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黄瓜花叶病毒赤豆分离物外壳蛋白基因序列分析及原核表达 *
刘 勇 周雪平 薛朝阳 李德葆
(浙江农业大学生物技术研究所 , 杭州 3 10 0 29 )
摘 要 : 根据已报道的黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因序列合成引物 , 经 RT 一P C R 扩增并克隆了我国黄瓜花
叶病毒赤豆分离物的外壳蛋白基因 。 序列分析表明 , 外壳蛋白基因全长 6 57 个核昔酸 , 编码 2 18 个氨基酸 ,
其核昔酸序列与黄瓜花叶病毒亚组 I 的分离物有极高的同源性 , 达 94 0m/ 95 % , 与亚组 H 的同源性仅为
74 %
~ 7 5%
。 将该基因片段克隆到 p G EM X 一 1载体中 , 转入 .E co 万后诱导表达 , 经 We s et m b ! ot 分析证明 , 该
基因已在大肠杆菌中正确表达 。
关键词 : 黄瓜花叶病毒; 外壳蛋白基因 ; 表达
黄瓜花叶病毒 ( C u e u m b e r m o s a i e v iur s , C M v ) 为雀麦花叶病毒科 田m川仍价介触e ) 黄瓜花叶病毒
属 (uC c uln 。~ ) 的典型种
` l] 。 病毒粒体球形 , 包裹有三种基因组 R N A ( R N A I一3) 和亚基因组 R N A
( RN A 4)
, 有的还含有第 5 种 RN A , 即卫星 R N A 。 C M V 为世界性分布病毒 , 能侵染包括单子叶和
双子叶植物在内的分属于 85 科 , 365 属中的 7 5 种植物 , 是寄主植物最多 、 分布最广 、 最具经济重
要性的植物病毒之一 2`j 。
C M V 在我国发生十分普遍 , 我国学者已从十字花科 、 茄科 、 豆科及葫芦科等 38 科 120 多种植
物上分离到 C M v `3,4] 。 在豆科植物上 , 我国已先后在菜豆 、 豌豆 、 甄豆 、 扁豆 、 蚕豆 、 大豆和花生
等多种豆科作物上发现有 C M V 侵染 `6 , , C M v 在有些豆科植物上发生相当普遍 5t] 。 作者曾对侵染豆
科作物的 C M V 分离物进行了系统的生物学比较 , 并根据豌豆 、 蚕豆 、 豉豆 、 扁豆等四种鉴别寄主
上的症状将这些分离物归为两个型 , 其中I型在这些植物上产生局部枯斑症状 , H型产生系统症状 5` ,。
为了弄清我国豆科植物上 C M V 分离物的基因结构 , 我们对属 I型的 c M v 赤豆分离物 R B 进行
了外壳蛋白基因克隆及序列测定 , 并进行了原核表达 。
1 材料与方法
1
.
1 材料 CM V 朋 分离物由周雪平等分离鉴定 “ , 。 质粒 p B l u e s e r ip t SK (简称 PB SK ) 、 .E c o1I’ 菌株
D H
,。 由本研究所提供 。 质粒 pG EM EX 一 l 和 .E c oI,’ 菌株 JM 1 09、 JM l o g ( D E 3 ) 由 p r o m e g a 公司提
供 。 所用的 P C R试剂盒 、 P C R产物纯化试剂盒 、 限制性内切酶 、 T4 D N A连接酶 、 c DN A合成试剂
盒 、 原核表达和 we st e m免疫检测试剂盒均购自 rP o m ge a 公司 。 测序试剂盒购自 P E公司 , 其它常用
化学药品为国产分析纯试剂 。
1
.
2 方法
1
.
2
.
1 病毒 ds R N A 提取 参照周雪平等方法从病叶中提取 ds R N A ’ 7] 。
1
.
.2 2 c DN A 合成及 P C R 扩增 根据已报道的 C M V C P 基因序列 `引 , 合成两个引物 , 夕端引物 C A
为 5 , A C G T C G A C C AT G G A C A AAT C 一 3 , , 3 ’端引物 C B 为 夕认 C e C G G G T C A G A C G G G A G 一 3 ’ , 在 5 ’
端引物中引入了 免八和 A c l 酶切位点 , 3 ’端引物中引入了 mS al 酶切位点
。
取 5 林L d s R N A 溶液 ( l 林g/ 林L ) , l 0 00C 水浴 5 m i n 后立即置泳上 , 取 l 匹 变性 d s R N A 为模板 , 加
入 .0 5 陀 引物 C B , 然后按 rP o m eg a 公司的 c D N A 合成试剂盒合成 c D N A 第一链 , 取第一链产物 1
泌 为模板 , 加入引物 C A 和 C B 各 l 林L ( 2 5 n g/ 林L ) , dN T p Z泌 ( 10 m m o l几 ) , 10 倍缓冲液 5 林L , 2
林L M g C 12 ( 2 5 m m o l/ L ) , l 单位 aT q 酶 , 并加灭菌水至总体积 5 0 泌 , 通过 p e r k i n 一 E lm e r C e ut s D N A
T h e mr a l C y e l e
r 进行 p C R 扩增 , 扩增条件 9 4 oC , 5 5 oC和 7 2 oC 各 1 m i n , 共 3 0 个循环 , 最后一轮循环
* 浙江省自然科学基金及省青年人才专项资金资助项 目
刘 勇: 男 , 咒 岁 , 博士 , 副研究员 , 研究方向为植物分子生物学 , 现工作地址 : 湖南省蔬菜所 , 长沙 4 10 125
收稿日期 : 1 99 8一0 6一 3 0

第 1期 刘 勇等 : 黄瓜花叶病毒赤豆分离物外壳蛋白基因序列分析及原核表达 5 3
A n 1 P
Sm a l X h
in e 11
P C M V
一
RB 29
S a l
’
I 5 1 11妞 I
P C M V
一
R B S
Sm a S
a l
图 3 重组质粒 PCM V一 R B 29和 p CM V一 R B S的物理图谱
F i g 3 M ap
o f er c om b i n an t P las m i d s P CM V
一
R B 29 an d PC M V
一
R B S
A U G GA CAA A U CU GA AU CA A C CA G U G C C G G U C GU A A C C GU C GA C GU C G U C C G C GU C G U G G U U C C C G CU C C G 7 0
M D K 5 E 5 T 5 A G R N R R R R P R R G 5 R 5 A 2 4
C C C C C U C C U C C G C GGA U G CU AA C U J[ UA GAGU C C UGU C GC AA C A G CU U U C G C GA CU UA A U A A GA C G U U A G C 1 4 0
P 5 5 A D A N F R V L 5 Q Q L 5 R L N K T L A 4 7
A G CU G G U C G U C CA A C CA U UA A C C A C C CA A C CU U U G U G G G U A GU G A A C G CU GUA GA C C U G G GU A C A C GU U C 2 1 0
A G R P T 1 N H P T F V G 5 E R C R P G Y T F 7 0
A CAU C UAU A A C C C U U A A G C CU C C A A A A A U A GA C C G C GGG U CU U A U U A U G ( ;U AA八 A G GU U G CU G CU U C CU G 2 8 0
T 5 1 T L K P P K 1 D R G 5 Y Y G K R L L L P D 9 4
A U U CA G U C A CU G A GUU C GA U A A G A A G CU U G U U U C G C G CA U U C A A A U U C GA G U U A A U C CU U U G C C GAAA UU 3 5 0
5 V T E F D K K L V 5 R 1 Q 1 R V N P L P K F 1 1 7
U GA U U C U A C C GU G U G G G U GA CA G U C C GU A A A GU U C CU G C C U C C U C G G A C U U A U C C G U U G C C G C CA U C U CU 4 2 0
D 5 T V W V T V R K V P A 5 5 D L 5 V A A 1 5 1 4 0
G CU A U GU U U G C GGA C G G A G C C U CA C C GGU A CU G G U U U A U C A G U A C G C C G CA U CU G G A GU C CA A G C C A A CA 4 9 0
A M F A D G A 5 P V L V Y Q Y A A 5 G V Q A N N 1 6 4
A CA A G U U GU U GU A U G A U CU U U C G G CG A J[ G C G C G C U G A U A U U G G C GA C A U GA GA A A G U A C G CU G U C C U C GU 5 6 0
K L L Y D L 5 A M R A D 1 G D M R K Y A V L V 1 8 7
G U A U U C A A A A GA C GA U A C G CU C GA G A C G G A C GA G C UA GU A CU U CA U G U C GA CA U U G A G CA C CA G C G U A U U 6 3 0
Y 5 K D D T L E T D E L V L H V D 1 E H Q R 1 2 1 0
C C CA CA U CU G G G GU G` U C C C A GU C U G A 6 5 7
P T 5 G V L P V ( 2 1 8
图 4 c M v RB 分离物 C P基因及编码的氨基酸序列
F i g
.
4 N u c le o ti d e se q u e n e e o f t he c o at P ro te i n ge n e a n d d e d u e e d am i
n o a e i d se q ue n e e o f CM V R B
将 RB 分离物 C P 基因与我国已报道的其它 C M v 分离物的 c P 基因相比 ,除与徐平东报道的 X B
同源胜较低外 (核昔酸同源哇为 76 % ) , 其余均有较高的同源性 (达 92 % 一95 % ) 。
.2 3 c P 基因的原核表达
p C M V
一
R B 29 用 月尸a l和 oE c IR 酶切后回收片段 , 以正确的阅读框架组装到 pG EM X 一 1的 T 7 基因
10 中 , 构建了能在 .E c o li 中表达的原核表达载体 pG 一 R B1 5 。 预计的表达产物为融合蛋白 , 包括 7T
基因 10 的 28 5 个氨基酸和 C M v c P 基因的 21 8 个氨基酸 , 其大小约为 56 kD 。 重组质粒 p G 一 R B1 5
转入高效表达菌株 .E c oj,’ JM 109 (D 3E ) 中 , 经 IP T G 诱导后提取菌体水溶性蛋白 , S D S 聚丙烯酞

第 1期 刘 勇等 :黄瓜花叶病毒赤豆分离物外壳蛋白基因序列分析及原核表达
参 考 文 献
1 Mur p卜 A F, F au q u e t C M , B ihs o P D H L , e t a l . V i ur s aT x o no m y . SP r in g e -r v e r lag w i e n , N e w yo r k , 199 5 . 34 1一 34 7
2 K a Pe r J M
,
W a t e rw o hrt H E
.
C u e u m o v i ru s
.
I n : H an d b
o o k o f P lan t v iru s i n fe e ti o n s an d
e o m P a r a t iv e d i ag n o s i s
,
K u r s t a k
,
E e d
.
E l s e v i e rN/ o hrt
一
H o l lan d B io m e d ie a l P er s s
,
19 8 1 : 2 5 7一 33 2
3 徐平东 . 中国黄瓜花叶病毒的亚组及其性质研究 . 福建农业大学博士学位论文 , 1997
4 周雪平 , 刘勇 , 薛朝阳 , 等 . 十字花科蔬菜上黄瓜花叶病毒分离物的比较研究 . 微生物学报 , 19 97 , 37 (3) : 2 03一 21 1
5 周雪平 , 淮祖芹 , 方中达 . 豌豆病毒病病原研究 . 植物病理学报 , 19 94 , 24 ( 3) : 2 07 一2 12
6 周雪平 , 蹼祖芹 , 方中达 . 豆科植物上分离的黄瓜花叶病毒 (C M V) 五个分离物的比较研究 . 中国病毒学 , 1994 ,
9 ( 3 ) : 23 2一 2 38
7 周雪平 , 徐志新 , 徐静, 等 . 侵染丝瓜的黄瓜花叶病毒研究 . 华南农业大学学报 , 19 95 , 16 (2 ): 74 一79
8 Sh int ak
u M
.
C o at P ort
e i n g e ne s e q u e n e e o f wt o e u e u m b e r m o s a ie v i ur s s t r a in s r e
v e a l a s in g le am i
n o ac i d e h an g
e e o r er l at in g
w iht e h lo or s i s i n d u e t io n
.
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,
72 : 25 86一 258 9
9 P al u k ia t is P, oR
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D ie t z g e n R G
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A d v a n e e s i n V i ur s R e s e ar e h
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4 1: 282一 34 8
10 谢响明 , 于嘉林 , 刘仪 . 核酸保护试验在黄瓜花叶病毒株系鉴定中的初步应用 . 中国病毒学 , 19% , 11 ( l) : 7 0一 76
11 叶寅 , 徐雷新 , 田波 . 一个黄瓜花叶病毒强株系的外壳蛋白基因的合成 、 克隆 、 序列分析和表达 . 科学通报 , 19 91 ,
17 : 1340~ 13 44
12 李华平 , 胡晋升 , K el y B a r yr , 等. 黄瓜花叶病毒香蕉株系的衣壳蛋白基因克隆和序列分析 . 病毒学报 , 19% , 12
(3 ) : P2 3 5一 242
S e qu
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