全 文 ：上海农业学报 13 9 9 , 9 ( 3 ) : 6 6~ 7 0
A c t a A g r i c u l t u ar e S h a n g h a i
上海矮牵牛 (尸e t u n i a 匆b r i d a )病毒病的毒源鉴定 `
周正来 哀贤溶 汪树俊
(上海市农业科学院植物保护研究所 , 上海 2 0 1 1 0 6)
}蒋震同}
(上海农学院植保系 ` “ , 上海 Z o n ol )
摘 要 从花叶状矮牵牛植株上分离到两类病毒分离物 : ( 1 ) P 一 14 ; (2 ) P 一 3 和 P一 a : 。 根据鉴别
寄主反应和寄主范围 、 病毒粒体形态和大小 、传毒方式 、 体外稳定性 、 内含体的类型以及血清学反
应 , P 一 14 分离物被鉴定为黄瓜花叶病毒 (C M V ) , P一 a : 和 P一 3 被鉴定为芜芳花叶病毒 ( T u M V ) 。这
两类分离物在少数寄主上的症状有所差异 。 经鉴别寄主反应和血清学检测 ,表明黄瓜花叶病毒是
危害矮牵牛的主要病毒 。
关扭词 矮牵牛 ,黄瓜花叶病毒 ,芜菩花叶病毒
矮牵牛是一种草本花卉 ,栽培广泛 ,主要用来布置花坛 。 因其花期长 ,花色品种多样而深受
人们的喜爱 。 但因病毒病的严重危害 ,使其观赏价值大大降低 。 对上海几个公园矮牵牛的调查
表明 ,种子繁殖的发病率为 20 % ~ 30 % ,无性繁殖的发病率可高达 90 %左右 。 据国外报道 , 自
然侵染矮牵牛的病毒有 13 种和一种类菌质体 1[, 2〕 ,以黄瓜花叶病毒 ( C M V ) 、 烟草花计病毒
( T M V )
、烟草环斑病毒 ( T R S V ) 和蚕豆萎蔫病毒 ( B B Wv )为主 。 我国大陆只有对黄瓜花叶病
毒的简报 。 本文是上海市矮牵牛病毒病的病原鉴定报道 。
1
. 材 料 与 方 法
1
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1
. 标样来源 从 1 9 8 6年 12 月至 1 9 8 7 年 9 月 ,分别在杭州 、 上海各个公园先后采集 1 28
份呈花叶 、皱缩等症状的标样 , 以蚕豆 (V i c i a fa b a ) 、 可豆 ( v i g n a s i n e n s i s ) 、觅色禁 ( hC e n妒。己i -
u m a m a ar n t c` o l o r )
、 心烟叶 (N i c o t i a n a g l u t i n o s a ) 、 普通烟 (N i c o t i a n a t o ba c u m )作为鉴别寄主
谱 ,根据寄主反应 ,分离出两类病毒分离物 ,即 ( 1 ) P一 14 , ( 2 )P 一 a , 和 P 一 3 分离物 。 按常规方法纯
化后 , P一 1 4保存于心叶烟 ; P 一 a , 保存于雪里蒸 (刀 r a s s i c a j u n c e a v a r . ) ; P一 3 5 保存在矮牵牛上 。
L Z 试验方法
1
.
2
.
1 生物学特性的鉴定 病毒的寄主范围 、 体外稳定性以及蚜虫传毒试验均按常规方
法进行 。 种子传毒试验是在防虫温室内进行 ,苗期用间接酶联免疫吸附法 (I n id er ct E IL s A )和
离体蚕豆叶片接种法检测 。
1
.
2
.
2 病毒拉体特性鉴定 电镜观察的样品按常规方法进行 。 以 20 根 ( T M V )粒体宽度
的平均值作为标准 ,测量病毒粒体大小 。 病毒提纯是参照 L ot H , e t a l . 川方法进行 。
1
.
2
.
3 血清学试验 琼脂双扩散法按常规方法进行 , 免疫电镜修饰法是按照 S t eP h en
A H闭方法进行 。 抗血清的制备是参照梁训生闹方法 。 用部分提纯抗原测抗血清效价 ,用对流免
疫电泳法鉴定抗血清的纯度 。 Ig G 的提取是先用 35 %硫酸按沉淀 3次 ,再用 D E A E 纤维素柱
本文于 1 9 93一 04 一 08 收到 , 同年 05 一 29 收到修改稿 .
. 本文承院测试中心赵建华先生协助电镜工作 ,康 尧先生协助病毒离心提纯 ,在此一并致谢 。
, , 现更名为园林环境科学系 。
3 期 周正来等 :上海矮牵牛 (Pe t朋 ia 勺 bri da )病毒病的毒源鉴定
层析法 。 间接 E I S LA 参考 Sm i t h D B, e t a l . [`〕和 L o m m e l SA , e t a l . [ ,〕方法 ,试验中的标样研磨
液是 P B s 十 T irt on x 一 10 ,第一抗体为用 P 一 14 制备的抗体 Ig G ( 2陀 /m l ) ;第二抗体是冻干辣根
过氧化物酶标记的羊抗兔的 I g G (卫生部北京生物制品研究所 ) ,使用浓度为 1 , 1 0 0 倍 。
1
.
2
.
4 矮 牵牛优势病毒的确定及其对播牵牛的影响 用生物检测法和血清检测法检测
标样以确定优势病毒 ;在苗期和成株期接种优势病毒观察其对矮牵牛的危害 。
2
. 结 果 与 讨 论
2
·
l p
一 a ; 和 P 一 3 3 的鉴定
2
.
1
.
1 疚状反应和寄主范围 人工接种 9 科 3 5 种植物表明 , P一 a , 可侵染 6 科 14 种植
物 ; P 一 3 可侵染 6 科 12 种植物 。 它们都不侵染大豆 ( G ly ic n ` m a x) 、豌豆 (尸i su m s at ivu m ) 、 吏
豆 (V i g n a s i n e n s i s ) 、菜豆 ( p h a s e o l u s v u l邪 ir s ) 、 红三叶草 ( T r l’fO zi u m P r a t e n s e ) 、 白三叶草 ( T ,
of l i
u , 犷妙 e n : ) 、 普通烟 (N i e o ` i a n a t o ba c u , ) 、 黄化烟 ( N i c o t` a n a r , s ti c a ) 、 德 氏烟 ( N i c o t i a n a
d e b n勺 i ) 、假酸浆 ( N i c a n d ar P勿s a l o d e s ) 、 番茄 (勿 c oP e sr i c u m e s c u z e n t u m ) 、辣椒 ( C召户s i c u , a n -
n u u m )
、 曼陀罗 ( aD t u ar , t ar m o , i u m ) 、 黄瓜 ( e u c u m i: : a ti v u : ) 、 小麦 (丁八 t i c u m s a t i v u m ) 、 大麦
(万。dr e u m v u l邵 er ) 、 燕 麦 (八 v e n a , a t i v a ) 、 黑 麦 ( S e c a z。 。 e r e a l。 ) 、 、 长 叶 车前 ( p l a n t a g o
l a n c e o l a t e )
。 其它寄主侵染情况见表 1 。
2
.
1
.
2 体外杭性 P一 a : 和 P一 3 的体外抗性分别为 : 体外钝化温度 ( IT )P 为 50 ~ 60 ℃和
4 5一 5 5℃ ;稀释限点 ( D E P )为 1 0一 2~ 1 0一 3和 10 一 ’ ~ 1 0一 ’ ;体外存活期 ( L IV )为 2~ s d 和 3~ 6 d 。
夜 1
T . b le l
P
一
3 3和 P一 a : 在不同容主上的症状 .
Sy m P t o . on dl 份 e理 n t h佣 t s o f P一 33 an d P一 i
寄 主 名 称 寄主上的症状S v m p t o m o n h o s t s 寄 主 名 称 寄主上的症状S y i n p t o m o n h o s t s
P
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3 3 P
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蚕 豆
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青 菜
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雪里簇
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.
M o 。一花叶 M o s a i。 , S t一婚化 S t u n t , 5 . C hl 一系统褪绿 S ” t e面。 。 h1O r O. i。 , aL一慈性畏染 L a t e n t ,
.L C U一局部祖绿 L co al ch 生or 。 ` 。 , O一不俊染 N o ifn ce t io n , v . Br 一叶脉变栩 ve 饭 bor 初”叩 , L . L一局部枯斑 L。 -
e a l le
o io n
68上 海 农 业 学 报 ,卷
2
.
1
.
3 蚜传试验 P一 a , 和 p 一 3 3均能以桃蚜 (yM z u s P e sr i c a e )进行非持久性传毒 。
2
.
1
.
4 病毒拉体形态和大小 经电镜观察 P 一 a : 是略呈弯曲的线状病毒 , 其平均长度为
7 2 3 n m
,病毒粒体高峰在 70 。~ 7 4 0n m 之间 , P一 a l 粒体长度分布见图 1 ; P一 3 也是线状病毒 , 只
量取十多根病毒粒体 , 长度主要在 72 。~ 7 3 0n m 之间 ,与 P 一 a l 的相似 。
加25015
óoq日二`0一。ō七.d
4 8 0 5 00 62 0 6 60 70 0 74 0 78 0 8 2 0 90 0 9 20
粒体长度 p a r t i e l e l e n g t h (。 m )
圈 I P 一a : - . 粒体长度分布
F tg
.
I P
一 a x P a rt l e l e l e n g th d l s t r t b u t to n
2
.
1
.
5 病毒的内含体 用 P 一 a : 侵染的矮牵牛叶片做超薄切片时 ,在细胞质内有风轮状
和条状内含体存在 , P一 3 3 ,未做超薄切片 。
2
.
1
.
6 血汾学反应 经过抗血清吸附修饰后 ,在电镜下可以清楚地看到 ( T u M V )抗血清
对 P 一 a : , P 一 3 和 T u M V 一 3 的病毒粒体有强烈地修饰作用 ,而正常的兔血清对上述病毒粒体都
无修饰作用 。
P
一 a : 能通过磨擦接种和蚜虫非持久性传毒 ,粒体长度为 70 0 ~ 7 40n m ,病叶细胞内有风轮
状内含体 ,说明 P 一 a ; 是马铃薯 Y 病毒组 (P ot vy iur s G r o u p )的成员阁 ,又 因其能侵染典型 的
T u M V 鉴别寄主并产生相似的症状 ,其体外抗性与典型的 T u M V 相近 , 免疫电镜结果表明 :
P
一 a ,与 T u M V 有十分密切的血清学关系 ,因此 P一 a : 被鉴定为 T u M V 的矮牵牛分离物 。
P
一
3 在主要寄主上的反应与 P一 a : 是相似的 ;体外抗性 、 传毒方式 、粒体形态和大小等特性
与 P一 a : 也相似 ,而且 P 一 3 的病毒粒体也被 T u M V 的抗血清强烈地修饰 。 据此 , P 一 3 也被鉴定
为 T u M V 。
因 P一 a : 和 P一 3 在少数寄主上的症状反应有所差异 (表 1 ) ,所以认为它们是 T u M V 的不
同分离物 。
T u M V 分布于全世界 ,寄主范围广 , 可侵染 20 科 202 种植物 , 以十字花科为多 , 但至今 ,
国内外尚未有过 T u M V 自然侵染矮牵牛的报道 。
2
.
Z P
一
1 4 的鉴定
2
.
2
.
1 症状反应和寄主范围 人工接种 7 科 25 种植物 , P 一 14 能侵染其中的 2 种植物 ,
在蚕豆 、 觅色蔡上表现局部枯斑 ,在心叶烟 、 普通烟上表现花叶 ,在番茄上产生旅叶症状 ,侵染
矮牵牛表现花 叶 、皱缩和矮化 ,对四月蔓 ( B ar s ica 。 h ien sn :` va r . )是隐性侵染 。
3期 周正来等 :上海矮牵牛 (尸t en u沁 勺b八 d a)病毒病的毒源鉴定
2
.
2
.
2 体外杭性 经测定 , P 一 1 4 的 T I P 为 5 5 ~ 6 o C ; D E P 为 1 0一 3~ 1 0一 5 ; L I V 为 4 一
2
.
2
.
3 蚜传试验 桃蚜 、 棉蚜 (AP hi : go s s y P i幻均以非持久性方式传播 P 一 14 病毒 。
2
.
2
.
4 种子传毒试验 检测 30 株来自感染 P 一 14 分离物的矮牵牛幼苗 ,结果都是阴性反
应 ,说明 P 一 14 不能通过矮牵牛的种子传给后代苗 。
2
.
2
.
5 病毒拉体的形态和大 小 以普通烟为繁殖寄主提纯 P 一 14 分离物 , 电镜下可见均
一的等轴球状病毒 ,其大小为 28 一 30 n m 。
2
.
2
.
6 血清学反应 琼脂双扩散试验表明 : P 一 14 分离物与黄瓜花叶病毒 ( C M V ) 的抗血
清之间形成沉淀线 ,并与 CM V 和 C M V 抗血清间所形成的沉淀线相融合 , 说明 P 一 14 与 C M V
有相同的抗原决定簇 。
根据病毒粒体形态和大小 、 鉴别寄主反应以及血清学反应等 , P一 14 被鉴定为 C M v 。
2
.
3 抗血清制备 用 P 一 14 制备的免抗血清 , 经琼脂双扩散测定 ,其效价为 1 / 2 5 6 ;其纯度
检测结果表明 ,此抗血清不与健康普通烟产生沉淀线 。
2
.
4 矮牵牛优势病毒及其危害
2
.
4
.
1 优势病毒的确定 用 12 8 份标样接种到鉴别寄主上 ,在接种成功的 79 份 中 , 有
64 份是 C M v , 10 份是 T u M v ,用 间接 E IL s A 进一步对 田 间呈现花 叶症状的矮牵牛进行检
测 ,结果表 明 : 在被检测的 30 份标本中 ,有 21 份被 CM V 所侵染 (7 。% ) ,说明危害矮牵牛的主
要病毒是 CM V 。
2
.
4
.
2 优势病毒对矮牵牛的危害 在苗期和成株期接种 C M V ,结果见表 2 。 矮牵牛在苗
期和成株期都容易感染 C M V ,但苗期感染的不论在株高还是开花数方面都远远 比健康对照
差 ,成株期感染的比健康对照差 ,而 比苗期感染的要好得多 ,特别是在开花数方面更是如此 。
T a b l e Z
表 2 不同侵染时期对蟋牵牛的影响
E f f e e t o f C M V o n P e t u n i a lP a n t s a t d l f r e r e n t I n f e e t i o n s t a g e s
侵 染 期
n f e e t i o n s t a g e
侵 染 率 (% )
I n fe e t io n r a t e ( P e r e e n t )
株 高 (写 )
P l a n t h e ig h t ( p e r e e n t )
开 花 数 (% )
F lo w e r n u m b e r ( p e r e e n t )
苗 期
S e e d l in g s t a g e
成株期
M a t u r e s t a g e
N o t e
:
T h e p e r e e n t s o f f lo w e : n u m b e r a n d p la n , h e ig h t a r e e a le u la t e d b a s e d o n t h e h e a l t h y pl a n t e o n t r o l
本文报道了 自然侵染矮牵牛的黄瓜花叶病毒 (C M v )和芜著花 叶病毒 ( T u M V ) , 以 C M v
为主 。 C M v 早期侵染危害严重 , 防治矮牵牛病毒病的关键在于对苗期 C M V 的防治 。 如前所
述 , 无性繁殖矮牵牛发病率远高于种籽繁殖 ,而国内目前主要栽培种— 重瓣花品种和杂种主要是无性繁殖 。 因此 ,获得无毒的无性材料 ,可大大降低苗期的发病率 。
7 0上 海 农 业 学 报 , 卷
参 考 文 献
张健如 ,沈淑琳编 . 花卉植物病毒及病毒病 . 上海 : 上海科学技术出版社 , 19 9 1 , 1 91 ~ 1 96 .
G ib b s A J
.
V i r u s e s o f L e g u m e s
.
A u s t r a lia N a t io n a l U n i v e r s i t y
,
1 98 3
,
1 7 ~ 3 2
·
F r a n e k i R I B
,
M o s s o P D W
,
H a t t a T
.
C u e u m b e r M o s a i e V i r u s
.
CM I /A A B D e s e r ip t io n s o f P l a n t V i r u s e s
,
1 9 7 9
,
N o
.
2 1 3
-
S t e p h e n A H
.
M e t h o ds i n P la n t V i r o l o g y
.
B la e k w e ll cS i e n t if ie P u b lie a t io n s
,
o x fo r d
,
1 98 4
,
1 5 0 ~ 1 5 2
.
梁训生 ,张成良 , 张作芳编 . 植物病毒血清学技术 . 北京 : 农业出版社 , 19 8 5 , 5 7~ 7 1 .
S m i t h D B
,
D a v i s R F
.
I d e n t if ie a t i o n o f e u e u m b e r m o s a i e v i r u s f r o m V艺n e a m in o犷 in N e w Je r s e y . P l . D i s . , 19 8 6 , 7 0
( 1 1 )
:
10 5 6~ 1 0 5 9
.
L o m m e l S A
,
M e C a in A H
,
M o r r i s T J
.
E v a l u a t io n o f in d i r e e t e n z y m e lin k e d im m u n o s o r b e n t a s s a y f o r th e d e t e e t io n o f
p la n t v i r u s e s
.
p h y t o p a t h o l o g y
,
2 98 2
,
7 2 ( 8 )
:
2 0 2 5~ 10 2 2
.
H o l lin g s M
,
B r u n t A A
.
P o t y v i r u s G r o u p
.
GM I / AB B D e s e r ip t io n s o f P la n t V i r u s e s
,
1 9 8 1
,
N o
.
2 4 5
.
.占月巾召
J任已口
R E S E A R C H E S O N P A T H O G E N I D E N T I F I C A T IO N O F P E T U N I A
V I R U S D I S E A S E S I N S H A N G H A I
Z h o u Z h e n g l a i Y u a n X i a n r o n g W
a n g S h u iu n
( P l
a n t P ort
e c t i o n I n s t i t u t e
,
S h a n g h a艺A c a d e ” 妙 J
of A g
r i c u l t o ar l s c ie n e e s
,
S h a n g h a 艺2 0 1 1 0 6 , hC i n a
.
)
IJ`a n g z h e n t o n , }
(刀护 a rt m e n t of P l a n t P or t e c t i o , , S h a n沙 a i A g ir c u l t u ar l OC l e岁 , S h a n动 a i 2 0 1 1 0 1 , hC i n a . )
A b s t r a e t T w o k i n d s o f v i r u s i s o l a t e s t h a t a r e P
一
1 4 a n d P
一 a l , P
一
3 3 h a d b e e n i s o l a t e d
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.
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B a s e d o n
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, v i r u s p a r t ie l e m o r p h o l o g y a n d s i z e a s w e l l a s s e r o l o g ie a l r e a e t i o n
,
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一
1 4 w a s id e n t i f i e d a s e u e u m b e r m o s a i e v i r u s ( CM V ) a n d t h e i s o l a t e s P
一 a : a n d
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一
3 3 a s t u r n i P m o s a i e v i r u s ( T
u M V )
,
w h i e h h a d d i f f e r e n t s y m p t o m s o n a f e w h o s t s
.
B a s e d o n t h e i n d i e a t o r p l a n t s y m P t o m a n d s e r o l o g i e a l r e a e t i o n
, t h e s u r v e y i n t h e p e t u n i a
f i e ld s s h o w e d t h a t CM V w a s t h e p r e v a i li n g v i r u s i n p e t u n i a i n S h a n g h a i
.
K e y w o r d s P e t u n i a ; C M V , T u M V