
别回收所需目的片段。利用 PCR产
物克隆试剂盒中的 T4 DNA连接酶将
回收的目的片段连接 ,使 PSP定向插
入到 pCAMBIA1302植物表达载体中
GFP报告基因的上游 ,然后将连接产
物转化大肠杆菌 TG1感受态细胞 ,经
PCR、酶切和测序鉴定后 , 获得了由
PSP驱动报告基因 GFP的新型植物
表达载体 pCAMB IA1302 - PSP (图
2),我们把它命名为 pHZ03。
2. 3　重组植物表达载体转化农杆菌
用常规 CaC l2法 [ 7]分别制备根癌
农 杆 菌 菌 株 LBA4404、 GV3101、
EHA103和发根农杆菌菌株 R i15834
的感受态细胞 ,提取 pHZ03新型植物
表达载体的 DNA , 利用细胞感受态
法 [ 7]直接将重组的植物表达载体分
别导入 4种农杆菌中 ,在含卡那霉素 、利福平和链霉素的 YEP平板 (对 LBA4404、EHA103和 Ri15834农
杆菌)或含卡那霉素 、利福平和庆大霉素的 YEP平板(对 GV3101农杆菌 )上涂布获得单菌落 。随机挑
取一些单菌落 ,用无菌水悬浮后 ,新植物表达载体上一些基因或启动子的引物进行 PCR扩增 ,取扩增为
阳性的菌液划板 ,获得了 4种含新型植物表达载体的农杆菌。
3　讨　论
绿色荧光蛋白(GFP)是新近发现的一种报告基因 ,从维多利亚生物发光水母中分离出来 , GFP分子
量较小 (27KD),在无需任何辅助因子或底物参与的情况下即可自动发射出荧光 ,比传统的 β -半乳糖
苷酶(GUS)、荧光素酶 ( luc)等报告基因有明显的优越性 ,如可在无需裂解细胞的情况下 ,就能检测活体
组织或细胞的基因表达 ,而且安全无害[ 8] 。因此克隆并构建由 PSP驱动的 GFP报告基因的植物表达载
体可以通过转基因的方法方便地进行 PSP功能鉴定方面的研究。
pCAMB IA1302是一个能同时在大肠杆菌和农杆菌中复制的双元植物表达载体 。在其 T - DNA区 ,
含有潮霉素筛选标记和 mGFP5报告基因 ,可以很方便地筛选转基因植株和快速鉴定外源基因的定位 、
表达情况;在其 T -DNA区外 ,含有 rep和 sta区 ,可以保证质粒即使在非选择性条件下 ,也可以在农杆
菌中稳定存在[ 9] 。 pCAMB IA1302植物表达载体最大的缺点在于其 GFP报告基因是由 CaMV35S组成型
启动子驱动的 ,因而在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达 ,这不但会造成植物能量和养
分的浪费 ,往往还会使某些性状发生改变 ,影响生长发育 。建立由 PSP驱动的 GFP报告基因的新型植
物表达载体 pCAMB IA1302 -PSP,可以驱动 GFP基因在韧皮部特异表达 ,从而可以方便地研究此启动
子在韧皮部表达的效率。
据报道 ,果树上毁灭性及检疫性细菌病害柑桔黄龙病和真菌病害香蕉枯萎病均是通过韧皮部传播
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的 [ 10, 11] ,我们建立含 PSP驱动的 GFP报告基因的新型植物表达载体的目的 ,就是想通过转基因的手段 ,
先把此载体的 T -DNA区导入柑桔和香蕉中并检测 GFP的表达情况 ,一旦得到肯定的结果 ,我们再构
建由 PSP驱动的能抑制或杀灭柑桔黄龙病和香蕉枯萎病的抗性基因的植物表达载体 ,最终获得抗病性
显著增强的抗病新株系 ,这方面的工作我们正在进行之中。
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