全 文 ：侵染赤豆的黄瓜花叶病毒研究
康　霄　文
(湖南省作物研究所 , 长沙 410125)
摘　要　1996 年 7 月 ,从湖南长沙市郊赤豆病株上得到一病毒分离物 RB-1。人工摩擦接种 9科 27
种植物 , RB-1 能侵染 7 科 25种 , 在赤豆上引起花叶症状。提纯病毒粒体为球形 ,直径 28 nm。 在琼
脂双扩散试验中 , RB-1与 CMV 抗血清具有密切的血清学关系。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得其
衣壳蛋白亚基分子量为 28 kDa, 分析植物组织中 dsRNA , 发现有 4 条 dsRNA 条带 , 长分别为 3.3 ,
3.0 , 2.2 和 0.9 kb。根据以上结果 , RB-1 被鉴定为黄瓜花叶病毒(CMV)。
关键词　病毒学;赤豆;黄瓜花叶病毒;鉴定
　　赤豆(Phaseolus angularis)是我国广泛
栽培的豆科作物 。由于它的营养价值较高 ,
因而种植赤豆具有较高的经济效益 。近年
来 ,赤豆上病毒发生普遍 。为了弄清赤豆上
病毒的种类 ,笔者从长沙市郊种植的赤豆上
采集了病样 , 并进行了鉴定。现将分离物
RB-1的研究结果报道如下。
1　材料与方法
1.1　病毒来源
分离物 RB-1为 1996年 7月从长沙市郊
表现花叶症状的赤豆病株上采集获得 ,经昆
诺藜单斑纯化后繁殖保存于赤豆上 。
1.2　生物学特性测定
寄主范围 、体外抗性测定均按常规方法
进行[ 1] 。
1.3　病毒提纯及粒体形态的电镜观察
将 RB-1接种三生烟 ,12 d后采收病叶 ,
病叶加入 2 倍体积预冷的 0.5 mol L pH7.5
磷酸缓冲液(PB)(内含 0.01 mol L EDTA ,
0.1%巯基乙醇 , 2%Triton X-100), 匀浆 1
min ,再加 10%氯仿∶正丁醇(1∶1),匀浆 1 ～ 2
min , 4℃下 8 000 g 离心20 min。上清液加6%
PEG 0.1 mol L NaCl , 4℃ 搅 拌 4 h ,
　　　　　　8 000 g离心 20 min 。沉淀用 0.02 mol L PB
　　收稿日期:1998-05-06
(pH7.4 ,内含 0.01 mol L EDTA , 1%Triton X-
100)充分悬浮 , 8 000 g 离心 10 min 。吸出上
清液置于离心管 , 沉淀再悬浮离心 ,重复 2
次 ,合并上清液。上清液 78 000 g 超速离心 2
h ,沉淀用 0.02 mol L PB 悬浮 。悬浮液低速
离心后取上清液加入铺有 10 mL 25%甘油的
离心管中 ,78 000 g 超速离心 1.5 h ,沉淀用去
离子水悬浮即为提纯病毒 。病毒提纯液经
2%醋酸铀(pH5.0)染色后置 JEOL , JEM-
1200EX电镜下观察粒体形态 。
1.4　琼脂双扩散试验
采用琼脂双扩散法。CMV 抗血清由浙
江农业大学生物技术研究所周雪平惠赠 。
1.5　病毒外壳蛋白亚基分子测定
采用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。标
准蛋白为 Promega 公司产品 ,分子量分别为
磷酸化酶 97 400 u ,牛血清蛋白 66 200 u ,谷
氨酸脱氢酶 55 000 u ,卵清蛋白 42 700 u ,醛
缩酶 40 000 u ,磷酸酐酶 31 000 u ,大豆胰蛋
白抑制剂 21 500 u和溶菌酶 14 400 u。
1.6　感染组织中病毒双链 RNA提取
将 RB-1接种心叶烟 。5 d 后采收 10 g
病组织 ,置液氮中研磨 。然后每克组织加入
2倍体积的 2×STE(0.2 mol L NaCl ,10 mmol
L Tris , 2 mmol L EDTA , pH7.0), 0.3 mL 10%
SDS ,2倍体积的饱和酚 , 1倍体积的饱和酚
氯仿(1∶1),混合后温和振荡 30 min ,低速离
291999年第 1 期　　　　　　　　　　　　　作物研究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
心。上清液用无水乙醇调至含量为 17%,注
入用含 17%乙醇的 1×STE平衡过的纤维素
(CF-11)柱中(一般 2.5 g),然后用 80 mL 含
17%乙醇的 1×STE 洗柱 ,丢去洗脱液 ,再用
不含乙醇的 1×STE洗脱 ,丢去最初的 2 ～ 3
mL洗脱液 ,收集随后的 10 ～ 15 mL 洗脱液。
洗脱液用异丙醇沉淀后真空抽干 ,溶于适量
重蒸水中 ,取少量进行 1.2%琼脂糖电泳 ,电
泳时以λDNA Hind Ⅲ作分子量参照物。
2　结　果
2.1　RB-1在寄生植物上的反应
人工接种 9科 27种植物 , RB-1能浸染 7
科25种植物(表 1)。RB-1在豆科的绿豆和
赤豆上产生系统花叶症状 ,在蚕豆 、豇豆 、豌
豆和菜豆均产生局部枯斑症状 。
2.2　体外抗性测定
RB-1的稀释限点为10-3 ,致死温度为 55
～ 60℃,体外保毒期为 5 d。
2.3　病毒提纯和粒体形态观察
60 g 三生烟病叶提纯后得到 2 mL 提纯
病毒制剂 ,稀释 100倍后测定200 ～ 300 nm的
紫外吸收曲线。结果表明最高吸收峰为 260
nm ,最低吸收峰为 240 nm ,A260 =1.630 ,A280=
0.997 ,A260 A280=1.65 ,吸收曲线为典型的核
蛋白吸收曲线。提纯病毒制剂负染后在电镜
下可观察到大量球形粒子 , 平均直径为 28
nm(图 1)。
2.4　血清学反应
在琼脂双扩散试验中 , RB-1及 CMV 豌
豆分离物与 CMV 抗血清形成专一的沉淀线
(图 2), 且沉淀线相互隔合 , 说明 L-93 与
CMV具有密切的血清学关系。
2.5　病毒衣壳蛋白亚基分子量测定
经多次 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定 ,
RB-1的衣壳蛋白亚基有一条多肽链组成 ,大
小为 28 kDa(图 3)。
2.6　感染组织中 dsRNA分析
RB-1接种的三生烟病叶提取 dsRNA 后
电泳 ,发现有 4条 dsRNA 条带 , 长度分别为
3.3 ,3.0 ,2.2和 0.9 kb ,而健康叶未发现任何
dsRNA条带。这与 CMV 产生的 dsRNA条带
大小完全相符[ 2] 。由于未发现 0.3 ～ 0.4 kb
的 dsRNA 条带 , 说明该分离物不含卫星
RNA。
表 1　RB-1 在寄生植物上的反应及症状
植　物　名　称　　 症　状＊
豆　科　蚕　豆(Vicia faba) - LN
　　　　豇　豆(Vinga unguiculata) - LN
　　　　豌　豆(Pisum sativum) - LN
　　　　菜　豆(Phaseolus vulgaris) - LN
　　　　赤　豆(Phaseolus angularis) M O
　　　　绿　豆(Phaseolus mingo) - LN
　　　　扁　豆(Dolichus lablab) M YS ,LN
　　　　大　豆(Glycine mat) - -
藜　科　昆诺藜(Chenopodium quinoa) - LN
　　　　苋色藜(C.amarant icolor) - LN
　　　　甜　菜(Beta vulgaris) - LN
　　　　菠　菜(Spinacia oleracea) mM O
菊　科　百日菊(Zinnia elegans) M O
葫芦科　黄　瓜(Cucumis sativus) M O
　　　　丝　瓜(Luffa cylindrica) M YS
苋　科　千日红(Gomphvea globosa) O O
十字花科青　菜(Brassica chinesi s) - -
番杏科　番　杏(Tetragonia expensa) - YS
茄　科　番　茄(Lycopersicom
　 　　　　　　esculentum) FN , st Cr
　　　　辣　椒(Capsicum annum) M LN
　　　　普通烟(Nicotiana tabacum) M O
　　　　三生烟(N.tabacum-Samsum) M O
　　　　心叶烟(N.glutinosa) M , Cr VN
　　　　矮牵牛(Petunia hybridum) M O
　　　　大干生(Nicanclra
　 　　　　　　physolooles) M O
　　　　蔓陀罗(Datura stramonium) M Chr
伞形花科青芹菜(Apium graveolens) mM O
　　注:＊为系统叶症状 接种叶症状。 Chr:褪绿
环;Cr:皱缩;FN:蕨叶;LN:坏死斑;M:花叶;mM:轻
花叶;st:矮化;VN:脉坏死;YS:黄斑;-:不侵染;O:
无症带毒。
3　讨　论
从赤豆上获得一病毒分离物 RB-1 ,经寄
生范围测定 、粒体形态观察 、血清学试验 、外
壳蛋白亚基测定和 dsRNA分析 ,证明为黄瓜
花叶病毒 。dsRNA 分析表明该分离物不含
30 CROP RESEARCH　　　　　　　　　　　　　　　1999(1)
　　　　
图 1　RB-1分离物提纯病毒粒体形态(×58 000)
图 2　琼脂双扩散试验沉淀线
1.生理盐水;2.提纯 RB-1;3.提纯 CMV豌豆分离物
图 3　RB-1 分离物衣壳蛋白亚基组成及分子量
卫星 RNA。
周雪平等[ 3] 对豆科植物上分离的 CMV
分离物进行了比较 ,并根据豆科植物上的症
状反应 ,将CMV归为两个致病型 。根据 RB-1
在几种豆科植物上的症状 ,属致病型 1。
有关赤豆病毒尚没有作详细研究 。CMV
在豆科[ 3] 、葫芦科[ 4] 、十字花科[ 5] 和茄科[ 6] 等
作物上发生普遍。笔者从赤豆上鉴定出
CMV ,虽然没有作系统调查 ,但推测 CMV 也
是赤豆上的主要病毒病。
参　考　文　献
1　田　波 , 裴美云.植物病毒研究方法.北京:科学
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