全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (10) : 1411 - 1416
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 03 - 02; 修回日期 : 2009 - 08 - 29
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30671441, 30700545) ; 北京市果树逆境生理与分子生物学重点实验室项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: rschan@ cau1edu1cn)
苹果属小金海棠 M xIrt1基因特异性片段的原核表
达及多克隆抗体的制备
孙春玉 1, 2 , 王　忆 1 , 孔　瑾 1 , 许雪锋 1 , 李天忠 1 , 韩振海 13
(1中国农业大学园艺植物研究所 , 北京 100193; 2 吉林农业大学生命科学学院 , 长春 130118)
摘 　要 : M xIrt1是从苹果属植物小金海棠中克隆出的二价阳离子转运膜蛋白基因。为进一步研究该基
因的功能 , 利用 M xIrt1基因位于第 3和第 4跨膜区之间的 162 bp片段 , 构建了原核表达载体 pGEX2MxIrt1,
经原核表达、亲和层析、获得 GST2MxIRT1融合蛋白 , 以融合蛋白为抗原 , 制备多克隆抗体 , EL ISA方法
检测抗体效价阳性 , 蛋白质印迹检测植物体内总蛋白 , 获得与预期大小一致的特异性条带。上述结果表明 ,
表达的目的蛋白可用于免疫组织化学、蛋白质印迹检测。
关键词 : 苹果属 ; 小金海棠 ; M xIrt1基因 ; 特异片段 ; 原核表达 ; 多克隆抗体
中图分类号 : S 66111; Q 786　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1021411206
Prokaryotic Expression of M xIrt1 Genes Segm en t and the Prepara tion of Its
Polyclona l An tibody
SUN Chun2yu1, 2 , WANG Yi1 , KONG J in1 , XU Xue2feng1 , L I Tian2zhong1 , and HAN Zhen2hai13
(1 Institu te of Horticultural P lants, Ch ina A gricu ltura l U niversity, B eijing 100193, China; 2 College of L ife Sciences, J ilin A gricu l2
tu ra l U niversity, Changchun 130118, Ch ina)
Abstract: M xIrt1 is a iron transport p rotein gene from M alus x iaojinensis. To study the functional charac2
teristic of M xIrt1 , the recombinant p lasm id pGEX2MxIrt1 was constructed with 162 bp segments between 3 rd
and 4 th TMR ( Transmembrane region) , following the exp ression in E1coli with high efficiency, purification u2
sing Glutathione Sepharose 4B , the recombinant GST2MxIRT1 p rotein was obtained. EL ISA assay detected the
reactivity of the polycolonal antibody and W estern blot shows that specific band was corresponding to the ex2
pectation. The recombinant GST2MxIRT1 p rotein can also be used for immunohistochem istry.
Key words: M alus; M alus x iaojinensis; M xIrt1; specific segment; p rokaryotic exp ression; polyclonal
antibody
铁是植物体生长发育必须的元素 , 在植物体的光合作用、呼吸作用、氮的固定、蛋白质和核酸的
合成等诸多生理代谢过程的电子传递链或酶促反应中发挥着极为重要的作用 (W elch, 1995; Thoiron
et al. , 1997)。果树在土壤钙化的情况下易发生缺铁黄叶病。虽然外部供应铁源可以矫正缺铁失绿
症 , 但通过养分投入的方式不能从根本上解决问题 , 而 “生物学路线 ”已成为研究解决果树铁素营
养失调问题的根本途径 (韩振海和许雪峰 , 1995)。
研究表明 , Irt1基因对于拟南芥从土壤中吸收铁是必需的。Vert等 (2002) 采用基因插入法使拟
南芥中 Irt1基因失活 , 获得了 Irt1基因不表达的突变体植株 , 在缺铁诱导时发现 , Irt1功能缺失的突
变株表现为严重的缺铁黄化现象 , 证明 Irt1基因是维持拟南芥体内铁代谢平衡最主要的铁载体基因。
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
M xIrt1基因是从铁高效植物小金海棠缺铁处理的根系 cDNA文库中克隆出来的二价铁转运蛋白基因
( GenBank登录号 AY193886) , 推测其在抗缺铁胁迫高效利用铁方面起主要作用 , 具有 “Z IP基因家
族 ” ( Fox & Guerinet, 1998) 的功能保守区域 , 在第 3与第 4个跨膜螺旋之间有一富含组氨酸的区域
(HGHFHAHNH) , 而该区域被认为是金属离子的结合位点 (戚金亮 等 , 2004; 曹冬梅 等 , 2006; 王
忆 等 , 2007; 张玉刚 等 , 2007)。
作者通过表达融合蛋白制备多克隆抗体 , 为进一步研究该基因的功能提供有用的蛋白探针 , 以期
能够深入研究果树抗缺铁胁迫的机制。
1　材料与方法
111　材料
试验于 2006年 7月至 2007年 3月在北京市果树逆境生理与分子生物学重点实验室进行。原核表
达质粒 pGEX24T21由中国农业大学植物生理生化国家重点实验室王学臣教授惠赠 ; 大肠杆菌 BL21及
小金海棠组培苗由北京市果树逆境生理与分子生物学重点实验室保存 , Glutathione Sepharose 4B亲和
层析柱料为 Amersham2Pharmacia B iotech公司产品。
112　原核表达载体 pGEX2Irt的构建
以 pGEM 2Irt为模板设计特异性引物 , 利用 PCR技术扩增 M xIrt1基因位于第 3和第 4跨膜区之间
的非保守区 162 bp片段。
上游引物为 : 5′2GGCGAATTCTGTAGAACTGGAGTTATCCCA23′, 下游引物为 : 5′2GACTCGAGAA2
CACGATAACGGGACAGC23′(下划线分别为 EcoRⅠ和 X hoⅠ酶切位点 )。
PCR反应条件 : 94 ℃变性 3 m in, 94 ℃变性 30 s, 65 ℃复性 50 s, 72 ℃延伸 50 s, 35个循环 ,
72 ℃延伸 10 m in。
回收 PCR产物 ; 取 5μg pGEX24T21质粒及 PCR产物分别用 EcoRⅠ和 X hoⅠ在 37 ℃双酶切 2 h,
回收酶切产物 , 在 T4 DNA连接酶的作用下连接过夜得到重组质粒 pGEX4T2MxIrt1K。用 EcoRⅠ和 X ho
Ⅰ酶切重组质粒 pGEX4T2MxIrt1K, 得到预期大小的目的条带后进行 DNA序列测定。
113　融合蛋白的诱导表达及检测
将构建好的原核表达载体转化 E1coli BL21感受态细胞 , 涂布于 LB固体平板 , 37 ℃培养过夜 ,
菌落 PCR鉴定阳性克隆。挑取单菌落接种于 LB液体培养基中 (含 100 mg·L - 1 Amp) , 37 ℃ 200 r·
m in - 1摇菌培养过夜。按 1 ∶100的比例接种到新鲜液体 LB培养基中 (含 100 mg·L - 1 Amp ) , 37 ℃
200 r·m in - 1至 OD600达到 015～110, 分别在 22、25、28、30 ℃条件下 , 使用不同 IPTG浓度 ( 011、
012、015、018和 110 mol·L - 1 ) 进行诱导表达。
在诱导不同时间 (1、2、3、4和 5 h) 后取 1 mL菌液样 , SDS2PAGE检测表达情况 , 确定最佳
表达条件。
114　融合蛋白的纯化
使用最佳的诱导条件进行大量诱导表达 , 5 000 r·m in - 1离心 15 m in收集培养物 , 1 L培养物重
悬于 50 mL PBS ( 137 mmol·L - 1 NaCl; 217 mmol·L - 1 KCl; 10 mmol·L - 1 Na2 HP04 ; 2 mmol·L - 1
KH2 PO4 , pH 714) , 含 5 mmol·L - 1 DTT。在冰浴条件下超声破碎菌体细胞 , 收集超声后液体 , 4 ℃,
20 000 r·m in - 1离心 20 m in, 取上清液 , 4 ℃保存。用 Glutathion Sepharose 4B亲和层析柱料 (已溶
涨 ) 4 ℃进行蛋白质的纯化 , 然后用 50 mmol·L - 1 Tris2HCl, pH 810 (含 10 mmol·L - 1的还原型谷胱
甘肽 ) 进行洗脱 , 用截留分子量 5 000的超滤装置对洗脱蛋白超滤浓缩 , 根据 B radford (1976) 的测
定方法以牛血清白蛋白标准液为对照测定蛋白浓度。少许留样进行 SDS2PAGE分析。
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　10期 孙春玉等 : 苹果属小金海棠 M xIrt1基因特异性片段的原核表达及多克隆抗体的制备 　
115　抗 GST2M x IRT融合蛋白抗体的制备
以浓缩后的蛋白为抗原免疫新西兰兔 , 用量为每次每只 1 mg。首免 ∶纯化的融合蛋白与福氏完全
佐剂按 1 ∶1混合乳化 , 背部多点皮内注射 , 注射卡介苗 50μL; 二免与三免 : 纯化的融合蛋白与福氏
完全佐剂按 1∶1混合乳化 , 背部多点皮内注射 ; 四免后小量采血 , 用 EL ISA方法测定血清效价 , 若效
价合格 , 四免后取全血 (颈部动脉取血 )。
每次免疫间隔为 10 d, 免疫血清在 4 ℃下静置过夜 , 5 000 ×g离心 10 m in, 将上清液用 H iTrapTM
ProteinA亲和层析 , 将纯化后的抗体分装 , - 80 ℃保存。
116　抗 GST2M x IRT融合蛋白抗体的检测
EL ISA方法检测血清效价 : 将 GST2MxIRT1融合蛋白溶于包被液 (50 mmol·L - 1碳酸钠缓冲液 ,
pH 916) 中稀释至终浓度为 1μg·mL - 1 , 在酶标板的反应孔内准确加入包被液各 100μL, 并将酶标
板放于湿盒中 , 37 ℃下保温 2 h, 4 ℃冰箱静置 48 h。用 PBST (10 mmol·L - 1 Tris2HCl, 150 mmol·
L - 1 NaCl, 0105% Tween220) 洗涤 3次 , 然后按照每孔 200μL的量加入封闭液 ( TBS + 3%BSA ) ; 用
PBST洗涤 3次 ; 每孔分别加入 200μL血清 (稀释不同倍数 ) 及稀释液 (0101 mol·L - 1 , pH 714磷
酸盐缓冲液作为对照 ) , 37 ℃下温育 2 h; 用 PBST洗涤 3次 , 每孔加入辣根过氧化物酶标记的 HRP -
山羊抗兔二抗 200μL, 37 ℃下温育 1 h; 弃上清液 , PBST洗涤 3次 ; 加入邻苯二胺 (OPD ) 200μL,
室温暗处显色 10～20 m in, 每孔加入 50μL 2 mmol·L - 1 H2 SO4终止反应后 , 在酶标仪上 490 nm处测
定其 OD值。
蛋白质印迹鉴定抗体的特异性 : 将重组蛋白 GST2MxIRT进行 SDS2PAGE, 电泳后半干式转移将胶
上的蛋白质转移到硝酸纤维膜上 , 以 5%的脱脂奶粉封闭 , 先以荧光素标记的抗 GST抗体为抗体对表
达产物进行 W estern blot分析 ; 然后以纯化后的抗体为一抗 , 以碱性磷酸酶标记的山羊抗兔抗体为二
抗 , 提取小金海棠叶片总蛋白进行 W estern blot检测。植物总蛋白的提取参照 Damerval等 (1986) 的
方法。
2　结果与分析
211　原核表达载体 pGEX2Irt的构建
通过 PCR方法 , 用特异引物从 pGEM 2MxIrt1中扩增出位于 M xIrt1基因第 3和第 4跨膜区之间的
162 bp片段 (图 1)。
图 1　M xIrt1基因 162 bp中间片段 PCR扩增结果
M. DNA2000分子量标准 ; 1. PCR扩增产物。
F ig. 1　Result of PCR am plif ica tion
M. DNA2000 ladder; 1. PCR p roducts.
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将其回收、连接、转化后经过菌落 PCR鉴定和提取重组质粒进行酶切鉴定后 , 出现 160 bp的目
的条带 (图 2) , 说明该目的片段已接到原核表达载体 pGEX24T21上 , 构建了原核表达载体 pGEX4T2
MxIrt1K。序列测定结果表明构建质粒的序列完全正确 , 未出现碱基突变及移码现象。
图 2　重组表达质粒 pGEX4T2M x Irt1K的酶切鉴定图
M. DNA2000分子量标准 ; 1. 转化子酶切后结果。
F ig. 2　 Iden tif ica tion of recom b inan t pla sm id pGEX4T2M x Irt1K by restr iction d igestion
M. DNA2000 ladder; 1. Restriction digestion of recombination.
212　融合蛋白的诱导表达及 W estern blot检测
将构建好的原核表达载体 pGEX4T2MxIrt1K转化大肠杆菌后 , 在酶切和基因测序的基础上 , 证明
外源基因已插入原核表达载体。
挑取单菌落 , 在不同温度下以不同浓度的 IPTG诱导 , 经过不同时间取样检测 , SDS2PAGE电泳
结果表明 , 011 mmol·L - 1 IPTG诱导 4 h, 32 kD的 GST2MxIrt1K融合蛋白表达量最高 , 而空载体和不
加 IPTG的表达质粒没有目的蛋白的表达。
以荧光素标记的抗 GST抗体为抗体进行 W estern blot, 结果表明目的条带得到正确表达 (图 3)。
图 3　重组表达质粒 pGEX4T2M x Irt1K表达产物的 SD S2PAGE分析以及 W estern blot检测结果
M: 标准蛋白分子量 ; 1: 未经诱导的转化子表达的总蛋白 ;
2～6: 诱导 1～5 h后转化子表达的总蛋白 ; 7: 转化 pGEX24T21菌株经诱导后的 W estern blot分析 ;
8: 转化 pGEX4T2MxIrt1K菌株经诱导后的 W estern blot分析。
F ig. 3　SD S2PAGE and W estern blot ana lysis for the expression product of pGEX4T2M x Irt1K
M: Protein marker; 1: Total p roteins of uninduced E1coli transformed with pGEX4T2MxIrt1K;
2 - 6: Total p roteins of induced E1coli transformed with pGEX4T2MxIrt1K with different time;
7: W estern bolt analysis of exp ression p roducts of pGEX24T21;
8: W estern bolt analysis of exp ression p roducts of pGEX4T2MxIrt1K.
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　10期 孙春玉等 : 苹果属小金海棠 M xIrt1基因特异性片段的原核表达及多克隆抗体的制备 　
213　融合蛋白制备多克隆抗体的鉴定
序列分析表明 M xIrt1基因的 cDNA全长为 1 398 bp, ORF为 1 095 bp, 编码一个 364个氨基酸的
多肽 , 是一具有 7个跨膜螺旋的膜蛋白 , 推测其分子量为 42 kD (戚金亮 , 2003)。
若制备的抗体能够识别植物体内的抗原 , 则应在相应蛋白质分子量处有特异条带的出现 , 利用纯
化的 GST2MxIRT1融合蛋白免疫新西兰大白兔 , 制备多克隆抗体 , 以常规间接 EL ISA法测定抗体的效
价 , 该抗血清的效价为阳性。
将抗血清用 H iTrapTM ProteinA亲和层析纯化后 , 以纯化后的抗体为一抗 , 以碱性磷酸酶标记的山
羊抗兔抗体为二抗 , 提取小金海棠叶片总蛋白进行 W estern blot。结果如图 4所示 , 在预期蛋白质分
子量 40 kD处有一特异性条带 , 说明该抗体能够识别植物体内抗原 , 进行特异性反应。
图 4　纯化抗体的 W estern blot分析
M: 预染 Marker; 1: 转化 pGEX24T21菌株的 W estern blot结果 ;
2: 纯化的融合蛋白的 W estern blot结果 ; 3: 提取小金海棠叶片总蛋白 W estern blot结果。
F ig. 4　W estern blot ana lysis of pur ied an tibody
M: Protein marker; 1: W estern blot with pGEX24T21;
2: W estern blot with purified p rotein; 3: W estern blot with total p rotein of M alus xiaojinensis leaf.
3　讨论
膜蛋白具有较强疏水性 , 很难用原核细胞表达完整蛋白。有的研究将目的蛋白的 C端进行原核
表达 (胡锐颖 等 , 2007; 钟英成 等 , 2007) , 制备的多克隆抗体可成功用于免疫组织化学、蛋白质
印迹检测等方面 ; 有的研究将基因的各个抗原结构域分别进行原核表达 , 不仅缩短了表达片段的长
度 , 更获得了可溶性目的蛋白 (徐璐 等 , 2006) ; 也有用真核表达系统进行膜蛋白的表达 , 但表达量
较低 , 不能满足进一步研究的需要。M xIrt1是从苹果属植物小金海棠缺铁处理的根系 cDNA文库中克
隆出的二价阳离子转运膜蛋白基因 (王忆 等 , 2007)。通过对不同种属植物 Irt1基因的序列分析发
现 , 在跨膜结构域 3和 4之间 , 只有 2个氨基酸残基完全相同 , 且该区富含 H is, 对于金属离子的结
合与跨膜转运十分重要 , 改变其内的某些氨基酸残基可改变其对二价金属离子结合的特性 (渠慎春
等 , 2004)。本试验中尝试将 M xIrt1基因位于第 3和第 4跨膜区之间的非保守区 162 bp构建到原核表
达载体 pGEX24T21中 , 相对于表达该基因的全长来说 , 一方面能够克服膜蛋白较难表达的问题 , 同
时有利于得到更为特异的抗体。进一步的试验表明所制备的抗体能够与植物体内相应的抗原发生特异
反应 , 从而为进一步研究该基因的功能奠定了基础 , 同时也为膜蛋白原核表达摸索了新的途径。
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