全 文 ：基金项目：浙江省自然科学基金(No. LY14C020004)和杭州师范大学启动经费(No. 2012QDL016)
收稿日期：2015-07-15 接受日期：2015-09-09
黄瓜生长素受体同源基因CsAFB和CsTIR在拟南芥中的转化与功能
表达
姚丽琴 陈哲皓 鲍林文 何露霞 王利琳*
杭州师范大学生命与环境科学学院，杭州310036
*通讯作者，wang_208@163.com
摘 要 植物生长素受体是生长素信号通路中的重要因子。基于前期克隆得到了黄瓜(Cucumis sativus)
生长素受体同源基因生长素信号F-box蛋白基因(auxin signaling F box protein, CsAFB)和转运抑制响应基
因 (transport inhibitor response, CsTIR)，为进一步证实和研究这 2个基因的功能，本研究利用拟南芥
(Arabidopsis thaliana)Col-0野生型和生长素受体编码基因功能缺陷突变体 tir1-1为材料，导入黄瓜生长素
受体同源基因，获取纯合转基因系。检测发现，拟南芥突变体 tir1-1转入CsAFB/TIR基因后根系发育、外
源生长素敏感性和细胞伸长反应均恢复至野生型水平。检测发现，野生型拟南芥中过量表达黄瓜CsAFB/
TIR，尤其是CsTIR基因，植株主根伸长明显受抑，侧根数量剧增，子叶下卷，叶柄上翘，真叶叶缘向离轴面
弯曲，顶端优势明显。本研究表明，CsAFB/TIR基因功能类似拟南芥TIR1基因，为黄瓜生长素受体同源基
因；过量表达该类基因通过增加生长素受体数量、扩大生长素信号的方式参与调控植物生长发育；为进一
步在黄瓜中研究生长素受体功能及作用机理提供理论依据。
关键词 生长素受体，CsAFB，CsTIR，表型恢复，基因功能
中图分类号 Q945.45 文献标识码 A
Transformation and Functional Expression of Cucumber (Cucumis
sativus) Auxin Receptor Homologous Genes CsAFB/CsTIR in
Arabidopsis thaliana
YAO Li-Qin CHEN Zhe-Hao BAO Lin-Wen HE Lu-Xia WANG Li-Lin*
College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China
* Corresponding author, wang_208@163.com
Abstract Plant auxin receptor is the key point in auxin signaling pathways. We had cloned the auxin
receptor homologous genes in cucumber (Cucumis sativus) in the previous work with the name of auxin
signaling F box protein (CsAFB) and transport inhibitor response(CsTIR). In order to verify and further explore
their function, we transformed them into both TIR1 loss- of- function mutant tir1- 1 and wild- type Col- 0
Arabidopsis thaliana and obtained homozygous transgenic plants, respectively. With the transformation of
CsAFB and CsTIR into tir1-1 mutant, the abnormal phenotypes of root system development, exogenous auxin
sensitivity and cell elongation response in tir1-1 could be rescued. Overexpression of CsAFB/CsTIR in wild-
type A. thaliana, especially CsTIR, led to inhibited elongation of primary root, increased numbers of lateral
roots, curled cotyledons, upward petioles, bending leaf margins towards abaxial surface and had obvious
apical dominance. This work illustrated that CsAFB/TIR functioned similarly as AtTIR1 in Arabidopsis. These
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2016, 24(2): 215~223
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2016.02.007
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
生长素(auxin)是最早被发现的一类天然植物
激素，对植物细胞伸长和分裂、下胚轴和根系统发
育、诱发植物向地性和向光性、维持叶片和花的形
态建成等植物发育过程都起到至关重要的作用
(Davies, 1995)。生长素通过一系列的信号转导途
径调节植物的生长发育，其特异性受体与生长素分
子的快速结合是该信号途径中一个首要的过程，因
此研究生长素特异性受体，以及与此相关的信号转
导途径和作用机制一直来都是植物生理学研究的
热点(皮冬梅等, 2011)。
早期研究发现，拟南芥 (Arabidopsis thaliana)
TIR1基因编码的蛋白具有抑制生长素极性运输的
作用，从而被命名为“转运抑制响应 1蛋白(trans-
port inhibitor response)”(Ruegger et al., 1997)。该
蛋白于2005年被确认为拟南芥生长素的直接受体
(Dharmasiri et al., 2005a; Kepinski, Leyser, 2005)。
随后的研究证实，拟南芥中同样隶属于F-box蛋白
家族的 AFB1(ayxin signaling F box protein 1)、
AFB2和AFB3具有类似的作用(Dharmasiri et al.,
2005b)。TIR1/AFBs家族作为植物生长素受体，通
过结合生长素分子，依赖泛素化途径降解Aux/IAA
蛋白，使其脱离与转录因子ARF的异源二聚，从而
调控各类生长素应答基因的表达，处于生长素信号
通路的起始(Ulmasov et al., 1999; Gray et al., 2001;
Tiwari et al., 2001; Tan et al., 2007)。
研究表明，拟南芥 TIR1功能的缺陷会导致细
胞分化水平降低、幼苗侧根数明显减少、细胞伸长
反应明显降低和对生长素的敏感性下降(Ruegger
et al., 1998)；而过表达TIR1会使拟南芥生长发育延
缓、分枝减少及不定根数量增加 (Chen et al.,
2011)。该类基因在其他物种中的同源基因也被证
实为生长素受体，参与了水稻分蘖数量、开花时间
和抗盐抗旱能力的调控(Xia et al., 2012)，并参与番
茄叶片形态颜色和果实生长发育的调控(杨春文
等, 2012)。
黄瓜(Cucumis sativus)雌雄同株，其生长发育过
程甚至结实产量和品质均受到生长素含量高低的
显著影响。本课题组前期的研究中分析了黄瓜的
全基因组序列，发现了两个基因与拟南芥 AtTIR1/
AFBs基因高度同源，推测其为生长素受体在黄瓜
中的同源基因，并依据相似性命名为 CsTIR和
CsAFB。对CsTIR和CsAFB蛋白功能域进行了预
测和进化分析，研究了其在幼嫩黄瓜和成年黄瓜不
同组织中的表达模式，克隆了这两个基因并将其导
入了过表达载体(陈哲皓等, 2013)。
为进一步证实和研究这2个基因的功能，本研
究利用拟南芥Col-0野生型和 TIR1基因功能缺陷
突变体 tir1-1为材料，通过农杆菌(Agrobacterium tu⁃
mefaciens)介导法导入黄瓜生长素受体同源基因，筛
选抗性植株，获取转基因纯合株系，观察黄瓜CsTIR
和CsAFB基因对拟南芥造成的影响；通过检测转化
后拟南芥突变体 tir1-1的表型恢复情况，以及野生
型的表型变化情况，来证实其作为黄瓜生长素受体
的事实，间接地研究分析其功能；为探究黄瓜生长
素受体的功能及作用机理，及进一步在黄瓜中开展
生长素受体的应用研究工作提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本研究所用的拟南芥(Arabidopsis thaliana)及
突变体 tir1-1均为Columbia-0野生型背景，种植于
杭州师范大学光照培养室。Trizol、DnaseⅠ 和
RNase抑制剂购于Takara宝生物工程(大连)有限公
司；2×Taq Mix、DM2000、DM10000分子量标记购
于北京康为世纪生物科技有限公司；逆转录试剂盒
购于北京全式金生物技术有限公司；B5基础盐培
养基购于 Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸
易有限公司；所有引物订购自生工生物工程(上海)
股份有限公司。
1.2 拟南芥育苗及培养
取适量的拟南芥种子，70%酒精浸泡 3 min，
3% NaClO溶液浸泡 10 min，无菌水冲洗5次，加入
无菌水静置 10 min，再用无菌水洗 2~3次；将种子
genes were probably auxin receptor homologous genes in cucumber. Overexpression of CsAFB/TIR could
enhance the number of auxin receptors, amplify auxin signal and regulate plant growth and development in A.
thaliana. This work will contribute to the further study of CsAFB/TIR functions and regulation mechanisms in
cucumber.
Keywords Auxin receptor, CsAFB, CsTIR, Phenotype rescue, Gene function
216
置于B5培养基上(每升含蔗糖 10 g,琼脂 8.8 g, pH
5.7)，透气医用胶带封口，4 ℃放置 2~3 d破除种子
休眠；继而放入光照培养室中培养。培养室的条件
为：22 ℃恒温，湿度 60%，光照强度是 10 000 lx，16
h光照/8 h黑暗长日照条件。培养室中培养7~10 d
后移苗土培。3~4周后植株形成大量花簇，即可用
于基因转化。
1.3 拟南芥转基因及筛选
拟南芥转基因使用花序浸润法(Clough, Bent,
1998)。相应农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)大量
振荡培养(陈哲皓等, 2013)，离心收集菌体并用浸
润液(含表面活性剂 silwet-L77的B5液体培养基,
pH 5.7)重悬。植株花簇在浸润液中浸润30 s，吸除
多余菌液，28 ℃黑暗条件下保湿培养1 d，取出进行
正常培养至收获种子。
载体筛选使用潮霉素(hygromycin)，筛选压为
12.5 mg/L。抗性植株移入土中收种，收获的种子
继续在含潮霉素的B5培养基上筛选，符合 3∶1抗
性分离比的视为单拷贝插入。挑选 10~12株收取
单株种子，下一代种子在含潮霉素的B5培养基上
培养，全部具备抗性的即为纯合转基因系。
1.4 转基因植株RNA的提取及半定量RT-PCR
验证
1.4.1 转基因植株RNA提取
使用 Trizol法提取培养皿上萌发的无菌幼苗
RNA，所有RNA样品均经过DNA酶处理提纯，电泳
分析并测定浓度。使用北京全式金公司(TransS-
cript First-Strand cDNA Synthesis)试剂盒获取cDNA。
1.4.2 半定量RT-PCR鉴定
PCR反应体系：cDNA模板1 μL，10 μmol/L上
下游引物(表 1)各 0.5 μL，PCR Premix Taq DNA聚
合酶 10 μL，无菌去离子水 8 μL。PCR反应程序：
94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，30个
循环；72 ℃ 10 min。内参为拟南芥管家基因多聚
泛素酶基因(ubiquitin5, UBQ5)，反应程序相同，循
环数 22。分别选取各自相对表达量最高的两个株
系进行下一步分析。
1.5 生长素处理及主、侧根统计分析
B5培养基上生长 5 d的幼苗被转移到添加相
应浓度的 IAA(0.03和 0.1 μmol/L)和 2,4-D (0.03和
0.1 μmol/L)的培养基上(记号笔标明主根位置)，继
续生长 5 d，并对主根的伸长量及侧根数进行统计
分析，拍照记录主侧根的生长状态。
1.6 不同温度处理后的下胚轴长度分析
表面消毒后的拟南芥种子点在B5培养基上，
4 ℃去休眠2 d后，分别在20和28 ℃光照培养箱10
h/14 h短日照条件下培养9 d，测定各株系的下胚轴
长度，拍照记录下胚轴的生长状态。
1.7 其他表型观察
表面消毒后的拟南芥种子点在B5培养基上，
4 ℃去休眠 2 d后光照培养箱中 16 /8 h长日照条件
培养 5 d，拍照记录子叶形态。幼苗移入土中后在
相同环境下培养，光照改为10/14 h短日照条件。每
日记录叶片数量和新生叶片的出现顺序和位置。
部分苗在短日照条件下生长至4周时，根据记录按
照生成的顺序剪取所有莲座叶拍照。其余部分分
5 d苗、10 d苗及4周苗分别拍照记录叶片形态。
引物名称
Primer name
qCsAFBF
qCsAFBR
qCsTIRF
qCsTIRR
qAtUBQ5F
qAtUBQ5R
序列(5~3)
Sequence
GGGCTGGTAATGTTGCTGTCA
GTTTTGTGGGGTCGAGGATG
ATGCCAACCTACTTCGTCGTG
GGAAGGAAGGTATGCAGGGAC
CGTGGTGGTGCTAAGAAGAGG
GAAAGTCCCAGCTCCACAGGT
用途
Purpose
CsAFB半定量检测上游引物 Forward primer for semi-q-PCR of CsAFB
CsAFB半定量检测下游引物 Reverse primer for semi-q-PCR of CsAFB
CsTIR半定量检测上游引物 Forward primer for semi-q-PCR of CsTIR
CsTIR半定量检测下游引物 Reverse primer for semi-q-PCR of CsTIR
AtUBQ半定量检测上游引物 Forward primer for semi-q-PCR of AtUBQ
AtUBQ半定量检测下游引物 Reverse primer for semi-q-PCR of AtUBQ
表 1 半定量RT-PCR引物
Table 1 Primers for semi-quantitative RT-PCR
CsAFB：生长素信号F-box蛋白基因；CsTIR：转运抑制响应基因；AtUBQ：多聚泛素酶基因
CsAFB: Auxin signaling F box protein; CsTIR: Transport inhibitor response; AtUBQ: Ubiquitin5
黄瓜生长素受体同源基因CsAFB和CsTIR在拟南芥中的转化与功能表达
Transformation and Functional Expression of Cucumber CsAFB/CsTIR in Arabidopsis thaliana 217
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
2 结果与分析
2.1 黄瓜生长素受体同源基因对拟南芥突变体
tir1-1的表型弥补
2.1.1 转基因植株的RT-PCR验证
为检测 CsAFB和 CsTIR基因是否为黄瓜中的
生长素受体，本研究通过根癌农杆菌介导的方法将
这两个基因异源转化拟南芥生长素受体TIR1功能
缺失突变体 tir1-1。最终获得了 2株 35S:CsAFB/
tir1-1，4株35S:CsTIR/tir1-1纯合转基因植株。对这
些植株的CsAFB与CsTIR基因半定量RT-PCR检测
结果如图 1所示：对照组突变体 tir1-1中检测不到
外源基因的表达，而转基因系中外源基因均能检测
到表达。其中 35S:CsAFB/tir1- 1 的两个株系中
CsAFB基因表达量较高(图 1A)，而 35S:CsTIR/tir1-1
的4个转基因植株中虽然CsTIR基因均有表达，但1
号和2号株系中的表达量更高，因此分别选取了各
自的1号2号两个植株进行下一步分析。
2.1.2 CsTIR/AFB基因表达引发 tir1-1主根长度和
侧根数恢复野生型状态
拟南芥 tir1-1突变体由于生长素受体TIR1功
能缺失，引发根的生长出现表型变异，典型表现有
主根长度增加，侧根数目减少 (Ruegger et al.,
1998)。如图 2A~F所示，tir1-1植株相比野生型主
根更长，侧根数量则相对较少(图 2B)；而各转基因
株系的根系相较 tir1-1植株则表现出主根长缩短和
侧根数量增加的趋势(图 2C~F)。测量了野生型
Col-0、tir1-1及 35S:CsTIR/AFB/tir1-1转基因系 10 d
幼苗的主根长度和侧根数目，如图 2G和H所示。
相比野生型，tir1-1植株的主根长度约为野生型
Col-0植株的 1.2倍，侧根数量则约降低了 40%；而
转入CsAFB与CsTIR基因的 tir1-1植株这两项指标
图 1 拟南芥突变体 tir1-1的 CsAFB/TIR转化株 CsAFB/
CsTIR基因表达验证
Figure 1 RT-PCR analysis of CsAFB/TIR expression in
transgenic A. thaliana with tir1-1 background
A：CsAFB基因表达检测；B：CsTIR基因表达检测；1~4：不同
转基因株系；AtUBQ5：管家基因对照
A: Detection of CsAFB expression; B: Detection of CsTIR ex-
pression; 1~4: Different transgenic lines; AtUBQ5: Housekeep-
ing gene as control
tir1-1 1 2
CsAFB
AtUBQ5
35S:CsAFB/tir1-1
A
tir1-1 1 2 3 4
35S:CsTIR/tir1-1
CsAFB
AtUBQ5
B
图 2 CsAFB与 CsTIR转化拟南芥 tir1-1突变体引发根
发育恢复正常
Figure 2 Rescue of root development in different CsTIR/
AFB transformed A. thaliana tir1-1 mutant
A：Col-0野生型；B：tir1-1突变体；C~F：各转基因系；Bar=
1cm；G：各株系主根长度统计；H：各株系侧根数量统计；*：
相较野生型植株差异显著(P＜0.05)
A: Col-0 wild type plants; B: tir1-1mutant; C~F: Different trans-
genic plants; G: Statistics of primary root length of different
plants; H: Statistics of lateral root number of different plants; *:
Significant difference compared with wild type plants (P＜0.05)
Col-0 tir1-1 1 2 1 2
35S:CsAFB/tir1-1 35S:CsTIR/tir1-1
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
主
根
长
度
/c
m
L
en
gt
h
of
pr
im
ar
y
ro
ot
Col-0 tir1-1 1 2 1 2
35S:CsAFB/tir1-1 35S:CsTIR/tir1-1
*
*
株系 Lines
G
0.0
4.0
8.0
12.0
16.0
Col-0 tir1-1 1 2 1 2
35S:CsAFB/tir1-1 35S:CsTIR/tir1-1
株系 Lines
H
*
*
侧
根
数
量
(根
/植
物
)
N
um
be
r
of
la
te
ra
lr
oo
t(
pe
r
pl
an
t)
218
均不同程度接近野生型，甚至在部分 35S:CsTIR/
tir1-1植株中主根长度进一步缩短，侧根数量进一
步提升(如株系 35S:CsTIR/tir1-1-1#)，表明，CsAFB
与CsTIR基因可以弥补 tir1-1突变体根发育表型，
且CsTIR基因表现出更为显著的作用效果。
2.1.3 CsTIR/AFB基因表达引发 tir1-1外源生长素
敏感性恢复野生型状态
作为植物生长素的受体, TIR1/AFBs家族的主
要功能是参与生长素信号通路，调控下游生长素应
答基因的表达。适当浓度的外源生长素能够抑制
拟南芥主根的伸长，因此可通过观察生长素处理下
主根伸长的抑制程度来检测植株的生长素敏感性，
而 tir1-1突变体则对外源生长素的敏感性显著下降
(Ruegger et al., 1998)。本研究进一步考察了这些
株系对 IAA和 2,4-D等植物生长素的敏感性。2,4-
D是一种人工合成的植物外源生长素，具有与生长
素相似的生物学功能，较高浓度下抑制植物主根的
伸长。
培养基上生长了5 d的幼苗被转移到含不同浓
度 IAA及 2,4-D的培养基上再生长 5 d，主根后 5 d
的相对伸长量如图3所示。野生型Col-0植株的主
根在接触外源过量 IAA及 2,4-D后伸长均受到抑
制，外源生长素浓度越高抑制程度越高(图 3A)。
tir1-1株系在各浓度 IAA及 2,4-D处理下主根伸长
的受抑制程度较低，相对根长比野生型更长(图
3B)，说明该突变体对外源生长素的敏感性较低；而
转入CsTIR/AFB基因的 tir1-1植株在各浓度生长素
处理下主根的抑制程度均与野生型类似(图 3C、
D)。分别以对照组中的植株主根伸长量为 100%，
则各株系在不同生长素浓度处理下的主根相对伸
长量统计结果如图 3E所示：各株系在 IAA处理下
主根受抑制程度较 2,4-D轻；0.1 μmol/L IAA处理
下 tir1-1植株主根相对伸长量仍有 60%以上，但转
基因系及野生型植株中只有对照的50%；0.1 μmol/L
2,4-D处理下 tir1-1植株的主根相对伸长量仍有
30%左右，但转基因系及野生型主根相对伸长量均
在10%以下(图3E)；甚至有较野生型更为敏感的株
系 35S:CsTIR/tir1-1-1#，在各浓度生长素处理下主
根的受抑程度反而比野生型更高(图3E)。
2.1.4 CsTIR/AFB基因表达引发 tir1-1细胞伸长反应
回复野生型状态
高温(28~30 ℃)通过生长素信号引发细胞伸
长，进而引发拟南芥幼苗下胚轴的伸长。20 ℃时，
野生型Col-0及TIR1基因功能缺失的 tir1-1突变体
下胚轴的长度无显著差异；但在 28 ℃相对高温条
图 3 CsTIR/AFB基因表达引发 tir1-1外源生长素敏感性
恢复野生型状态
Figure 3 Rescue of wild phenotype with auxin sensitivity
trait in different tir1-1 and CsTIR/AFB transgenic A. thali⁃
ana strains
A：Col-0野生型；B：tir1-1突变体；C：35S:CsAFB/tir1-1转基
因系；D：35S:CsTIR/tir1-1转基因系；比例尺=1 cm；E：各株系
主根相对伸长量统计；CK：对照；1：0.03 μmol/L IAA处理；
2：0.10 μmol/L IAA处理；3：0.03 μmol/L 2,4-D处理；4：0.10
μmol/L 2,4-D处理
A: Col- 0 wild type plants; B: tir1- 1 mutant; C: 35S:CsAFB/
tir1-1 transgenic plants; C: 35S:CsTIR/tir1-1 transgenic plants.
Scale bar=1 cm; E: Statistics of relative root elongation rate of
different plants; CK: Control; 1: 0.03 μmol/L IAA treatment;
2: 0.1 μmol/L IAA treatment; 3: 0.03 μmol/L 2,4-D treatment;
4: 0.1 μmol/L 2,4-D treatment
Col-0 tir1-1
CK 1 2 3 4 CK 1 2 3 4
35S:CsAFB/tir1-1 35S:CsTIR/tir1-1
CK 1 2 3 4 CK 1 2 3 4
A B
C D
0
25
50
75
100
1 2 3 4
Col-0
tir1-1
35S:CsAFB/tir1-1-1#
35S:CsAFB/tir1-1-2#
相
对
伸
长
量
/%
R
el
at
iv
e
el
on
ga
ti
on
ra
te
35S:CsTIR/tir1-1-1#
35S:CsTIR/tir1-1-2#
E
黄瓜生长素受体同源基因CsAFB和CsTIR在拟南芥中的转化与功能表达
Transformation and Functional Expression of Cucumber CsAFB/CsTIR in Arabidopsis thaliana 219
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
件下，野生型植株下胚轴有大幅的伸长，而 tir1-1的
下胚轴伸长则受到明显抑制 (Ruegger et al.,
1998)。本研究进一步检测了转基因植株下胚轴在
不同温度下的绝对长度。短日照条件，在不同温度
下培养 9 d，各株系下胚轴生长状态如图 4A所示。
各株系的下胚轴长度测定结果如图 4B所示，除突
变体外，野生型与转基因植株下胚轴在 28 ℃下均
有显著的增长(P＜0.05)，但相互之间绝对长度无显
著差异(P＞0.05)。因此可推测 CsTIR/AFB基因的
表达引发 tir1-1细胞伸长反应恢复至野生型状态。
2.2 黄瓜生长素同源基因过表达载体异源转化
野生型拟南芥
2.2.1 转基因植株的RT-PCR验证
为进一步检测CsAFB和CsTIR基因的作用，本
研究通过根癌农杆菌介导的方法将这两个基因的
过表达载体异源转化入野生型拟南芥，通过观察野
生型和转基因系在表型上和生理反应中的变化，来
揭示该类基因过量表达对植株造成的影响。本研
究获得了 7株 35S:CsAFB/Col-0纯合转基因植株，5
株35S:CsTIR/Col-0纯合转基因植株；利用黄瓜特异
性CsAFB与CsTIR引物，以拟南芥UBQ5基因作为
内参对转基因植株进行RT-PCR检测，结果如图 5
所示；转基因系中均能检测到外源基因，而野生型
对照中没有。并选取相对表达量最高的两个株系
进行下一步分析。
2.2.2 过表达黄瓜CsAFB与CsTIR基因进一步影响
拟南芥根的发育
拟南芥中过量表达TIR1基因的植株会产生大
量侧根(Perez-Torres et al., 2008)，本研究也发现，过
表达CsAFB/CsTIR基因不仅能使 tir1-1突变体的根
表型回复野生型状态，甚至也使部分植株根的发育
进一步受到反向影响。在野生型拟南芥中过表达
CsAFB/TIR基因的研究更为证实了这一点。测量了
35S:CsAFB/Col-0与 35S:CsTIR/Col-0各转基因系 10
d幼苗的主根长度和侧根数目可知，转基因株系的
主根相较野生型均有所缩短，侧根数则出现不同程
度的增加，尤其在35S:CsTIR株系中主根非常短，侧
根数则有 2倍以上的增加(图 6)。这一结果说明，
图 4 CsTIR/AFB基因表达引发 tir1-1高温细胞伸长反应
恢复野生型状态
Figure 4 Transformation rescue of the tir1-1 cell elonga⁃
tion under 28 ℃ with CsTIR/AFB transgenes in A. thaliana
A：不同温度下各株系下胚轴伸长情况。1：Col-0野生型；2：
tir1-1突变体；3：35S:CsAFB/tir1-1转基因植株；4：35S:CsTIR/
tir1-1转基因植株；Bar=5 mm；B：各株系在两个温度下的下
胚轴长度统计；*：相较20 ℃下差异显著(P＜0.05)
A: Photos of different plants under different temperature. 1:
Col-0 wild type; 2: tir1-1 mutant; 3: 35S:CsAFB/tir1-1 trans-
genic plant; 4: 35S:CsTIR/tir1-1 transgenic plant; B: Statistics
of hypocotyls length of different plants under different temper-
ature; *: P＜0.05, significant difference compared with 20 ℃
20 ℃
28 ℃
1 2 3 4
A
图 5 拟南芥野生型Col-0及其CsAFB/TIR转化株系基因
表达验证
Figure 5 RT-PCR analysis of CsAFB/TIR expression in
transgenic A. thaliana wild-type Col-0
A：CsAFB基因表达检测；B：CsTIR基因表达检测；1~6、8和
22：不同转基因株系；AtUBQ5：管家基因对照
A: Detection of CsAFB expression; B: Detection of CsTIR ex-
pression; 1~6, 8 and 22: Different transgenic lines; AtUBQ5:
Housekeeping gene as control
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
下
胚
轴
长
度
/c
m
L
en
gt
h
of
hy
po
co
ty
l
20 28
* *
*
* *
T/℃
Col-0
tir1-1
35S:CsTIR/tir1-1-1#
35S:CsTIR/tir1-1-2#
35S:CsAFB/tir1-1-1#
35S:CsAFB/tir1-1-2#
B
Col-0 1 2 3 4 5 8 22
Col-0 1 2 3 6 22
35S:CsAFB/Col-0
35S:CsTIR/Col-0
CsAFB
AtUBQ5
CsAFB
AtUBQ5
A
B
220
CsTIR和 CsAFB的功能并非完全一致，数据显示
CsTIR基因对拟南芥根的发育过程影响更大。
2.2.3 过表达黄瓜CsAFB与CsTIR基因影响拟南芥
叶的发育
在培养过程中发现，过量表达CsAFB与CsTIR
基因会对植株的叶片形态以及生长过程造成影响，
表现出多效性生长素相关表型，且35S:CsTIR/Col-0
植株比35S:CsAFB/Col-0植株中更为明显。生长在
培养基上5 d的35S:CsTIR/Col-0植株呈现出子叶下
卷和叶柄上翘的表型，但在 35S:CsAFB/Col-0植株
中并不显著(图 7A~C)；在土壤中生长 10 d的 35S:
CsTIR/Col-0植株均表现出一定程度的真叶叶缘(莲
座叶)下卷，叶柄略微伸长(图7D~F)；短日照4周后
各转基因植株叶片数量基本与野生型一致 (图
7G~I)，但对 4周苗按序剪下莲座叶的观察结果显
示，过表达CsAFB/TIR株系的叶边缘均向离轴面(背
面)明显卷曲且叶面积缩小；植株表现出强顶端优
势，绝大多数没有侧枝生长，与文献报道的过表达
拟南芥TIR1基因的情况相似(Chen et al., 2011)。
3 讨论
植物生长素受体参与生长素信号通路，调节下
游基因表达，从而影响植物的生长与发育过程。研
究生长素受体基因功能至关重要，但是在经济作物
黄瓜中尚未见此方面的研究报道。本研究探究生
长素受体及生长素信号通路在黄瓜发育过程中的
功能及作用机理，为生产实践提供理论依据。
本研究以黄瓜生长素受体CsTIR和CsAFB为
切入点，通过表型弥补研究，分别获取并验证了纯
合 35S:CsAFB/tir1-1和 35S:CsTIR/tir1-1转基因植株
(图1)；然后对各株系开展了根生长观察、植物生长
素 IAA与 2, 4-D的敏感性分析和下胚轴伸长情况
的测定。研究证实，在突变体拟南芥中导入黄瓜
CsTIR和CsAFB基因均可以使上述异常表型得以恢
复至野生型状态(图2~4)，说明这2个基因均在不同
程度上与拟南芥生长素受体基因TIR1具有类似的
功能，参与调控生长素介导的细胞分裂和细胞伸
长。这是继本课题组克隆黄瓜生长素受体同源基
因后(陈哲皓等, 2013)，进一步开展相关功能研究，
从侧面证实其是黄瓜中的生长素受体基因。
有研究表明，拟南芥 TIR1表达产物的过量积
累会放大生长素信号，使植株顶端优势明显、生长
发育延缓 (Chen et al., 2011)，进而影响侧根生长
(Perez-Torres et al., 2008)。本研究也发现部分35S:
CsTIR/tir1-1转基因植株表现出类似生长素信号放
大后产生的效应，并与野生型产生了表型差异。为
进一步验证黄瓜CsTIR和CsAFB基因的功能，在分
别获取并验证了纯合 35S:CsAFB/TIR/WT转基因植
株(图5)的基础上，对各株系开展了表型观察，记录
图 6 过表达CsAFB与CsTIR影响拟南芥根的发育
Figure 6 Overexpression of CsAFB and CsTIR affects
root development of A. thaliana
A：各株系根生长情况。Bar=1 cm；B：各株系主根长度统计；C：
各株系侧根数量统计；*：相较野生型植株差异显著(P＜0.05)
A: Root development of different plants. B: Length of primary
root of different plants; C: Statistics of lateral root number of
different plants; *: P＜0.05, significant difference compared with
wild type plants
Col-0 35S:CsAFB/Col-0 35S:CsTIR/Col-0
A
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
Col-0 1 3 22 6
*
*
*
*
主
根
长
度
/c
m
L
en
gt
h
of
pr
im
ar
y
ro
ot
35S:CsAFB/Col-0 35S:CsTIR/Col-0
株系 Lines
B
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
侧
根
数
量
(根
/植
物
)
N
um
be
r
of
la
te
ra
lr
oo
t(
pe
r
pl
an
t)
* *
*
*
Col-0 1 3 22 6
35S:CsAFB/Col-0 35S:CsTIR/Col-0
株系 Lines
C
黄瓜生长素受体同源基因CsAFB和CsTIR在拟南芥中的转化与功能表达
Transformation and Functional Expression of Cucumber CsAFB/CsTIR in Arabidopsis thaliana 221
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
了根系和叶片的生长发育过程。研究证实，CsAFB
和CsTIR过表达植株较Col-0野生型植株均表现出
主根变短、侧根增多、顶端优势增强、叶缘向离轴面
(背面)卷曲等性状，尤其是CsTIR过表达株系表型
效果较CsAFB过表达株系更为显著(图6~7)。本研
究结果显示，在拟南芥中过表达CsAFB与CsTIR基
因，增加了转基因植株的生长素受体数量，提高了
植株的生长素反应，通过扩大生长素信号来参与植
物生长发育调控。这一结论与诸多文献报道的过
表达生长素受体同源基因的情况相似(Perez-Tor-
res, et al., 2008; Chen et al., 2011; Xia et al., 2012;杨
春文等, 2012)。
本研究初步证实了 CsAFB与 CsTIR即为黄瓜
中的生长素受体基因，并证实其与拟南芥的生长素
受体TIR1具有类似的功能，为进一步探究其在黄
瓜中的功能及调控机理打下了基础。
4 结论
本研究通过考察黄瓜生长素受体同源基因
CsAFB和 CsTIR在拟南芥中的转化与功能表明，
CsAFB/TIR基因可使拟南芥突变体 tir1-1根系发育、
外源生长素敏感性和细胞伸长反应恢复至野生型；
过量表达黄瓜CsAFB/TIR基因可导致野生型拟南
芥出现多重生长素积累过量特征；两者中CsTIR基
因对拟南芥发育过程的影响更大。研究结果说明，
CsAFB/TIR基因功能与拟南芥生长素受体同源基
因类似，为进一步在黄瓜中研究生长素受体功能及
作用机理提供理论依据。
参考文献
陈哲皓 , 鲍林文 , 王利琳 . 2013.黄瓜生长素受体同源基
因的克隆、序列特征及表达模式分析 [J] .农业生
物技术学报 , 21(8): 931-939. (Chen Z H, Bao L W,
Wang L L. 2013. Cloning of homologous auxin recep-
tor genes in cucumber (Cucumis sativus L.), and analy-
sis of their sequence characteristics and expression pat-
terns[J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 21(8):
931-939.)
皮冬梅,刘悦萍 . 2011.植物生长素受体蛋白研究现状[J].生
物技术通报, 6: 7-11. (Pi D M, Liu Y P. 2011. Plant aux-
in receptor proteins research status[J]. Biotechnology
Bulletin, 6: 7-11.)
杨春文,唐宁,林东波,等 . 2012.玉米AFB2基因的克隆、表
达及功能分析 [J]. 热带作物学报, 33(6): 1068-1072.
(Yang C W, Tang N, Lin D B, et al. 2012. Expression
analysis of AFB2 in maize and function analysis in over-
expression transgenic tomato[J]. Chinese Journal of
Tropical Crops, 33(6): 1068-1072.)
Chen Z, Bao M, Sun Y, et al. 2011. Regulation of auxin re-
sponse by miR393- targeted transport inhibitor re-
sponse protein 1 is involved in normal development in
Arabidopsis[J]. Plant Molecular Biology, 77(6): 619-
629.
Clough S J, Bent A F. 1998. Floral dip: A simplified method
Col-0
35S:CsAFB/Col-0
35S:CsTIR/Col-0
图 7 过表达CsAFB与CsTIR影响拟南芥叶的发育(Bar=5 mm)
Figure 7 Overexpression of CsAFB and CsTIR affects leaf development of A. thaliana
A~C：各株系5 d幼苗子叶生长情况；D~F：各株系10 d苗叶片生长情况；G~I：各株系4周苗叶片排序(按照生长前后从左至
右排列)
A~C: Cotyledons of 5-day-old plants; D~F: Leaves of 10-day-old plants; G~I: Leaves of 4-week-old plants (Leaves were ar-
ranged from left to right in growing order)
222
for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidop⁃
sis thaliana[J]. Plant Journal, 16(6): 735-743.
Davies P J. 1995. Plant Hormones: Physiology, Biochemistry
and Molecular Biology[M]. 2nd ed, Kluwer Academic
Publishers, Dordrecht.
Dharmasiri N, Dharmasiri S M, Estelle M. 2005a. The F-box
protein TIR1 is an auxin receptor[J]. Nature, 435: 441-
445.
Dharmasiri N, Dharmasiri S, Weijers D, et al. 2005b. Plant de-
velopment is regulated by a family of auxin receptor F
box proteins[J]. Developmental Cell, 9(1): 109-119.
Gray W, Kepinski S, Rouse D, et al. 2001. Auxin regulates
SCFTIR1-dependent degradation of AUX/IAA proteins[J].
Nature, 414 (6861): 271-276.
Kepinski S, Leyser O. 2005. The Arabidopsis F- box protein
TIR1 is an auxin receptor[J]. Nature, 435: 446-451.
Pérez- Torres C A, López- Bucio J, Cruz- Ramírez A, et al.
2008. Phosphate availability alters lateral root develop-
ment in Arabidopsis by modulating auxin sensitivity via
a mechanism involving the TIR1 auxin receptor[J].
Plant Cell, 20(12): 3258-3272.
Ruegger M, Dewey E, Hobbie L, et al. 1997. Reduced naph-
thylphthalamic acid binding in the tir3 mutant of Arabi-
dopsis is associated with a reduction in polar auxin
transport and diverse morphological defects[J]. Plant
Cell, 9(5): 745-757.
Ruegger M, Dewey E, Gray W M, et al. 1998. The TIR1 pro-
tein of Arabidopsis functions in auxin response and is re-
lated to human SKP2 and yeast Grr1p[J]. Genes & De-
velopment, 12(2): 198-207.
Tan X, Calderon- Villalob L, Sharon M, et al. 2007. Mecha-
nism of auxin perception by the TIR1 ubiquitin ligase
[J]. Nature, 446(7136): 640-645.
Tiwari S B, Wang X J, Hagen G, et al. 2001. AUX/IAA proteins
are active repressors, and their stability and activity are
modulated by auxin[J]. Plant Cell, 13(12): 2809-2822.
Ulmasov T, Hagen G, Guilfoyle T J. 1999. Activation and re-
pression of transcription by auxin- response factors[J].
Proceedings of the National Academy of Sciences of the
USA, 96(10): 5844-5849.
Xia K, Wang R, Ou X, et al. 2012. OsTIR1 and OsAFB2 down-
regulation via OsmiR393 overexpression leads to more
tillers, early flowering and less tolerance to salt and
drought in rice[J]. Plos One, 7(1): e30039.
(责任编辑 张丽春)
黄瓜生长素受体同源基因CsAFB和CsTIR在拟南芥中的转化与功能表达
Transformation and Functional Expression of Cucumber CsAFB/CsTIR in Arabidopsis thaliana 223