全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (2) : 189 - 194
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 07 - 03; 修回日期 : 2007 - 08 - 22
基金项目 : 北京市教育委员会共建项目 (JD100190532)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: xuefengx@ cau1edu1cn)
小金海棠二价铁转运蛋白基因 M xIRT1定点突变的
研究
张学宁 , 孔　瑾 , 王　忆 , 韩振海 , 许雪峰 3
(中国农业大学果树逆境生理与分子生物学实验室 , 北京 100094)
摘　要 : 采用 PCR技术对小金海棠 (M alus xiaojinensis) 二价铁转运蛋白基因 M xIRT1的定点突变体系
进行了探讨。根据 M xIRT1开放阅读框 (ORF) 两端和突变位点序列各设计一对引物。通过 PCR扩增 , 获
得带有突变位点且在突变位点相互重叠的两个 PCR片段。对以上两个片段的浓度进行调整后 , 将其用作
PCR反应的模板。对退火温度和延伸时间进行优化后 , 利用 ORF两端引物 , 将带有突变位点的两个片段拼
接起来 , 从而获得了含有所要突变位点的 M xIR T1, 并将其插入 pEASY2T2载体中。DNA序列分析表明在预
期位点上已经发生了突变 : M xIRT1编码的第 186位密码子已由组氨酸残基变为丙氨酸残基 , 证明用 PCR
技术已成功地使 M xIRT1基因发生突变。整个突变过程不需要任何回收与纯化步骤 , 是一个高效、快捷的
定点突变体系。
关键词 : 小金海棠 ; 基因突变 ; 定点突变技术 ; 二价铁转运蛋白基因 ; 缺铁病
中图分类号 : S 66512　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0220189206
Stud ies of S ite D irect M utagenesis of M xIR T1 Gene of M a lus xiao jinensis
ZHANG Xue2ning, KONG J in, WANG Yi, HAN Zhen2hai, and XU Xue2feng3
(S tress Physiology and M olecu lar B iology L abora tory of Fru it Tree, Ch ina A gricultural U niversity, B eijing 100094, China)
Abstract: PCR was app lied for point mutagenesis of M xIR T1 gene. Two pairs of p rimers were designed
according to the opening read frame (ORF) and sequence for mutation ofM xIR T1. Two fragments overlapp ing
at the targetmutated base were amp lified by PCR. The fragmentswere amp lified after dilution with the p rimers
designed with the two ends of ORF, and the two mutated fragmentswere stringed together. The annealing tem2
perature and extension time were op tim ized for successful amp lification. The mutated M xIR T1 was ligated into
pEASY2T2. Sequencing result showed that we mutated M xIR T1 successfully. DNA recollection and purifica2
tion were not necessary for this experiment. W e establish an efficient, simp le gene mutagenesis system.
Key words: M alus x iaojinensis; gene mutation; site direct mutagenesis; M xIRT1; iron deficiency
基因定点突变技术 ( site direct mutagenesis) 可以方便地对已知 DNA序列中的特定核苷酸片段进
行替换或删除 , 从而获得目的氨基酸改变的蛋白质 , 有效地研究蛋白质的结构与功能。目前定点突变
的方法有多种。与利用化学或自然因素等导致突变的方法相比 , PCR介导的定点突变方法具有突变
率高、简单易行、重复性好的特点。国内外学者在此方面已经取得了一定进展。陈霖 ( 2006) 用定
点突变法对玉米 ZmR IDP1进行了研究 , 发现位于该蛋白第 181位的半胱氨酸控制着其被还原剂抑制
的特性。Q i等 (2003) 通过定点突变法对 IgASE1酶 H is2box区域研究表明 , 序列内的可变氨基酸对
于维持 IgASE1酶的最佳活性是必不可少的。Rodríguez等 (2000) 用天门冬氨基酸替代大肠杆菌酸性
磷酸酶蛋白多肽链中的几个氨基酸残基后 , 增加了酶分子潜在的糖基化位点数 , 使突变后的植酸酶热
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稳定性得到了很大的提高。
缺铁黄叶病是果树普遍发生的病害之一 , 对树势、果品产量及品质都会造成极大影响。因此 , 抗
缺铁研究成为近年来果树抗逆研究领域迫切需要解决的问题之一。
研究发现 , 拟南芥二价铁转运蛋白 (A tIRT1) 消除突变体出现叶片黄化、生长发育严重缺陷甚
至死亡的现象 (Vert et al. , 2002)。因此 , 植物黄化现象可能与其体内的二价铁转运蛋白 ( IRT) 有
重要关系。戚金亮 (2003) 已从铁高效基因型 ———小金海棠 (M alus x iaojinensis Cheng et J iang) 缺铁
处理的根中克隆得到了该植物的二价铁转运蛋白基因 M xIR T1。然而 , 对该基因编码的蛋白质的结构
与功能研究迄今尚未取得突破性进展。
本试验室将 M xIR T1与其它植物的同源基因进行比对和分析后 , 推测该基因编码的一些氨基酸可
能在小金海棠对铁的吸收和转运过程中起着重要作用。为了对这些位点的功能进行研究 , 对小金海棠
H is2box编码区的定点突变体系进行了探索。
1　材料与方法
111　材料
pGEM 2M xIR T1质粒 DNA, 大肠杆菌 DH5α感受态细胞均为本实验室保存 ; pEASY2T2购于北京全
式金生物科技有限公司。
112　方法
引物设计采用 Prem ier 510软件系统。根据开放阅读框 (ORF) 两端和突变位点各设计一对引物
PF1 /PR1与 PF2 /PR2。上述引物由上海生工生物工程有限公司合成 , 工作浓度均为 10μmol·L - 1。
以 pGEM 2M xIR T1质粒 DNA (10 ng·L - 1 ) 为模板 , 进行 PCR定点突变反应。反应分两轮进行 :
第 1轮以 PF1 /PR2和 PF2 /PR1两对引物分别进行 2个引入突变位点的 PCR反应 ; 第 2轮反应以第 1
轮反应的两个 PCR产物混合物为模板 , 以 PF1 /PR1为引物 , 通过重叠延伸法 , 将带有突变位点的两
个片段拼接成含有目的突变位点的 M xIR T1 cDNA全长 (图 1)。
图 1　M xIRT1定点突变反应示意图
▲表示突变位点 ; M xirt1表示突变后的 M xIRT1。
F ig. 1　Schema tic d iagram of the site d irect m utagenesis of M xIRT1
▲shows the mutant site; M xirt1 shows the mutated M xIRT1.
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　2期 张学宁等 : 小金海棠二价铁转运蛋白基因 M xIRT1定点突变的研究 　
PCR扩增产物在 60 V电压 , 1 ×TAE条件下 , 1%琼脂糖凝胶电泳 , 紫外灯下观察结果。取第 2
轮反应的目的片段 2μL与 pEASY2T2载体连接液 1μL在室温 (25 ℃) 条件下连接 10 m in, 然后按照
常规方法将连接产物转化到 DH5α大肠杆菌感受态细胞 , 在有 X2gal的 Amp平板上进行蓝白斑筛选。
挑取白色的单斑进行菌落 PCR鉴定 , 将结果为阳性的菌落接种到 5 mL 的 LB 液体培养基中 ,
37 ℃过夜培养。取 4 mL用作保菌和质粒酶切鉴定 , 1 mL送北京华大基因研究中心进行序列测定。
2　结果与分析
211　引物设计
PF1和 PR1是根据 M xIR T1的 ORF两端设计的引物。 PF1为正向引物 , 包含该基因的起始密码
子 ; PR1为反向引物 , 包含该基因的终止密码子。在这两条引物的 5′端分别引入酶切位点 , 可将该基
因定向克隆到表达载体中。
为了对 M xIRT1的第 186位编码氨基酸 ———组氨酸 (H is) 的功能进行分析 , 在不改变氨基酸数
的前提下 , 用结构简单的丙氨酸 (A la) 将其替换。序列分析表明 , 在突变位点两侧存在着 5个碱基
的回文序列 , 这对第 1轮扩增和第 2轮重叠延伸是极为不利的 (图 2) , 在引物设计时应尽量错开回
文序列 , 以减少形成发夹结构的机会。因此 , 在 PF2中将靠近 5′端的回文序列删去 1个碱基 , 并在
PR2中靠近 5′端回文序列删去 3个碱基 , 将突变位点 GCT放在引物中间偏 5′端 , 两条引物的重叠区
域为 11个碱基 , 以保证两个片段的重叠区较大 , 而使引物的长度最小。
图 2　突变位点及两侧序列
阴影部分表示欲突变的位点 ; 下划线表示回文序列。
F ig. 2　The m utan t site and flank ing sequences
Shadow shows the site for mutation; Underline shows palindrome.
212　突变位点的引入
　　第 1轮 PCR反应以 pGEM 2M xIR T1质粒 DNA
为模板 , 用引物 PF1 /PR2, PF2 /PR1分别扩增。
引物 PF1 /PR2反应体系为 25μL, 按次序加入 20
μL ddH2 O, 215μL Pfu DNA Polymerase Buffer (10
×) , 015 μL dNTPs ( 10 μmol·L - 1 ) , 015 μL
PF1, 015 μL PR2, 015 μL Pfu DNA Polymerase
(215 U) , 015μL pGEM 2T2M xIRT1。反应条件为 :
94 ℃预变性 2 m in; 94 ℃变性 30 s, 65 ℃退火 30
s, 72 ℃延伸 30 s, 30个循环 ; 72 ℃保温 10 m in。
引物 PF2 /PR1反应体系同上。通过上述操作获得
了在突变位置有一段重叠区域的两个片段 , 大小
分别为 570和 550 bp, 与预期结果一致 (图 3)。
图 3　突变位点的引入
1: DL 2000 p lus; 2: 引物 PF1 /PR2扩增产物 ;
3: 引物 PF2 /PR1扩增产物。
F ig. 3　 In troduction of the m utan t site
1: DL 2000 p lus; 2: Fragments amp lified by PF1 /PR2;
3: Fragments amp lified by PF2 / PR1.
213　突变基因的获得
PCR第 1轮产物条带清晰 , 没有非特异扩增 , 可直接作为第 2轮反应的模板。用 M xIR T1两端的
引物 PF1和 PR1, 通过带有突变位点片段的重叠区将两个片段拼接起来 , 可获得带有特异突变位点的
M xIR T1片段。在第 1轮反应程序的基础上 , 如果只是单纯的增加延伸时间已经不能得到所要的目的
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片段 , 所以必须对反应程序进行优化。两个突变片段十几个碱基重叠区域配对的机率要比十几个碱基
的引物与模板配对的机率小的多 , 延长退火时间可增加重叠区域配对的机会。结果发现 , 在 30 s时
几乎没有目的片段扩增 ; 40、50和 60 s时 , 都扩增出了目的条带 , 可见延长退火时间对拼接反应是
非常有效的。从图 4可以看出 , 40 s时目的条带并不清楚 , 60 s时目的条带和非特异扩增条带都比较
清晰 , 而 50 s时目的条带明显比其它非特异扩增条带清晰 , 所以选择 50 s为最佳退火时间。
图 4　不同退火时间对拼接产物的影响
a: 40 s; b: 50 s; c: 60 s。1: Marker; 2: 拼接产物。白色箭头所指为目的条带。
F ig. 4　Effect of annea ling tim e on the splic ing products
a: 40 s; b: 50 s; c: 60 s. 1: Marker; 2: Sp licing p roducts of the second
round PCR. W hite arrows show sp licing p roducts.
虽然延长退火时间后出现了目的条带 , 但是反应产物中存在大量的非特异扩增 , 分析原因可能是
大片段的模板中存在部分互补序列的错配 , 以及上一轮反应中残余引物的影响。这对以后目的条带的
回收、纯化以及克隆会造成很大的干扰。所以 , 在相同反应体系 , 又对模板浓度进行了探索 , 结果认
为稀释倍数对扩增条带的特异性是有益的 (图 5)。在各取 1μL第 1轮产物作模板时 , 目的片段上下
方均出现了非特异扩增 ; 当稀释 50倍时 , 只在目的片段下方出现非特异扩增 ; 100倍时 , 只有目的
片段扩增 , 且几乎看不到非特异扩增 ; 但 200倍时目的片段扩增产量有所下降 , 所以 , 选择将第 1轮
产物稀释 100倍作为第 2轮反应的模板。
综上分析 , 拼接反应的扩增条件为 : 94 ℃预变性 3 m in; 94 ℃变性 30 s, 65 ℃退火 50 s, 72 ℃
延伸 90 s, 30个循环 ; 最后 72 ℃保温 10 m in。扩增结果 : 目的条带清晰 , 大小为两个突变片段长度
之和 (图 6) , 且与野生型 pGEM 2T2M xIR T1的扩增结果一致。
图 5　模板浓度对拼接产物特异性的影响
1: 1 ×; 2: 5 ×; 3: 10 ×; 4: 50 ×;
5: DL 2000 p lus; 6: 100 ×; 7: 200 ×;
8: 阴性对照 ; 9: 阳性对照 (M xIRT1)。
F ig. 5　Effect of tem pla te concen tra tion on spec if ic
of the splic ing products
1: 1 ×; 2: 5 ×; 3: 10 ×; 4: 50 ×; 5: DL 2000 p lus; 6: 100 ×;
7: 200 ×; 8: Negative control; 9: Positive control (M xIR T1) .
图 6　突变片段的拼接
1: DL 2000 p lus; 2～4: 引物 PF1 /PR1扩增突变的
M xIR T1; 5: 引物 PF1 /PR2的突变产物 ;
6: 引物 PF2 /PR1的突变产物。
F ig. 6　Splic ing of the two fragm en ts con ta in ing m uta tion site
1: DL 2000 p lus; 2 - 4: Sp liced fragments containing
mutation site; 5: Fragments amp lified by PF1 / PR2;
6: Fragments amp lified by PF2 /PR1.
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　2期 张学宁等 : 小金海棠二价铁转运蛋白基因 M xIRT1定点突变的研究 　
214　阳性菌落鉴定
将第 2轮 PCR产物与 T载体连接 , 转化大肠杆菌感受态细胞。挑取白色克隆 , 进行菌落 PCR分
析。扩增结果如图 7所示 : 在 110 kb的上方有一条大约 111 kb的片段 , 插入片段的大小与 pGEM 2T2
M xIR T1的扩增结果一致。
提取阳性菌落的质粒 DNA, 用载体上的双 EcoR Ⅰ位点进行酶切分析 (M xIR T1序列不含此位
点 ) , 37 ℃反应 2 h, 电泳检测 (图 8) , 质粒 DNA已被切成两部分 , 大片段与 T载体大小一致 , 小
片段与目的片段大小相似 , 确认目的片段已经插入到 T载体中。
图 7　阳性菌落的 PCR鉴定
1～3: 不同白斑的扩增结果 ; 4: DL 2000 p lus;
5: pGEM2M xIRT1的扩增结果。
F ig. 7　 The PCR result of positive clones
1 - 3: PCR results of the white clones; 4: DL 2000 p lus;
5: PCR result of positive control.
图 8　质粒 D NA的酶切分析
1: DL 2000 p lus; 2～4: 阳性克隆质粒的
EcoR Ⅰ酶切结果。
F ig. 8　Restr iction ana lysis of the pla sm id D NA
1: DL 2000 p lus; 2 - 4: Plasm id of positive clones
restricted by the EcoR Ⅰ.
215　突变 M xIRT1的序列分析
将构建在 T载体上的突变 M xIR T1进行序列分析 , 测序结果与野生型 M xIR T1比对表明 : 第 186
位编码组氨酸的 CAT已成功突变成编码丙氨酸的 GCT, 而其它位点未发生任何改变 (图 9)。
图 9　突变后的测序结果
划方框的位置表示组氨酸残基 (CAT) 突变为丙氨酸残基 ( GCT)。
F ig. 9　The result of sequenc ing after m uta tion
The frame shows the mutation site.
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3　讨论
DNA突变技术在生物学研究和生物技术开发领域应用极为广泛。为了对小金海棠 M xIR T1转运蛋
白基因的功能保守区进行研究 , 本试验中以该基因编码的第 186位氨基酸为例 , 对定点突变体系进行
了探索 , 并建立了一个整个突变过程不需要任何回收和纯化步骤的定点突变体系。
研究发现以下 3个方面在定点突变技术中起着极为重要的作用。
第 1, 在遵循引物设计规则的前提下 , 应尽量将突变位点放在引物中间或稍靠近 5′端位置 , 这样
能保证两个突变片段的重叠区域较大而引物不至于太长。肖谷田等 (1997) 发现在不影响引物与模
板 DNA特异性结合和引物延伸反应的前提下 , 引物长度应尽量短。本试验在设计引物时巧妙地避开
了回文序列对扩增的影响 , 并发现重叠区尽量不要少于 10个碱基 , 这样可使两个片段连接起来较为
容易。
第 2, 在反应程序上 , 一般 PCR扩增只要 30 s就可以使引物与模板很好的匹配。但是将带有突
变位点的片段进行拼接时 , 由于两个片段均较大而导致退火时重叠区互补序列配对不太容易。本试验
通过延长退火时间达到了令人满意的效果。
第 3, 在反应体系上 , 为了提高拼接产物的特异性 , 第 1轮 PCR反应产物需经纯化才可用作第 2
次扩增的模板 (闫振文 等 , 2002)。本试验对拼接产物的特异性进行分析后发现第 1轮 PCR反应产
物不经纯化便可直接作为第 2轮反应的模板。同时 , 应稀释到适当浓度 , 以减少第 1轮反应中引物等
其它成分对拼接的影响 , 但也不能过度稀释 , 否则会因模板浓度过低而导致扩增失败。
本试验重点对定点突变 PCR技术进行优化 , 正确对其中的特异氨基酸进行了突变 , 获得了突变
的 M xIR T1基因 , 为继续进行其它位点氨基酸的定点突变 , 并为研究 M xIR T1的结构和功能奠定了基
础。
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