全 文 ：第 34 卷 第 5 期
2012 年 9 月
北 京 林 业 大 学 学 报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol． 34，No． 5
Sep．，2012
收稿日期:2012--02--27
基金项目:国家自然科学基金项目(30700559、30671476、31270737) ，北京市自然科学基金项目(6112016)。
第一作者:王艳萍。主要研究方向:植物抗逆分子生物学。电话:15210898515 Email:yanp-wang@ 163． com 地址:100083 北京市清华东
路 35 号北京林业大学生物科学与技术学院。
责任作者:卢存福，博士，副教授。主要研究方向:植物抗逆性。电话:010--62338189--54 Email:lucunfu@ bjfu． edu． cn 地址:同上。
本刊网址:http:∥ journal． bjfu． edu． cn
沙冬青热胁迫相关蛋白基因 AmHsa32 超表达
提高大肠杆菌的抗热性
王艳萍 刘美芹 师 静 刘胜利 陈玉珍 卢存福
(北京林业大学生物科学与技术学院，林木育种国家工程实验室)
摘要:热胁迫相关蛋白 32(Heat stress associated protein 32，Hsa32)与植物的抗逆性密切相关。本文将从沙冬青低温
干旱 EST 库中获得的热胁迫相关蛋白基因 AmHsa32 进行了非生物胁迫下的表达分析与转化大肠杆菌研究。生物
信息学分析表明，AmHsa32 的编码区全长 858 bp，编码 286 个氨基酸，预测分子量约 32 kD，与拟南芥 HSA32 亲缘关
系较近。qRT-PCR 分析显示，AmHsa32 在沙冬青幼苗中受热胁迫诱导后表达量迅速提高，1 h 后达到对照的 25 倍;
对其他非生物胁迫如低温、干旱及盐均有响应，表达量有不同程度的增加，说明 AmHsa32 对沙冬青非生物胁迫抗性
的提高可能发挥着重要作用。将 AmHsa32 基因转化大肠杆菌，同野生菌相比，热胁迫(50 ℃)条件下，转基因大肠
杆菌存活率明显提高。本研究结果表明，AmHsa32 可用于通过转基因技术提高热敏感植物抗热性的研究。
关键词:沙冬青;热胁迫;AmHsa32 基因;基因表达分析;转基因大肠杆菌
中图分类号:S759． 95;Q943. 2 文献标志码:A 文章编号:1000--1522(2012)05--0037--07
WANG Yan-ping;LIU Mei-qin;SHI Jing;LIU Sheng-li;CHEN Yu-zhen;LU Cun-fu． Enhanced
tolerance against heat stress of Escherichia coli cells by over-expressing an Ammopiptanthus
mongolicus heat stress associated protein gene AmHsa32 ． Journal of Beijing Forestry University
(2012)34(5)37--43［Ch，19 ref．］National Engineering Laboratory for Tree Breeding，College of
Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，100083，P． R． China．
The extremely summer high temperature in desert region makes the plant heat tolerant and a
desirable model for revealing the mechanism of plant resistance to heat stress． In the present research，
one gene designated as AmHsa32 encoding heat stress associated protein 32 was cloned by expressed
sequence tags from cold- and drought-treated Ammopiptanthus mongolicus seedlings． Bioinformatic
analysis showed that the ORF of AmHsa32 was composed of 858 base pairs，which encoded a heat stress
associated protein with 286 amino acids and a molecular weight of 32 kD． AmHsa32 had a high affinity
with heat stress associated protein 32 in Arabidopsis thaliana． qRT-PCR analysis showed that the
expression level of AmHsa32 was 25-fold of control one hour later under heat stress and up-regulated
under cold，drought，and salt stresses． Escherichia coli cells expressing AmHsa32 protein showed increased
resistance to heat stress(50 ℃)compared with control． We propose that AmHsa32 plays a protective role
in cells under heat stress． This finding could potentially be used to improve the plant tolerance to heat
stress via gene transfer．
Key words Ammopiptanthus mongolicus; heat stress; AmHsa32 gene; gene expressing analysis;
transgenic Escherichia coli
热激蛋白 (Heat Shock Proteins，简称 HSPs)是
生物体受到高温、低温、干旱、盐渍、营养饥饿、重金
属离子等逆境影响时诱导合成的一类应激蛋白。它
在植物细胞中普遍存在，主要起分子伴侣、热防御和
稳定细胞结构等功能。根据分子质量的大小，可将
HSPs 分为以下几大家族:HSP100 (分子质量为
104 ～ 110 ku)、HSP90(80 ～ 95 ku)、HSP70(63 ～ 78
ku)、HSP60(53 ～ 62 ku)、小分子质量热激蛋白
DOI:10.13332/j.1000-1522.2012.05.019
北 京 林 业 大 学 学 报 第 34 卷
(small HSPs，sHSPs 或低分子质量热激蛋白)分子质
量为 15 ～ 42 ku。在 HSPs 的众多成员中，sHSPs 的
种类最为丰富，广泛分布于细胞质、叶绿体、内质网、
线粒体等。sHSP 是植物受热胁迫时的主要产物，在
胁迫条件下表达量可提高 200 倍以上［1］。热胁迫相
关蛋白 Hsa32 (Heat Stress Associated Protein 32，
Hsa32)是主要发现于陆生植物中的一类新型热激
蛋白，在受到非致死性热激后该蛋白被大量诱导，并
且参与植物在热胁迫恢复后期耐热性的获得［2］。
在 拟 南 芥 (Arabidopsis thaliana)、水 稻 (Oryza
sativa)、番茄(Solanum lycopersicum)、小麦(Triticum
aestivum)中均发现有 Hsa32 基因，其在转录水平上
的表达明显受热胁迫的诱导，该蛋白的缺失将导致
热胁迫后耐热性下降［3］。
沙冬青 (Ammopiptanthus mongolicus)属 豆 科
(Leguminosae)沙冬青属，是国家二级濒危保护植
物，为温带荒漠地区唯一的常绿阔叶灌木，主要生长
于沙漠边缘的荒漠地带。其生境冬季最低温度达
－ 30 ℃以下;夏季气温高、蒸发量大，绝对最高温度
37 ℃以上，沙面最高温度可达 80 ℃。研究表明，沙
冬青有极强的耐热性［4］，是研究植物抗热分子机理
的理想实验材料。本文在我们前期工作的基础
上［5
--6］，从沙冬青低温、干旱诱导 ESTs 文库中选取
热胁迫相关蛋白基因 AmHsa32，分析其分子生物学
特性，并检测其对低温、干旱、热、盐渍胁迫的响应，
构建原核表达载体，测定热胁迫下转 AmHsa32 基因
大肠杆菌的存活率，初步揭示了该基因的功能。
1 材料与方法
1. 1 材 料
沙冬青种子采集自内蒙古阿拉善左旗。热胁迫
相关蛋白基因 AmHsa32 来自于本实验的沙冬青低
温干旱 EST 库。大肠杆菌 JM109、BL21 以及原核表
达载体 PET30a 均由本实验室保存;内切酶 XhoI、
KpnI 及 PMD18-T vector，荧 光 定 量 试 剂 盒
(SYBRRPremix Ex TaqTM kit)均购自日本 TaKaRa
公司;RNA 提取试剂盒购自北京科百奥生物技术有
限公司。
1. 2 生物信息学分析
利用网络生物信息数据库和软件进行分析。使
用 Protparam 分析沙冬青 AmHsa32 编码蛋白的氨基
酸序列组成和分子量，预测其等电点和亲水性等理
化性质;氨基酸序列同源性分析在 NCBI 利用
BLAST 进行;用 Predictprotein 预测其二级结构和疏
水性;用 SignalP4. 0 分析信号肽及其剪切位点。利
用 Bioedit 5. 0 及 MEGA 4. 0 构建进化树，Psort 预测
蛋白质的亚细胞定位，利用 ProFun 对蛋白质功能进
行预测(表 1)。
表 1 生物信息学工具网站
Tab． 1 Website of bioinformatics tools
Protparam http:∥web． expasy． org / protparam /
BLAST http:∥blast． ncbi． nlm． nih． gov /Blast． cgi
Predictprotein http:∥www． predictprotein． org /
SignalP 4． 0 Server http:∥www． cbs． dtu． dk / services / SignalP /
Psort http:∥www． psort． org /
NetPhos 2． 0 Server http:∥www． cbs． dtu． dk / services /NetPhos /
ProFun http:∥www． cbs． dtu． dk / services / ProtFun /
1. 3 沙冬青幼苗的非生物胁迫处理
将沙冬青种子播种于珍珠岩基质中，置于 HPG-
280BX 光照培养箱(25 ℃恒温、16 h 光照、70% 湿
度)内培养，约 10 d 后有 2 片叶片展开。取形态及
长势一致的沙冬青幼苗用于实验，留取对照组，其余
用作胁迫处理。热处理:沙冬青幼苗置于 40 ℃环境
下，1、2、4、8、12、24 h 取样。盐处理:沙冬青幼苗用
200 mL 1% NaCl 溶液处理，1、2、4、8、16 d 取样。干
旱处理:清除冬青幼苗根部的珍珠岩，置入黑暗环境
中的 15 cm × 15 cm 培养皿中，1、2、3、4、5 d 时取样。
低温处理:幼苗放入 4 ～ 6 ℃黑暗培养室中，1、2、4、
8、16 d 时取样。所有的处理均选择地上部分作为
研究材料。取样后液氮速冻，－ 80 ℃保存，以备提
取 RNA。
1. 4 qRT-PCR 分析
1. 4. 1 cDNA 合成
以经过胁迫处理及正常生长条件下的沙冬青幼
苗为实验材料，提取总 RNA，反转录获得 cDNA，以
eIF1 和 eIF3 作为内参基因，检测在非生物胁迫下
AmHsa32 的表达水平。cDNA 合成以 Oligo (dT)20
(Promega，USA)为引物，5 μg 总 RNA，及 1 μL 10
mmol /L dNTP mix (Takara，Japan)混匀后，65 ℃孵
育 5 min，置冰上速冷 1 ～ 3 min。再加入 1 μL RNase
Inhibitor (Takara，Japan) ，4 μL 5 × First-strand
Buffer，1 μL DTT(0. 1 mmol /L) ，1 μL SuperScriptTM
III RT (200 units /μL) (Invitrogen 公司 SuperScriptTM
III Reverse Transcriptase 试剂盒) ，50 ℃孵育 60 min，
70 ℃孵育 15 min。
1. 4. 2 qRT-PCR
荧光定量 PCR 分析中，设计特异性引物 AMHU
及 AMHD(表 2)。20 μL 反应体系:10 μL SYBR
Premix Ex Taq，7. 2 μL PCR-grade water，2 μL cDNA
(50 ng /μL) ，0. 4 μL 10 μmol /L 正向引物，0. 4 μL
10 μmol /L 反向引物。循环体系为 95 ℃ 30 s 一次;
95 ℃变性 5 s，60 ℃延伸 34 s，40 次循环，而后进行
溶解曲线测定，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，
83
第 5 期 王艳萍等:沙冬青热胁迫相关蛋白基因 AmHsa32 超表达提高大肠杆菌的抗热性
循环 1 次。每个样品重复 3 次。基因的表达水平由
CT值来呈现，反应结束后，进行融解曲线分析。采
用 2 － ΔCT算法分析实验结果，即 ΔCT = (CT． AmLEA14 －
CT． control)Time X。式中:CT． AmHsa32为 AmHsa32 基因的 CT
值;CT． control为 eIF1 和 eIF3 基因 CT值的几何平均数。
TimeX 为胁迫处理后取样时间点。所用荧光定量
PCR 仪 为 ABI PRISM7900HT Real-Time PCR
System。用 Excel 对数据进行统计分析，当 P ＜ 0. 05
时，基因表达差异明显。
表 2 沙冬青 Hsa32 基因表达引物
Tab． 2 Primers for the expression of AmHsa32 gene
引物 序 列
eIF1F 5-CTGACATGCGCCGTAGGAACG-3
eIF1R 5-CCCTGCTTATGCCAGTCTTTT-3
eIF3F 5-TTACATCGTCATCAAGGGTCG-3
eIF3R 5-ACAATTATGGGAAGACGGCAC-3
AMHU 5-AAAGTGGTGGTCTGAAATCTA-3
AMHD 5-TGTCTTCGCCTGCTTCTAAAC-3
AMHP 5-AggTACCATgTCAgCATACAgATggAAAAgC-3
AMHR 5-ACTCgAgTCAgAACAggAAATATgAggAACC-3
1. 5 AmHsa32 基因的原核表达
1. 5. 1 PET-HSA 原核表达载体的构建
设计引物 AMHR 和 AMHP (表 2) ，以含有
AmHsa32 的菌液为 PCR 扩增的模板。把扩增产物
连接 PMT － 18T 测序后，转化大肠杆菌 JM109，提取
鉴定为阳性的克隆与 PET30a 质粒双酶切，回收
PET30a 大片段和目的基因小片段，经 T4DNA 连接
酶连接后转化 JM109 菌株，筛选含有重组表达载体
PET-HSA 的抗性菌斑，测序后转化表达菌株 BL21。
将抗性筛选及 PCR 鉴定为阳性的几个菌落命名为
HPB。另外，提取 PET30 质粒转化菌株 BL21 作为
对照，空载体克隆命名为 BP。
1. 5. 2 AmHsa32 蛋白的诱导表达
取 10 μL HPB 菌液，加入含有 50 mg /L 10 mL
卡那霉素的 LB 液体培养基中，37 ℃过夜振荡培养。
第 2 天，在 10 mL 抗生素培养基中加入 100 μL 活化
的 HPB，继续振荡培养到对数生长中期(OD600 =
0. 5 ～ 0. 7)时加入 IPTG(200 mg /mL)至终浓度为
0. 3 mmol /L，37 ℃继续培养 3 ～ 4 h，1 2000 r /min 离
心 1 min 保留沉淀。缓冲液重悬菌液，超声波破碎
细胞后离心取上清进行 12% SDS-PAGE 电泳［7］。
1. 5. 3 转 AmHsa32 基因大肠杆菌抗热性测定
取经过 IPTG 诱导的菌液适度稀释后分装，在
50 ℃下分别处理 30、60、90、120 min，同时阴性对照
(空载体)做同样处理。取经过热处理的 HPB 和 BP
菌液涂于抗生素平板(卡那霉素)中培养过夜。次
日，统计存活的菌落数并比较数量差异，验证
AmHsa32 对大肠杆菌在高温条件下是否有保护功
能，细胞活力测定按照 Soto 等的方法［8］。
2 结果与分析
2. 1 HSA32 基因序列分析
AmHsa32 基因开放阅读框大小为 858 bp，编码
286 个氨基酸(图 1)。经 Protparam 预测，Hsa32 分
子质量为 32. 64 ku，等电点为 5. 89;不稳定参数为
41. 55，属于不稳定蛋白。序列中有 42 个负电荷氨
基酸残基(Asp 和 Glu)和 36 个正电荷氨基酸残基
(Arg 和 Lys)。脂肪系数(AI) :73. 60，总的亲水平
均系数为 － 0. 410，预测该蛋白属于亲水蛋白。
Predictprotein 预测蛋白二级结构，AmHsa32 的二级
结构由 38. 8% α-螺旋、16. 4%的延长链和 44. 8%的
环组成。
图 1 沙冬青 AmHsa32 与同源蛋白氨基酸序列的比对
Fig． 1 Conserved amino acid sequence of AmHsa32 and multiple sequence alignment with that of other plants
93
北 京 林 业 大 学 学 报 第 34 卷
2. 2 热胁迫相关蛋白的系统发生
为了进一步分析 AmHsa32 和其他植物中热胁
迫相关蛋白之间的进化亲缘关系，选取拟南芥、玉米
(Zea mays)、水稻、番茄、小麦的热胁迫相关蛋白序
列进行氨基酸同源性比较［9］。BLAST 分析表明，该
基因编码的氨基酸与拟南芥 Hsa32(AT4G21320)同
源性最高，达到 74%，与番茄(AY623905. 1．)同源
性 达 到 69%，与 玉 米 (EU964460. 1．)、水 稻
(O06G46900)、小麦(TaHsa32)的同源性分别达到
66%、66%、65%(图 1)。采用 BioEdit 及 MAGA4. 0
软件对 AmHsa32 与其他植物的氨基酸序列进行多
重序列比对，并构建系统进化树如图 2。结果表明，
沙冬青 AmHsa32 与拟南芥 HSA32 亲缘关系最近。
图 3 非生物胁迫下 AmHsa32 的表达水平
Fig． 3 Relative expression of AmHsa32 gene induced by different abiotic stresses
注:图中数据为平均值 ±标准误;柱形图上以 * (P ＜ 0． 01)、＊＊(P ＜ 0． 001)表示差异显著。
2. 3 沙冬青热胁迫相关蛋白基因 AmHsa32 的功能
预测
用 Psort 分析 AmHsa32 的亚细胞定位结果表
明，该蛋白可能存在于细胞质，细胞核，细胞骨架，及
叶绿体中。SignalP 4. 0 对 AmHsa32 蛋白的导肽预
测结果表明，该序列含有叶绿体转运肽(chloroplast
transitpeptide)、线 粒 体 目 标 肽 (mitochondrial
targeting peptide)及信号肽(signal peptide)的可能性
分别只有 4. 9%、28. 1%、6. 5%，其他导肽或无导肽
的可能性为 87. 9%。因此，该蛋白不可能含有上述
3 种导肽。经过 ProtFun 和 NetPhos 预测 AmHsa32
蛋白含有 10 个磷酸化位点，包括 6 个丝氨酸磷酸化
位点(8、29、84、174、240、271) ，2 个苏氨酸磷酸化位
点(128、230) ，2 个酪氨酸磷酸化位点(50、82)。
ProtFun 预测结果表明，该蛋白的功能可能是参与重
要的中间代谢，在植物遭受胁迫期间发挥信号转导
作用。BLAST 分析 AmHsa32 的氨基酸序列功能域，
结果表明，该蛋白属于 2--磷酸 3--磺基乳酸合成酶
蛋白家族。
图 2 沙冬青 AmHsa32 与其他含有同源序列
植物的系统进化关系
Fig． 2 Phylogenetic analysis of AmHsa32
and other reported proteins
2. 4 非生物胁迫下 AmHsa32 基因在沙冬青叶片中
的表达
qRT-PCR 分析表明，AmHsa32 基因在非生物胁
迫下的表达量均有不同程度的增加。在 1% NaCl 胁
迫处理后 AmHsa32 基因表达量先升高后下降，表达
最高点出现在第 1 天;40 ℃高温、干旱、低温胁迫
后，表达量均出现了明显升高(P ＜ 0. 01)。在干旱
条件下 AmHsa32 的表达最高点出现在第 5 天，并且
呈现出逐渐升高的趋势;在低温胁迫条件下的表达
最高点出现在第 16 天。AmHsa32 在 40 ℃热胁迫
下 1 h 的表达量约为对照的 25 倍，表达量明显高于
在其他胁迫条件下的表达量的最高值(图 3) ，这表
明热胁迫对 AmHsa32 基因的表达要比其他胁迫因
素诱导更直接、迅速。推测 AmHsa32 基因主要在防
04
第 5 期 王艳萍等:沙冬青热胁迫相关蛋白基因 AmHsa32 超表达提高大肠杆菌的抗热性
御热胁迫伤害中发挥作用，并参与热、盐、干旱、低温
胁迫的防御反应。
2. 5 AmHsa32 在大肠杆菌中的表达提高其抗热性
为进一步研究 AmHsa32 的生物学功能，将
AmHsa32 基因的 编 码 区 序 列 克 隆 到 表 达 载 体
PET30a 中，在其编码区两侧加入 KpnI 和 XhoI 2 个
酶切位点，将此扩增产物回收后连接 PMD18--
Tvector 转入大肠杆菌 JM109 感受态细胞中，经测序
验证、双酶切后回收大片段和目的小片段，T4DNA
连接酶连接，产物转化后筛选含有抗性的重组表达
载体 PET-HSA 菌斑。提取质粒酶切及测序验证后，
转化到表达菌株 BL21 中。将抗性筛选及 PCR 鉴定
为阳性的几个菌落命名为 HPB。取含有重组表达
载体 PET-HSA 的 BL21 菌株 HPB1、HPB2 及含有
PET30a 的 BP1、BP2 阴性对照，分别用 IPTG 进行诱
导 3 ～ 4 h，离心收集沉淀后重悬，利用超声波破碎细
胞后离心 15 min，取上清进行 SDS-PAGE 电泳。结
果表明，与无 AmHsa32 片段的阴性对照相比，
HPB1、HPB2 菌经过 IPTG 诱导后有 32 kD 的蛋白超
表达(图 4)。
选取 HPB1 及含有 PET30a 的阴性对照 BP1 菌
液进行 50 ℃高温处理，涂平板 37 ℃倒置培养(图
5、6) ，利用 Quantity One 软件统计菌落数目。表达
AmHsa32 的菌株 HPB 经过热胁迫处理 30 min 后，存
活率高达 40%，而经过同样处理的对照组 BP 菌株
图 4 AmHsa32 基因在 BL21 中的表达
Fig． 4 Heterologous expression of AmHsa32 in E． coli
注:HPB1、HPB2．不同的 BL21 克隆中表达的 AmHsa32
蛋白;BP1、BP2． 空载体 PET30a 在 BL21 中的表达;
“ +”．加 IPTG 诱导;“ － ”． 未加 IPTG 诱导;M． 标准蛋
白 Marker。
的存活率只有 26. 57%;当热处理 90 min 后，阴性对
照菌株只有 22. 1% 存活，而 HPB 菌株存活率达到
37%;胁迫 120 min 时，对照菌株 BP 存活率低于
0. 04%，而此时含有 AmHsa32 的菌株存活率为
0. 55%(P ＜ 0. 05)。统计结果经过双因素方差分析
表明，异源表达 AmHsa32 基因的菌株 HPB 与对照
BP 相比，在热胁迫下随着处理时间的增加，HPB 存
活率获得提高(P ＜ 0. 05)。
图 5 AmHsa32 对大肠杆菌在 50 ℃胁迫条件下存活率的影响
Fig． 5 Growth performace of E． coli transformants for PET-HAS constructs subjected to 50 ℃ treatments
3 结论与讨论
本研究将从沙冬青中获得的 AmHsa32 基因进
行了同源分析，发现 AmHsa32 与拟南芥 Hsa32
(AT4G21320)同源性高达到 74% (图 2)。氨基酸
功能域分析及与植物同类结构比对表明，AmHsa32
属于 2--磷酸 3--磺基乳酸合成酶蛋白家族。经过
ProtFun 和 NetPhos 预测 AmHsa32 有 6 个丝氨酸、2
个苏氨酸及 2 个酪氨酸磷酸化位点，暗示 AmHsa32
有可能参与调节细胞信号转导。蛋白质磷酸化是通
过磷酸化激酶将 ATP 的磷酸基转移至苏氨酸、丝氨
酸、酪氨酸等残基上实现的，这个过程在植物中与病
原入侵、温度等逆境胁迫的内外信号有关［10］。
Chitteti 等［11］鉴定了水稻根系盐胁迫中的上调磷酸
化的蛋白，其中包括温度胁迫相关的蛋白 HSP70
等，表明磷酸化位点的存在可能是逆境胁迫应答的
14
北 京 林 业 大 学 学 报 第 34 卷
图 6 转 AmHsa32 基因大肠杆菌在 50 ℃条件下存活率
Fig． 6 Survival rate of E． coli transformants for HPB
and BP constructs subjected to 50 ℃ treatment
基础。
Rizhsky［12］ 认 为 HSPs 具 有 交 叉 保 护 功 能。
Wang 等［13］克隆了番茄叶绿体 sHSP 基因，低温处理
后 sHSP 的过量表达提高了转基因番茄的抗寒性。
沙冬青 AmHsa32 基因在非生物胁迫下表达均能上
调(图 3) ，暗示 AmHsa32 可能参与抵御多种逆境胁
迫，这与 AmHsa32 参与植物重要的中间代谢功能的
预测结果相一致。热激反应本质上是瞬时的，HSPs
合成速率快、表达量高。沙冬青幼苗经热激时，
AmHsa32 基因的表达量在胁迫 1 h 时即达到高峰，
为对照的 25 倍，充分体现了上述特点。Zou 等［14］
研究水稻(Oryza sativa)热激时发现，HSP70 基因
(OsHSP58. 7)的表达量在热激 15 min 时增加，3 h
时出现第 1 个峰值，然后显著下降，12 h 时表达量再
次上升。AmHsa32 在持续热激时表达量也呈出波
动状态，这可能是热激蛋白负反馈调控的结果。
HSP70 的研究过程中，生物体受到热激后，热激转录
因子组装成三聚体后，启动 HSP70 基因转录，HSP70
大量增加后与 HSF 的结合会使 HSF 回复单体形式，
从而导致 HSP70 基因转录下降;因此，植物热激时
HSP 的表达量出现波动。植物对热胁迫的反应和适
应是一个复杂的过程，有些 HSPs 并不能单独抵御
热胁迫，大量热敏感突变体的分离鉴定说明其他基
因、热激转录因子、钙等也是植物获得耐热性所必须
的［15］，其中 HSF 在热激响应中发挥关键作用［16--17］。
沙冬青 AmHsa32 在胁迫条件下的表达机制，是一个
值得研究的问题。
原核细胞表达体系周期短，表达量高是应用最
为广泛的表达系统。由于缺乏真核生物蛋白表达所
需要的折叠酶和修饰酶，不能进行糖基化，甲基化等
修饰，因而在研究单一蛋白的功能等方面具有重要
作用。本研究将沙冬青 AmHsa32 基因转化到原核
细胞大肠杆菌(BL21) ，在诱导条件下目的基因得到
有效的表达(图 4) ，并且转基因菌株较对照菌抗热
性获得了明显提高(图 5、6)。Soto 等［8］研究认为，
sHSPs 通过稳定大肠杆菌中某些蛋白质如膜蛋白，
从而增加了细胞的活力。Yeh 等［18］将 sHSP16. 9 基
因转入大肠杆菌后提高了大肠杆菌的耐热性［18］。
高温诱导基因的表达在植物中涉及多个信号通路，
各类 HSPs 与 HSFs 相互协作，原核系统也可能存在
此类现象。Giese 等［19］发现 ClpB(HSP100 蛋白家
族)与 sHSP 在大肠杆菌中相互作用，并被体外实验
证实。因此，我们推测 AmHsa32 有可能结合了其他
蛋白，共同维持大肠杆菌在逆境下的正常生存。
热激蛋白是植物应对非致死性逆境胁迫生存和
适应的必需组成成分。如果利用基因工程增强 HSP
基因的表达，使植物能忍受非生物胁迫的影响，无疑
具有重要的经济意义;因此，进一步开展沙冬青
AmHsa32 基因转化林木花卉及作物的研究，不仅可
以获得抗逆性提高的新品种，产生经济及生态效益，
而且对深入揭示沙冬青抗逆性的分子机理也具有重
要意义。
参 考 文 献
［1］ DEROCHER A E，HELM K W，LAUZON L M，et al． Expression of
a conserved family of cytoplasmic low molecular weight heat-shock
proteins during heat shock stress and recovery［J］． Plant Physiol，
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(责任编辑 赵 勃
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