全 文 ：农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology 2007,15 (3): 541~542
·研究简报·
小金海棠Fe(Ⅱ)转运蛋白基因在拟南芥突变体中的功能分析
沈迎春,王 忆,孔 瑾,李天忠,许雪峰,韩振海*
(中国农业大学园艺植物研究所,北京100094)
关键词:MxIrt1;拟南芥突变体;功能;缺铁胁迫
中图分类号:S188文献标识码:A 文章编号:1006-1304(2007)03-0541-02
FunctionalAnalysisofFe(Ⅱ)TransporterGeneMxIrt1inArabidopsisMutantirt1-1
SHENYing-chun,WANGYi,KONGJin,LITian-zhong,XUXue-feng,HANZhen-hai*
(InstituteofHorticulturalPlants,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China)
Keywords:MxIrt1;Arabidopsismutantirt1-1;function;ir stress
*通讯作者。Authorforcorrespondence.教授,主要从事果树生理与分子生物学研究。E-mail:.
收稿日期:2006-04-20接受日期:2006-06-05
铁是植物生长发育所必需的微量元素,在植物体的生理
代谢过程中发挥着极为重要的作用 (Thoironetal.,1997)。苹
果是重要的经济作物,缺铁黄化现象较为普遍,严重影响了
苹果的质量和产量。MxIrt1基因是本实验室从苹果铁高效基
因型小金海棠中克隆得到的 Fe(Ⅱ)转运蛋白基因,推测该基
因与苹果对铁的转运吸收有关(戚金亮,2003)。然而 MxIrt1
基因的具体功能尚需进一步研究,本实验构建了 35S::
MxIrt1植物表达载体,转入拟南芥突变体 irt1-1中,转基因植
株在一定程度上恢复了突变体的表型。
1 材料和方法
1.1材料
拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 突变体 Irt1-1,是采用
T-DNA插入方法筛选到的Irt1基因突变体,该植株在缺铁条
件下表现出严重的失绿症和生长缺陷,甚至致死。植物表达
载体pCWIrt为本实验室保存。
1.2拟南芥的转化及转基因植株的鉴定
通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化拟南
芥,种子收获后,在 MS培养基(30mg/L潮霉素,50mg/L氨
苄青霉素)上进行筛选。根据MxIrt1基因序列设计引物对筛
选得到的阳性植株进行PCR扩增。PCR检测为阳性的植株,
基因组 DNA经 EcoRⅠ消化,MxIrt1cDNA一段 500bp片段
用 α-32P-dCTP标记作探针,进行Southern杂交。
1.3转基因植株耐缺铁能力的初步鉴定
选取经分子鉴定的转基因株系,以野生型、突变体拟南
芥为对照,待植株长至 4~6片叶时,移入附加 0、5和 50
μmol/LEDTA-Fe的1/2MS培养基中进行处理,观察记录植
株形态的变化。
2 结果和分析
2.1转MxIrt1基因拟南芥植株的获得及分子检测
以转基因植株叶片的总 DNA为模板,进行 PCR扩增,
得到 1.1kb的特异性扩增条带,而未转化的植株中未产生该
片段。取PCR阳性植株做Southern杂交,结果如图1,未转基
因植株无条带出现,而被检测转基因植株均有杂交带出现,
说明MxIrt1基因已整合到拟南芥突变体irt1-1中。
图1.转MxIrt1基因拟南芥的Southern检测
Fig.1.Southernblotinganalysesoftransgenicplants
1,质粒DNA;2~6,转基因株系;7,未转基因植株。
1,plasmidDNA;2~6,transgenicplants;7, on-tran genicplant.
2.2转基因植株耐缺铁能力的初步鉴定
将拟南芥植株移入1/2MS培养基上进行处理。4d后,0
μmol/LFe处理的突变体irt1-1植株幼叶开始出现黄化,其它
农 业 生 物 技 术 学 报 2007年
植株生长正常。6d后50μmol/LFe处理下,各植株生长正常
(图2) ,5和0μmol/LFe,野生型和突变体以及转基因植株均
出现一定的黄化;5μmol/LFe处理下植株的黄化程度低于 0
μmol/LFe,黄化程度由高到低依次为突变体、转基因植株、野
生型;特别在 0μmol/LFe处理下突变体幼叶已经开始白化,
而野生型植株仅仅在新叶上开始出现黄化,转基因植株黄化
程度介于二者之间。表明,转基因植株在一定程度上恢复了
突变体缺铁失绿的表型。
3 讨论
MxIrt1基因是果树上克隆出的第一个 Fe(Ⅱ)的转运蛋
白基因,与拟南芥AtIrt1基因具有63%的同源性。AtIrt1能使
不能吸收铁的酵母双突变体 fet3fet4在缺铁胁迫下恢复生
长,而且 AtIrt1基因突变体 irt1-1在缺铁条件下表现出严重
的失绿症,甚至致死,表明 AtIrt1对于拟南芥缺铁胁迫下铁
的吸收是必须的。本实验结果表明,在缺铁和低铁胁迫条件
下,转基因植株在一定程度上恢复了突变体 irt1-1缺铁失绿
的表型。这一结果与Vertetal.(2002)将AtIrt1转入 irt1-1中
进行功能研究的结果一致。说明MxIrt1具有与拟南芥Irt1基
因类似的功能,有铁转运吸收的作用。另外,供给充足的外源
铁也能够恢复突变体失绿的表型,这表明可能存在另外尚未
证明的低亲合力的铁吸收转运机制,这与 Claudio et al.
(2002)的研究结果一致。
参 考 文 献
Claudio Varotto, Daniela M, Paolo P, et al. The metal ion transporter
IRT1 is necessary for iron homeostasis and efficient photosynthesis
inArabidopsisthiliana(J).PlantJournal,2002,31(5):589~599
QiJL(戚金亮). Biotechnologyresearch ofiron-efficient genotypein
theGenus Malus—Cloning of MxNramp1 and MxIrt1 . phD thesis,
ChinaAgriculturalUniversity,2003.(inChinese)
Thoiron S, Pascal N and Briat J F. Impact of iron deficiency and iron
Fe-suppyduringtheea lystagesofvegetativedevelopment in maize
(ZeamaysL.)(J).PlantCellandEnvironment,1997,20:1051~1060
Vert G, Grotz N Dedaldechamp F, et al. IRT1, an Arabidopsis trans-
porteressentialforironuptakefromthesoilandforplantgrowth(J).
PlantCell,2002,14(6):1223~1233
图2.转基因植株和对照植株耐缺铁能力的表型分析
Fig.2.Transgenicplantsandcontrolplanttreatedwithdifferentconcentrationsofiron
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