全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (3): 318–326, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.03.003

——————————————————
收稿日期: 2009-04-08; 接受日期: 2009-11-30
基金项目: 国家自然科学基金(No.30670124)、教育部新世纪优秀人才支持计划(No.NCET-06-0897)和甘肃省自然科学基金(No.3ZS061-
A25-062)
* 通讯作者。E-mail: housw@lzu.edu.cn
拟南芥中两个可能的SDD1新等位基因的鉴定与分析
梁凯, 钱平平, 程曦, 秦倩倩, 贾瑞玲, 张彦萍, 侯岁稳*
兰州大学生命科学学院, 兰州 730000
摘要 SDD1是气孔发育过程中的关键调控基因, 编码一个类枯草杆菌(Bacillus subtilis)蛋白酶的丝氨酸蛋白酶。从EMS诱
变的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中筛选到2株类似sdd1-1的气孔密度突变体, 即e281和g204。其气孔密度和指数均比野
生型增加约1.5倍, 气孔成簇。遗传分析和基因测序证实它们是2个不同的SDD1新等位基因, 其突变分别导致了底物结合位
点N区域和催化三联体之一——S区域的氨基酸变化, 分别为S变成T及S变为F。形态学和生理学研究表明, SDD1基因不同
位点发生突变可导致不同的生物学效应; 而且SDD1等位基因间存在拮抗作用, 其可能属于基因转应作用中的负效应。
关键词 等位基因, 拟南芥突变体, SDD1, 气孔密度, 基因转应
梁凯, 钱平平, 程曦, 秦倩倩, 贾瑞玲, 张彦萍, 侯岁稳 (2010). 拟南芥中两个可能的SDD1新等位基因的鉴定与分析. 植
物学报 45, 318–326.
SDD1基因是气孔发育过程中的负调控因子, 编
码一个类枯草杆菌(Bacillus subtilis)蛋白酶的丝氨酸
蛋白酶。它在拟分生组织母细胞和保卫细胞母细胞中
强烈表达, 主要调节进入气孔发生途径中的表皮原细
胞数目; 保证拟分生组织母细胞必须经过3次不对称
分裂后才能形成气孔; 调控更高级别气孔的定位以及
临近细胞不等分裂的定位和次数(Groll et al., 2002)。
缺少SDD1基因, 将会导致进入气孔发生途径的表皮
原细胞数目大量增加, 产生很多拟分生组织细胞, 加
强更高级别气孔复合体的形成。与tmm突变体相比,
sdd1中具有较正常的气孔分布格局和较少的气孔簇,
即SDD1基因对限制气孔密度来说更加重要(Larkin
et al., 1997; Shpak et al., 2005)。枯草杆菌蛋白酶分
为2类: 一类为降解型, 主要在原核生物中表达, 引
起外源蛋白的降解; 另一类为加工型, 主要在真核生
物中表达, 通过引导肽运送到细胞质内作为前原蛋白
表达(Berger and Altmann, 2000; Groll et al., 2002)。
作为加工酶, SDD1可能激活一个蛋白质信号分子或
一个相应的受体, 介导气孔发育过程中表皮细胞间的
联系。植物气孔的分布主要通过胞内信号途径调控,
涉及多个受体类型和1个MAPK磷酸化级联反应
(Berger and Altmann, 2000)。目前, 尽管对这个模式
已经研究得很多, 但气孔发育和形态发生过程中的某
些关键基因仍然未知, SDD1可为进一步完善气孔发
育过程中的信号通路提供可能的补充 (Nadeau,
2009)。因此, 对在气孔世系中表达的基因进行遗传
筛查和基因组分析, 或是发现对气孔分布和密度有影
响的等位基因均具有重要意义。
Buessis等(2006)发现 , 在超表达SDD1基因的
拟南芥(Arabidopsis thaliana)中 , 气孔密度减少了
40%, 并且在高光强度下, 光合作用明显降低, 表明
气孔密度与光合作用呈正相关。结合种内种间生存竞
争的实验结果(Cahill et al., 2005), 可以看出有关
SDD1基因的研究将更多侧重于对sdd1突变体和超
表达植株生理水平之间的各种差异进行分析, 以及在
经济作物中对SDD1基因进行表达调控的改造和应用
(如RNAi等)。Rautengarten等(2005)利用生物信息学
软件计算, 把拟南芥枯草杆菌蛋白酶家族的基因进行
了系统聚类, 进而预测了所含的56个基因的功能联
系。最终确定该家族有3个主要功能, 即控制发育、
负责蛋白的转换以及作为信号级联反应中的下游元
件。然而在拟南芥中, 迄今为止仅发现SDD1在气孔
·研究报告·
梁凯等: 拟南芥中两个可能的 SDD1 新等位基因的鉴定与分析 319
发育过程中具有关键的调控作用, 因此有必要深入研
究其在生理过程中的更多其它重要功能。
基因转应作用(transvection)是基因表达的一种
方式, 这种方式由等位基因配对及其相互作用所介
导, 可产生正负2种效应(陈吉龙等, 1998)。基因转应
作用已在果蝇(Drosophila melanogaster)的多种基因
(如yellow、brown、eyes absent和Scr等)中发现, 这
种作用所产生的效应直接影响基因在发育过程中的
表达与调节(Leiserson et al., 1994; Matzke and Mat-
zke, 1995)。其它物种中也发现了类似的现象, 例如,
真菌中的基因转应效应、植物中的基因沉默(gene
silencing)以及小鼠中的基因转激活作用(transactiva-
tion)等(Aramayo and Metzenberg, 1996; Sun et al.,
1997)。阐明基因转应作用的机理, 将有助于了解基
因表达调节及增强子调控活动的分子基础(Matzke
and Matzke, 1995), 同时也可表明研究已知基因的
等位基因具有较大的价值。在拟南芥的气孔发育过程
中, 这种等位基因之间的相互作用尚未见报道。
利用气孔突变体来研究气孔发育及其分子机制
已有不少成功的范例。突变体分析不仅可以对某一复
杂的生物学过程提出合理的假设, 而且可进一步精确
找出研究生理和发育问题的新方法 (侯仙慧等 ,
2009)。本实验通过筛选EMS诱变的拟南芥鉴定了2
个SDD1新等位基因, 并做了进一步的遗传分析和基
因定位, 对SDD1在各种生理过程中的作用进行了初
步探讨。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验材料为野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)
Columbia(Col-0)生态型及sdd1-1和sdd1-2突变体 ;
S4为Col-0背景, 保卫细胞中有特异性GFP标记(Hou
et al., 2006)。
1.2 方法
1.2.1 诱变与培养
以拟南芥S4种子为材料, 使用0.18% EMS进行诱变。
处理后的种子(M1)经表面消毒后点播在MS培养基
上, 4°C、黑暗条件下春化处理2天; 然后放入光照培
养箱中, 光照时间为每天16小时; 光照强度为300–
400 µmol·m–2·s–1; 温度为22°C; 相对湿度为75%–
80%。培养15天后, 把已经长出子叶的幼苗移栽到培
养土中; 将苗盘置于人工气候室中继续培养, 条件同
上。采收M2代种子, M2代筛选群体的培养同M1代。

1.2.2 突变体的筛选与形态观察
M2代幼苗生长至4–6片真叶时, 采用牙齿合成树脂
印迹技术观察不同器官表面的气孔分布(Kagan et
al., 1992)。以气孔密度(气孔密度=气孔数/mm2)和气
孔指数(气孔指数=气孔数/(气孔数+表皮细胞数))表示
气孔的分布频率。筛选出气孔分布频率有明显差异的
植株作为潜在突变体, 将其从群体中移出单独培养,
单株收种子。然后以S4为轮回亲本, 连续进行4代回
交, 选择具有突变体表型的植株作为近等基因系进行
遗传和生理分析。

1.2.3 叶片结构的观察
叶片在FAA固定液中固定24小时后, 进行脱水、透
蜡、包埋和切片(郑国锠, 1978)。采用常规石蜡切片
制片法, 切片厚度为10 µm, 用0.1%番红-固绿对染,
封片后在Moticam2206数码成像系统下观察并拍照。

1.2.4 突变位点的测定
根据拟南芥SDD1基因序列设计3对引物, 对突变体
的SDD1序列进行扩增(表1)。PCR产物连接到T载体
上, 选择阳性克隆测序。利用国家生物技术信息数据
库(National Center for Biotechnology Information,
NCBI)进行序列分析, 确定基因突变位点。

1.2.5 气孔对外源ABA的反应
生长1个月后 , 摘取叶龄相当的莲座叶片打碎 , 在
MES缓冲液中温育, 光照下进行前处理2小时, 使气
孔张开。然后把打碎的叶片放入含有不同浓度脱落酸
(abscisic acid, ABA)的MES缓冲液中, 置于20°C、光
照下处理2.5小时。在Moticam2206数码成像系统下
测定气孔的长度和宽度。以宽度与长度的比值作为气
孔对ABA敏感度的标志, 在同一浓度ABA处理下, 二
者比值越大, 气孔对ABA的敏感度越小。每个浓度随
机选取30个视野, 每个处理重复3次。

320 植物学报 45(3) 2010
表1 扩增SDD1基因的引物序列及反应条件
Table 1 Primer sequences and PCR conditions for amplification of SDD1 gene
Primers Sequence Conditions of PCR
01 fwd
rev
5’-GGAACCCAAACCTTTCTTTC-3’
5’-GGAAAGCGAAAGAACATCG-3’
94°C 5 min; 94°C 45 s, 54°C 45 s, 72°C 1 min; 72°C 10
min
02 fwd
rev
5’-CTCCTGGAGCTCACATTG-3’
5’-GATATTGACTCCCGGAGC-3’
94°C 5 min; 94°C 45 s, 52°C 45 s, 72°C 1 min; 72°C 10
min
03 fwd
rev
5’-CACGGTGAAACCAAAGGC-3’
5’-CAGTTAGTCTTCAAGGTTAC-3’
94°C 5 min; 94°C 45 s, 54°C 45 s, 72°C 1 min; 72°C 10
min
fwd: 正向引物; rev: 反向引物 fwd: Forward primer; rev: Reverse primer





图1 拟南芥突变体e281和g204的形态结构
(A) e281和g204的整体植株表型, 种子萌发后40天(Bar=2 cm); (B), (C) e281 (B)和g204 (C)的激光共聚焦显微成像, 绿色为保卫细
胞特异性表达荧光, 细胞轮廓以碘化丙啶标记(红色)(Bar=10 µm); (D)–(G) 野生型(D)、e281 (E)、g204 (F)与sdd1-1 (G)的真叶横
切面(Bar=50 µm); (H)–(K) 野生型(H)、e281 (I)、g204 (J)与sdd1-1 (K)的微分干涉相差显微成像(differential interference contrast,
DIC)(Bar= 50 µm); (L), (M) 正常气孔(L)和成簇气孔(M)的扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)照片(Bar=10 µm)。
WT: 野生型。箭头示成簇气孔。

Figure 1 Morphological characters of e281 and g204 mutants of Arabidopsis thaliana
(A) The general habitus of e281 and g204, 40 d (after germination) (Bar=2 cm); (B), (C) Confocal images of GFP specific ex-
pression (green) in guard cells of the primary leaf in e281 (B) and g204 (C), cell outlines were counterstained with propidine
iodide (red) (Bar=10 µm); (D)–(G) Cross sections of the primary leaf in wild type (D), e281 (E), g204 (F) and sdd1-1 (G) (Bar= 50
µm); (H)–(K) Differential interference contrast (DIC) images of the abaxial epidermis of the primary leaf in wild type (H), e281(I),
g204 (J) and sdd1-1 (K) (Bar= 50 µm); (L), (M) Scanning electron microscopy (SEM) images of normal stomata (L) and
clustered stomata (M) (Bar=10 µm).
WT: Wild type. Clustered stomata are indicated by arrows.


1.2.6 离体叶片的水分散失实验
生长1个月后, 摘取6枚叶龄相当的莲座叶片, 放入光
照培养箱中, 在22°C、光照下, 分别间隔15、30、45、
60、80、100、120、150和180分钟称重, 每个处理
重复3次。根据以下公式计算水分散失的百分比: 失
水率=(最初叶片重量–T时间之后的叶片重量)/最初叶
片重量×100%。

1.2.7 侧根数和根长的测量
种子经过表面消毒后播种于MS培养基上, 春化处理
梁凯等: 拟南芥中两个可能的 SDD1 新等位基因的鉴定与分析 321
后移至光照培养箱中。光照时间为每天12小时, 其它
条件同1.2.1节所述。培养3天后, 用佳能A650数码相
机拍照, 每隔2天拍照1次, 共3次。使用Motic Images
Advanced 3.2图像软件测量根长。光照下生长10天
后, 在体视镜下进行实体解剖, 并统计侧根数目。
2 结果与讨论
通过对约2 000株M2代植株叶片上的气孔和表皮细
胞的形态观察及气孔参数的统计分析, 筛选到2个气
孔密度突变体: 即e281和g204。这两个突变体整体形
态正常, 但气孔密度和指数明显增大, 并且出现气孔
成簇现象, 双成簇尤为普遍(图1B, C, L, M)。这种表
型与已知的 sdd1-1突变体表型相似 (Berger and
Altmann, 2000), 故将sdd1-1和野生型同时作为对
照, 与e281和g204两个突变体做形态特征比较和遗
传鉴定分析。
2.1 突变体的形态结构
图1A显示, e281和g204与野生型植株的生长发育程
度基本一致。与野生型相比, 突变体的形态, 如莲座
叶的轮数、叶片数、茎节数、花葶长、叶长和叶宽等,
均没有明显差异。对其叶片横切面石蜡切片的观察发
现, 叶片内部结构、细胞大小和数目等也没有发生明
显的变化(图1D–G)。
2.2 突变体的遗传分析
以野生型为母本, e281和g204突变体分别为父本, F1


表2 拟南芥突变体e281和g204的遗传分析
Table 2 Genetic analysis of e281 and g204 mutants of
Arabidopsis thaliana


图2 e281遗传互补实验中F1代真叶的气孔密度与成簇情况
(A) 真叶表皮背面的气孔密度(萌发后50天); (B) 成簇气孔百分
比(萌发后50天)。数据为平均值±标准误(n=6)。与野生型(WT)
对比, * P<0.05, ** P<0.01。1: 野生型; 2: sdd1-1; 3: sdd1-2; 4:
♀sdd1-1 ×♂e281; 5:♀sdd1-2 ×♂e281; 6: e281

Figure 2 Stomata density and percentage of clustered
stomata in the primary leaf of F1 progeny in the genetic com-
plementation of e281
(A) Stomata density in the abaxial epidermis of the primary
leaf (50 d after germination); (B) Percentage of clustered
stomata in the abaxial epidermis of the primary leaf (50 d
after germination). Values were the means ± SE (n=6).
Compared with wild type (WT), * P<0.05, ** P<0.01. 1: Wild
type; 2: sdd1-1; 3: sdd1-2; 4:♀sdd1-1 ×♂e281; 5:♀sdd1-2 ×
♂e281; 6: e281.


代真叶的气孔密度和指数均与野生型相近, 且没有出
现成簇情况。F1代自交后得到的F2代植株气孔表型产
生了分离 , 气孔正常和异常的植株分离比约为3:1
(表2), 说明e281和g204发生了隐性单基因突变。
由于二者与sdd1-1突变体表型相似, 为验证它
们是否在SDD1基因上发生了突变, 将e281和g204
分别与sdd1-1和sdd1-2做互补实验(表2)。在两者正
交与反交的F1代植株中, 真叶成簇气孔比例和气孔密
度均低于父、母本, 但比野生型高(图2), 说明二者与
SDD1基因之间存在必然的联系, 或许它们为等位基
因, 与sdd1-1和sdd1-2存在拮抗作用, 可能属于基因
转应作用中的负效应(Leiserson et al., 1994)。因此可
Cross Number of plants
Pollen
plant
Maternal
plant
Gen-
eration
Total
plants Normal
stomata
Abnormal
stomata
X2 0.95
F1 63 63 0 –
e281 WT
F2 185 138 47 0.99 (3:1)
F1 76 76 0 –
g204 WT
F2 213 161 52 0.98 (3:1)
e281 sdd1-1 F1 28 0 28 –
sdd1-1 e281 F1 31 0 31 –
g204 sdd1-1 F1 35 0 35 –
sdd1-1 g204 F1 27 0 27 –
322 植物学报 45(3) 2010
以SDD1等位基因突变体为材料进一步研究基因转应
的机理。当然, 由于突变体e281和g204没有经过图位
克隆验证, 故还存在有其它类似功能基因的可能性,
需要进一步研究。
2.3 突变位点的确定与分析
2.3.1 突变基因位点的确定
将3对引物的测序结果分别在NCBI数据库中与SDD1
序列进行比对, 之后将3段测序结果(序列)进行拼接,
最终确定e281和g204在SDD1基因上的突变位点分
别为基因编码区域自起始密码子开始的第949和第
1 661位碱基 , 分别发生了T→C和C→T碱基转换
(图3A)。

2.3.2 突变基因编码氨基酸的序列分析
枯草杆菌蛋白酶具有催化三联体区, 即D区域、H区域
和S区域(接触反应中心)。这3个区域高度保守。第4
个保守区域是底物结合位点(N区域), 其中心带有稳
定的天冬酰胺残基(Berger and Altmann, 2000; Ber-
gmann and Sack, 2007)。sdd1-1的基因突变导致蛋
白翻译在第492位氨基酸残基处提前终止, 属于功能
缺失突变。而e281的基因突变导致了底物结合位点N
区域附近的氨基酸变化(S变为T)。g204的基因突变导
致了催化三联体之一——S 区域附近的氨基酸变化
(S变为F), 即e281和g204突变只引起了SDD1蛋白
一级结构中个别氨基酸残基的变化, 突变位点前后的
氨基酸序列并没发生改变, 故可能只引起酶活性的降
低或部分丧失(图3B)。
2.4 突变体的气孔密度和气孔指数
真叶中, 野生型的气孔密度和指数一般分别为200–
350个·mm–2和0.23–0.29, 而e281和g204突变体则
分别为360–570个·mm–2和0.28–0.37, 与野生型相比
增高了约1.5倍(图4A, B)。说明基因突变导致了新的
不等分裂发生(极有可能是第2、3次不等分裂的变化
所致), 也可能是增加了第4次不等分裂(这在野生型
中是不存在的), 从而产生了更多的气孔细胞系, 引
起气孔密度增加; 而气孔指数的升高可能是由于突变
体中几乎所有的表皮细胞均至少与一个保卫细胞相
连, 在野生型中这个比例不到50%(Groll et al., 2002)。


图3 拟南芥突变体e281和g204中SDD1的基因结构和氨基酸序列分析
(A) SDD1的基因结构 DNA序列内没有内含子, 箭头示突变位点; (B) SDD1的氨基酸序列分析 条纹方块表示推测用于ER吸收的
信号序列; 带斑点方框里的序列代表预测的蛋白质前区域, 其剪切需要该蛋白水解活性的激活; 催化三联体的保守氨基酸(D、H和S
区域)和底物结合位点的核心区域(N domain)出现在所有已知枯草杆菌素中, 用黑体字表示; 下划线表示推测的糖基化位点; 星号表
示sdd1-1的基因突变引起的蛋白质翻译提前终止; 三角形表示e281的基因突变引起的S到T变化; 菱形表示g204的基因突变引起的
S到F变化。

Figure 3 Gene structure and amino acid sequence analysis of SDD1 in e281 and g204 mutants of Arabidopsis thaliana
(A) Gene structure of SDD1 No intron was detected in the DNA sequence of SDD1 and arrowheads represent mutation sites;
(B) Amino acid sequence analysis of SDD1 The putative (amino-terminal) signal sequence for ER uptake is marked by a box
with the stripe; The sequence within the spotted box represents the predicted prodomain of the protein, cleavage of which is
probably required for activation of the proteolytic activity of the protein; The invariant amino acids in the catalytic triade (D, H, and
S domains) and the core region of the substrate binding site (N domain), which are present in all known subtilases, are printed in
boldface type; Putative glycosylation sites are underlined; The site of the premature stop caused by the sdd1-1 mutation is
marked with an asterisk; The site of S to T caused by the e281 mutation is marked with a triangle; The site of S to F caused by
the g204 mutation is marked with a diamond.
梁凯等: 拟南芥中两个可能的 SDD1 新等位基因的鉴定与分析 323


图4 拟南芥突变体e281和g204叶片的气孔密度和成簇情况
(A), (B)真叶表皮背面的气孔密度和指数; (C), (D)子叶表皮背面的气孔密度和指数; (E)真叶表皮背面的成簇气孔百分比; (F)真叶表
皮背面的成簇气孔密度。数据为平均值±标准误(n=6)。WT: 野生型

Figure 4 Stomata density and clustered stomata in the leaves of e281 and g204 mutants of Arabidopsis thaliana
(A), (B) Stomata density and index in the abaxial epidermis of the primary leaf; (C), (D) Stomata density and index in the abaxial
epidermis of the cotyledon; (E) Percentage of clustered stomata in the abaxial epidermis of the primary leaf; (F) Clustered sto-
mata density in the abaxial epidermis of the primary leaf. Values were the means±SE (n=6). WT: Wild type


子叶中, e281和g204突变体的气孔密度和指数也比
野 生 型 高 1.5–2 倍 ( 图 4C, D) 。 这 与 Berger 和
Altmann(2000)观测到的sdd1-1子叶气孔密度与野生
型接近有所不同, 可能是由于SDD1基因不同位点发
生突变所致。
从真叶气孔成簇情况看, e281和g204突变体主
要出现双成簇现象(图1H–K), 说明二者在气孔发育
过程中, 对不等分裂控制不严格, 但其成簇比例远远
小于已知突变体sdd1-2和sdd1-1(图4E, F)。图4E显
示, sdd1-1和sdd1-2的气孔成簇比例分别高达3%和
6%, 而在e281和g204中则仅为1%。但就成簇气孔的
比例和密度来看, e281和g204与sdd1-1的差距类似
于sdd1-1与sdd1-2的差距, 如sdd1-1真叶中的成簇
气孔比例约为e281和g204的2.5倍, 而sdd1-2也约为
sdd1-1的2.5倍。结合上述在气孔密度和指数方面存
在的类似情况(差距约为1.5倍), 推测SDD1基因不同
324 植物学报 45(3) 2010
位点发生突变产生的效应可能是有差别的。
与野生型相比, e281和g204不同器官中的气孔
密度变化也不同(表3)。其中果荚和茎上的气孔密度与
野生型没有明显区别, 而花梗和萼片上则比野生型增
加了1.5–2倍。这提示我们须进一步检测气孔参数的
器官差异性是否与SDD1基因的表达强度相关。
2.5 突变体气孔对外源ABA的反应
外源ABA可引起保卫细胞中的钾离子外渗, 细胞失水
收缩导致气孔关闭, 蒸腾作用降低, 这是ABA最重
要的生理效应之一 (Mac-Robbie, 1998; 权宏等 ,
2003)。在一定浓度范围内, 随着ABA浓度的升高, 野
生型和突变体的气孔开度均逐渐变小(图5)。在不同浓


表3 拟南芥突变体e281和g204不同器官表皮上的气孔密度
Table 3 Stomata density in the epidermis of different organs
in e281 and g204 mutants of Arabidopsis thaliana
Organ WT sdd1-1 sdd1-2 e281 g204
Stem 150±8 247±4** 284±17** 149±2 175±6
Pedicel 49±7 128±14** 226±8** 93±9** 134±16**
Silique 165±7 325±6** 401±15** 150±3 186±17
Sepal 229±8 417±9** 473±25** 334±6** 337±25**
数据为平均值±标准误(n=6)。与野生型(WT)对比, ** P<0.01。
Values were the means±SE (n=6)。Compared with wild type
(WT), ** P<0.01.




图5 拟南芥突变体e281和g204气孔对外源脱落酸的反应
数据为平均值±标准误(n=90)。WT: 野生型

Figure 5 The response of stomata to exogenous ABA in
e281 and g204 mutants of Arabidopsis thaliana
Values were the means±SE (n=90). WT: Wild type
度的ABA处理下, 各突变体对于ABA的敏感度比野生
型均略低; 同时不同浓度ABA各处理之间也存在差
别, 在较高浓度的ABA处理下这种差别更加明显。例
如在0.1 μmol·L–1ABA处理下, g204对ABA的敏感度
与野生型的差距为0.04; 而在100 μmol·L–1ABA处理
下, 二者的差距则为0.07(图5)。
植物对逆境胁迫的响应过程涉及许多调节气孔
发育的基因, 例如Serna和Fenoll(1997)发现在密闭
条件下培养的拟南芥发育出了气孔簇, 这可能与ABA
和乙烯等逆境激素的浓度升高有关。因此 , 认为
SDD1基因的表达影响气孔对外源ABA的反应, 其不
同位点发生突变引起所编码丝氨酸蛋白酶的活性变
化, 从而导致各等位基因突变体的气孔对ABA反应存
在差异。在ABA信号通路中也存在类似情况, 如ABI3
和ABI4是ABI5的等位基因, 而且abi4和abi5突变体
与abi3具有相似的表型, 但不如abi3突变体的表型变
化明显(王伟青和程红焱, 2006)。
2.6 突变体离体叶片的水分散失
植物叶片在离体后的几个小时内能够通过关闭气孔
来限制水分散失, 反映了气孔的相关功能。在相同培
养条件下, sdd1-1、sdd1-2和g204离体叶片失水程度
明显高于野生型, 这可能由于突变体的最佳气孔分布
模式被打破, 导致植物叶片在利用气孔控制蒸腾作用
时出现障碍; 而e281离体叶片的失水程度仅略高于
野生型(图6), 说明SDD1基因不同位点发生突变可能


图6 拟南芥突变体e281和g204离体叶片的水分散失
数据为平均值±标准误(n=9)。WT: 野生型

Figure 6 Water loss of leaves detached in e281 and g204
mutants of Arabidopsis thaliana
Values were the means ± SE (n=9). WT: Wild type
梁凯等: 拟南芥中两个可能的 SDD1 新等位基因的鉴定与分析 325


图7 拟南芥突变体e281和g204的主根长度(A)和侧根数目(B)
数据为平均值±标准误(n=30)。WT: 野生型

Figure 7 The root length (A) and lateral root number (B) of
e281 and g204 mutants of Arabidopsis thaliana
Values were the means±SE (n=30). WT: Wild type

对于蒸腾作用的影响不同。Chaerle等 (2005)报道
sdd1-1突变体气孔密度的增加和气孔分布模式的稳
定遗传, 使干旱等逆境中植物的水分利用效率大幅度
提高成为可能。而e281在气孔密度升高且成簇的情况
下, 同比减少了水分的散失, 这对于提高作物产量和
增强抗旱能力具有重要的借鉴意义。
2.7 突变体幼根的发育
在相同培养条件下, sdd1-1、e281和g204组培苗的幼
根长度均比野生型短2–3 mm, 侧根数目比野生型少
2–3个, 突变体幼根参数之间的关系为: e281＞g204＞
sdd1-1 (图7)。说明SDD1基因不仅作用于气孔的发
育, 它编码的丝氨酸蛋白酶广泛地表达, 可能也为根
的正常发育所必需。Hamilton等(2003)证明与SDD1
聚类在一起的Ara12酶是侧根发育和木质部形成所必
需的, 推测SDD1可能是通过Ara12酶的作用来影响
侧根的生长。
参考文献
陈吉龙, 刘洁, 陈智伟, 张玉廉 (1998). 应用果蝇yellow基
因的分子模式分析基因转应作用. 发育与生殖生物学报
2, 239–240.
侯仙慧, 丁茂予 , 刘赛男, 李林川, 瞿礼嘉 (2009). 拟南芥
MeIAA抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析. 植物学报
44, 52–58.
权宏, 施和平, 李玲 (2003). 脱落酸诱导气孔关闭的信号转
导研究. 植物学通报 6, 664–670.
王伟青, 程红焱 (2006). 拟南芥突变体种子休眠与萌发的研
究进展. 植物学通报 23, 625–633.
郑国锠 (1978). 生物显微技术. 北京: 人民教育出版社. pp.
17–112.
Aramayo R, Metzenberg RL (1996). Meiotic transvection in
fungi. Cell 86, 103–113.
Berger D, Altmann T (2000). A subtilisin-like serine prote-
ase involved in the regulation of stomatal density and
distribution in Arabidopsis thaliana. Genes Dev 14,
1119–1131.
Bergmann DC, Sack FD (2007). Stomatal development.
Annu Rev Plant Biol 58, 163–181.
Buessis D, Groll UV, Fisahn G, Altmann T (2006). Stom-
atal aperture can compensate altered stomatal density in
Arabidopsis thaliana at growth light conditions. Funct
Plant Biol 33, 1037–1043.
Cahill JF, Kembel SW, Gustafson DJ (2005). Differential
genetic influences on competitive effect and response in
Arabidopsis thaliana. J Ecol 93, 958–967.
Chaerle L, Saibo N, Straeten DVD (2005). Tuning the
pores: towards engineering plants for improved water use
efficiency. Trends Biotechnol 6, 308–315.
Groll UV, Berger D, Altmann T (2002). The subtilisin-like
serine protease SDD1 mediates cell-to-cell signaling
during Arabidopsis stomatal development. Plant Cell 14,
1527–1539.
Hamilton JMU, Simpson DJ, Hyman SC, Ndimba BK,
Slabas AR (2003). Ara12 subtilisin-like protease from
Arabidopsis thaliana purification, substrate specificity and
tissue localization. Biochem J 370, 57–67.
Hou SW, Baker A, Webb A, Jia JF, Li WJ (2006). Segre-
gation and identification of IAA6-knocked out mutant of
Arabidopsis. In: Xu ZH, Li JY, Pua EC, Xue YB, eds. 11th
IAPTC&B Congress Abstracts. Boston: Kluwer Academic
Publishers. pp. 64–64.
Kagan ML, Novoplansky N, Sachs T (1992). Variable cell
lineages form the functional pea epidermis. Ann Bot 69,
303–312.
Larkin JC, Marks MD, Nadeau J, Sack F (1997). Epi-
326 植物学报 45(3) 2010
dermal cell fate and patterning in leaves. Plant Cell 9,
1109–1120.
Leiserson WM, Bonini NM, Benzer S (1994). Transvection
at the eyes absent gene of Drosophila. Genetics 138,
1171–1179.
MacRobbie EAC (1998). Signal transduction and ion
channels in guard cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol
Sci 353, 1475–1488.
Matzke MA, Matzke AJ (1995). Homology-dependent gene
silencing in transgenic plants: what does it really tell us?
Trends Genet 11, 1–3.
Nadeau JA (2009). Stomatal development: new signals and
fate determinants. Curr Opin Plant Biol 12, 29–35.
Rautengarten C, Steinhauser D, Büssis D, Stintzi A,
Schaller A, Kopka J, Altmann T (2005). Inferring hy-
potheses on functional relationships of genes analysis of
the Arabidopsis thaliana subtilase gene family. PLoS
Comput Biol 4, 297–312.
Serna L, Fenoll C (1997). Tracing the ontogeny of stomatal
clusters in Arabidopsis with molecular markers. Plant J 4,
747–755.
Shpak ED, McAbee JM, Pillitteri LJ, Torii KU (2005).
Stomatal patterning and differentiation by synergistic
interactions of receptor kinases. Science 309, 290–
293.
Sun FL, Dean WL, Kelsey G, Allen ND, Reik W (1997).
Transactivation of Igf2 in a mouse model of Beckwith-
Wiedemann syndrome. Nature 389, 809–815.
Identification and Genetic Analysis of Two Putative SDD1
Alleles in Arabidopsis
Kai Liang, Pingping Qian, Xi Cheng, Qianqian Qin, Ruiling Jia, Yanping Zhang, Suiwen Hou*
School of Life Science, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China
Abstract SDD1 is a crucial gene regulating stomatal development and encodes a subtilisin-like serine protease.
Screening an ethyl methane sulfonate (EMS)-mutagenized population of Arabidopsis thaliana, we isolated two mutants
(e281 and g204) with altered stomatal characteristics. The two mutants showed about a 1.5-fold increase in stomatal
density and index and formed a clustered stomata similar to the sdd1-1 mutant, but the internal leaf architecture was not
altered. Genetic analysis and sequencing results confirmed that e281 and g204 are two novel SDD1 alleles. The mutation
results in amino acid changes in the N domain for the substrate binding site and in one of the S domains for the catalytic
triad, respectively. Moreover, morphological and physiological data indicate that mutation of different sites within the
SDD1 gene lead to different phenotypes. The antagonism among SDD1 alleles can be a negative effect of the gene
transvection.
Key words allele, Arabidopsis mutant, SDD1, stomata density, transvection
Liang K, Qian PP, Cheng X, Qin QQ, Jia RL, Zhang YP, Hou SW (2010). Identification and genetic analysis of two
putative SDD1 alleles in Arabidopsis. Chin Bull Bot 45, 318–326.
———————————————
* Author for correspondence. E-mail: housw@lzu.edu.cn
(责任编辑: 孙冬花)