全 文 ：华北农学报·2014，29 ( 2 ) : 22 -26
收稿日期:2014 － 02 － 03
基金项目:天津市科技支撑计划项目(12ZCZDNC00100)
作者简介:傅 扬(1988 －) ，女，天津人，在读硕士，主要从事高粱遗传改良研究。
通讯作者:孙守钧(1961 －) ，男，山东文登人，教授，博士，主要从事饲用作物遗传改良研究。
过表达高粱 SbAGL6 基因对拟南芥花期转换的影响
傅 扬，丁 博，罗 峰，吕芳芳，谢晓东，孙守钧
(天津农学院 农学系，天津 300384)
摘要:以甜高粱品种 Ｒoma为试验材料，在生物信息学分析基础上，采用逆转录-聚合酶链式反应(ＲT-PCＲ)方法，
克隆了 SbAGL6 基因的编码区序列。序列分析表明，SbAGL6 基因编码具有 256 个氨基酸的转录因子，在其 N 端含有
MADS-box结构域，中间存在 K-box结构域，与拟南芥 AtAGL6 等直系同源基因在核苷酸和氨基酸序列上都有较高的相
似性。为验证其生物学功能，采用 Gateway的方法，构建了 SbAGL6 基因的可诱导过表达载体。利用农杆菌介导侵染
拟南芥的方法，获得了 SbAGL6 基因的转基因拟南芥植株，并对其进行了功能鉴定。结果表明，未施加诱导物地塞米
松 Dex时，转基因拟南芥与野生型生长一致，而施加 DEX后，转基因植株比野生型提早开花，SbAGL6 基因在调控植物
花期转换中发挥了作用。
关键词:高粱;SbAGL6;拟南芥;花期转换
中图分类号:S514 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2014)02 － 0022 － 05
Effects of Overexpression of SbAGL6 Gene on Floral
Transition in Arabidopsis Plants
FU Yang，DING Bo，LUO Feng，L Fang-fang，XIE Xiao-dong，SUN Shou-jun
(Department of Agronomy，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China)
Abstract:Floral transition is a crucial stage for establishment of life cycle and agronomic traits in sorghum．
But the mechanism underlying this biological process remains largely elusive． In this study，we cloned the coding
sequence of putative SbAGL6 genes from sorghum cultivar，Ｒoma，by in silico sequence analysis and reverse-tran-
scription PCＲ． The DNA sequence alignment revealed that SbAGL6 gene encoded a transcription factor with 256 ami-
no acids which included a MADS-box domain in the N-terminal and a K-box domain in the middle． SbAGL6 gene
shared high sequence similarity with AtAGL6 gene，indicated the functional similarity between two genes． To clarify the
biological functions of SbAGL6 gene，we constructed an inducible over-expression vector for SbAGL6 based on Gateway
cloning technology，and transformed SbAGL6 over-expression cassette into Arabidopsis plants． The phenotypic analysis
demonstrated that transgenic plants flowered earlier than the wild type after application of inducer Dexamethasone
(Dex)． But transgenic plants would show no difference from wild type plants under mock treatment． These results sup-
ported our proposition that SbAGL6 gene might play an important role in controlling flowering time in sorghum．
Key words:Sorghum;SbAGL6;Arabidopsis thaliana;Floral transition
植物的花期转换过程受一系列转录因子的调
控。对模式植物拟南芥的研究揭示，MADS 转录因
子在这一生物学过程中发挥重要调控作用。MADS
盒转录因子基因家族有 107 个成员，但人们对其中
多数基因的功能尚不了解。通过进化树分析，这些
MADS盒基因被划分为 5 个亚家族(称为 Mα、Mβ、
Mγ、Mδ 和 MIKC)［1 － 3］。与开花有关的 MADS 盒基
因全部属于 MIKC 亚家族。AGL6 及其同源基因属
于 MIKC亚家族的 AP1 /AGL9 组。在酵母菌双杂交
系统中，蛋白-蛋白互作图谱显示拟南芥 MIKC 亚家
族 MADS盒蛋白各具有特异的蛋白互作模式，其中
AGL6 与 AP1 和 SEPs 的蛋白互作模式相似，说明
AGL6 与 AP1 和 SEPs 具有相似的功能［2，4］。AGL6
及其同源基因已从不同种类的植物中得以克隆，如
2 期 傅 扬等: 过表达高粱 SbAGL6 基因对拟南芥花期转换的影响 23
挪威云杉［5］、辐射松［6］、矮牵牛［7］、水稻［8］、玉米［9］、
麻竹［10］;文心兰［11］、小麦［12］、黑麦草［13］。迄今为
止，对它们的功能和作用机制却了解甚少。目前在
基因序列、表达模式方式上，以及 AGL6 类基因的转
化表型，都说明 AGL6 类基因参与了开花诱导和花
器官发育。现有的解释花器官发育的分子机制是
ABCDE模型，在正常花器官发育的过程中，存在 A、
B、C、D、E 5 类花器官特征基因，A 类［如 APETALA1
(AP1)］、E 类［如 SEPALLATA1 /2 /3 /4(SEP1 /2 /3 /
4) ］基因同时控制萼片的发育;A、B［如 APETALA3
(AP3) ］、E类基因同时控制花瓣发育;B、C［如 AGA-
MOUS(AG) ］、E类基因同时控制雄蕊发育;C、E 类
基因同时控制心皮发育;D［如 SEEDSTICK(STK) ］、
E类基因同时控制胚珠发育。这 5 类控制花发育基
因中均没有涉及 AGL6 类基因，因此，对 AGL6 类基
因功能和作用机制的研究，将会使花发育的 ABCDE
模型更加完善。
高粱在农业生产中有广泛的用途，花期转换特
性是高粱个体发育和农业生产应用研究中关注的重
要性状。但目前对高粱开花诱导的调控机制知之甚
少，因而很难进行优异材料的分子标记辅助选择育
种和相关基因的遗传转化，制约了对高粱开花期性
状的遗传改良。本研究对 AGL6 基因进行分析，研
究该基因的生物学功能，为解析高粱开花的分子机
制奠定基础。
1 材料和方法
1． 1 材料和试剂
本试验所采用的植物材料为甜高粱品种 Ｒoma
［Sorghum bicolor (L．)Moench］，转基因植物材料为拟
南芥(Arabidopsis thaliana L．) ，生态型为 Columbia。
本试验所用的大肠杆菌为 DH5α(天津-布里斯
托研究中心保存) ，农杆菌菌株为 GV3101(天津-布
里斯托研究中心保存) ;克隆载体为 pGEM-T easy
(购自 Promega) ，表达载体为 pDONＲ (amp)和
pKIGW(天津-布里斯托研究中心保存) ，植物总
ＲNA 的提取采用 TIANGEN试剂盒，cDNA 的合成使
用 Invitrogen 的 SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthe-
sis System for ＲT-PCＲ，测序在北京博迈德有限公司
完成。
1． 2 引物设计
以模式生物的 AGL6 序列作为查询序列，检索高
粱数据库，以得到的序列为基础，设计上游引物
SbAGL6-F:5-ATGGGGAGGGGACGAGTTGAG-3，下游
引物 SbAGL6-Ｒ:5-TCAAAGAACCCATCCCAGC-3。
1． 3 植物总 ＲNA提取及目的基因克隆
对高粱叶片取材后液氮冷冻，储藏在 － 80 ℃
冰箱中备用。总 ＲNA 提取和 cDNA 合成均按说明
书进行。以反转录获得的 cDNA 为模板，SbAGL6-F、
SbAGL6-Ｒ 为引物进行 PCＲ 扩增，反应体系为 cDNA
模版 0． 3 μL，10 × Taq Buffer 1 μL，10 mmol /L dNTPs
0． 2 μL，10 μmol /L上下游引物各 0． 5 μL，Taq DNA
聚合酶 0． 1 μL，ddH2O 7． 4 μL，反应条件为 94 ℃
预变性 3 min;94 ℃ 变性 30 s，60 ℃ 退火 30 s，
72 ℃延伸 1 min，30 个循环;72 ℃ 延伸 5 min。
PCＲ 产物经 1%琼脂糖电泳分离后回收纯化，回收
片段连接到 pGEM-T easy 载体上，并转化到感受态
大肠杆菌 DH5α中，挑选阳性克隆进行测序。
1． 4 同源性分析
cDNA 测序在北京博迈德完成;cDNA 序列在
GenBank 进行 BLAST 搜索和同源性比较。cDNA 序
列的翻译及氨基酸比对使用 DNAMAN软件。
1． 5 表达载体构建
本试验采用 Invitrogen 的 Gateway 技术构建过
表达载体。根据基因 SbAGL6 的 OＲF序列，将 Gate-
way 技术中的 AttB 位点加入原始引物序列，从阳性
克隆的质粒中扩增出 OＲF 片段，用于构建表达载
体。以通过测序鉴定的质粒为模板，AttB-SbAGL6 F
和 AttB-SbAGL6 Ｒ为引物进行 PCＲ 扩增，琼脂糖电
泳后回收 PCＲ产物。利用得到的 AttB-SbAGL6 产物
进行 BP反应，产物经转化后对阳性克隆进行测序。
将鉴定正确的质粒进行 LＲ 反应，进行转化和酶切
检测，将鉴定正确的菌液用于测序。
1． 6 农杆菌介导的拟南芥转化
用拟南芥蘸花法转化，按常规方法培育植株到
结实，收获 T0 种子后进行 PCＲ 鉴定，通过鉴定的植
株分别单株收获种子。将获得的 T1 种子播于含有
合适浓度卡那霉素的 1 /2MS 培养基上，出苗后观察
阴性幼苗和阳性幼苗的比例，此后将正常生长的植
株分单株收获 T2 种子。将 T2 转化株种子和野生型
种子同时种植在 1 /2MS 培养基中，14 d后分别移到
加有诱导物 Dexamethasone(Dex)的1 /2MS培养基
中进行诱导处理，观察转基因植株的生长变化。
2 结果与分析
2． 1 高粱 SbAGL6 基因的克隆
以高粱叶片 cDNA 为模板，SbAGL6-F、SbAGL6-Ｒ
为引物进行 ＲT-PCＲ扩增，产物用 1%琼脂糖凝胶电
泳检测，得到一条大约 800 bp 的单一条带，同目的
产物的大小一致(图 1) ，将目的片段连接到 pGEM-
24 华 北 农 学 报 29 卷
T easy 载体，获得重组质粒 pGEM-T easy-SbAGL6，经
测序表明该片段长 768 bp。利用 NCBI 中相关软件
进行搜索，其与高粱同源性较高，命名为 SbAGL6。
5 000 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 200 bp
800 bp
500 bp
M 1
M. DNA Marker IV (Biomed);1. 目的基因 SbAGL6 (768 bp)。
M． DNA Marker IV (Biomed);1. Target gene SbAGL6 (768 bp)．
图 1 SbAGL6 基因 OＲF的 ＲT-PCＲ
Fig． 1 ＲT-PCＲ to acquire the target gene SbAGL6
2． 2 SbAGL6 基因的测序与序列分析
根据拟南芥的相关信息，在 NCBI 网站上搜索
高粱的相关基因，得到高粱 SbAGL6 的 cDNA全基因
的最大开放阅读框(OＲF)序列大小为 768 bp，编码
具有 256 个氨基酸的蛋白质(图 2)。结果表明，所
扩增的 SbAGL6 基因全序列与预测的 SbAGL6 cDNA
全序列 99%相似，证明扩增的片段符合预期的结果
(图 2)。将 SbAGL6 的氨基酸序列提交到 NCBI 进
行保守域分析，发现 N 端存在 MADS 结构域，中间
存在 K-box结构域(图 3)。
经 ProtParam工具计算，SbAGL6 基因编码的蛋
白质理化性质参数为:分子质量为 29． 029 9 kDa，理
论等电点 pI为 8． 92，脂肪族指数为 77． 73。各氨基
酸在该蛋白质中的个数及所占比例见表 1，其中带
正电荷的氨基酸残基的总个数为(Arg + Lys)= 34，
带负电荷的氨基酸残基的总个数为 (Asp + Glu)=
29。此外，该蛋白质的不稳定指数为 45． 72，相对较
高，说明该蛋白不稳定。
应用 DNAman 软件对 SbAGL6 的氨基酸序列进
行同源性比对，结果显示(图 4)，其与水稻(Oryza
sativa，AY332477)、拟南芥 (Arabidopsis thaliana，
NM_130127 )和小麦(Triticum aestivum，DQ512329)
的 AGL6 的氨基酸序列同源性依次为 47． 1%，
56． 81%和 32． 81%，并且比对的蛋白质在 MADS 盒
和 K 盒保守，因此，SbAGL6 可能是高粱中具有
AGL6 生物功能的同源蛋白。
图 2 高粱 SbAGL6 基因的开放阅读框及导出的编码蛋白的氨基酸序列
Fig． 2 OＲF sequence and encoded amino acids of SbAGL6 gene in sorghum
1 50 100 150 200 255
Query seq.
DNA binding site
dimerization interface
Specific hits
Super families
putative phosphorylation site
K-box superfamily
MADS superfamily
MADS_MEF2_like
图 3 SbAGL6 基因氨基酸序列保守域分析
Fig． 3 Domain analysis of SbAGL6 transcription factor
2． 3 SbAGL6 转基因拟南芥的表型分析
使用 pKIGW 载体，构建 SbAGL6 的可诱导过表
达载体，转化获得转基因拟南芥植株。将纯合 T3 转
化株种子和野生型种子同时种植在 1 /2MS 培养基
中，14 d 后将幼苗移到加有 Dex 的 1 /2MS 培养基中
进行诱导处理，发现转入 SbAGL6 基因的植株比野
生型提前一周开花(图 5)。
2 期 傅 扬等: 过表达高粱 SbAGL6 基因对拟南芥花期转换的影响 25
SbaAGL6
AY332477
DQ512329
NM_130127
Consensus
SbaAGL6
AY332477
DQ512329
NM_130127
Consensus
SbaAGL6
AY332477
DQ512329
NM_130127
Consensus
SbaAGL6
AY332477
DQ512329
NM_130127
Consensus
K-box superfamily
K-box superfamily
MADS superfamily
69
70
70
69
136
140
137
136
206
207
205
204
254
248
232
251
序列从上到下依次为高粱 SbAGL6、水稻 AGL6(AY332477)、小麦 AGL6(DQ512329)、拟南芥 AGL6 (NM_130127 )。
The sequences from top to bottom were Sorghum bicolor AGL6，Oryza sativa AGL6 (AY332477) ，Triticum aestivum AGL6 (DQ512329) ，
Arabidopsis thalianaAGL6 (NM_130127)．
图 4 不同植物来源 AGL6 同源蛋白的氨基酸序列比对分析
Fig． 4 Alignments of predicted peptides of AGL6 protein from different plant species
表 1 编码的各氨基酸在 SbAGL6 蛋白中的个数与比例
Tab． 1 The number and percentage of different
amino acids in SbAGL6 protein
氨基酸
Amino
acids
数量
Number
百分比
含量 /%
Percentage
氨基酸
Amino
acids
数量
Number
百分比
含量 /%
Percentage
Ala (A) 21 8． 20 Lys (K) 15 5． 90
Arg (Ｒ) 19 7． 50 Met (M) 6 2． 40
Asn (N) 12 4． 70 Phe (F) 6 2． 40
Asp (D) 6 2． 40 Pro (P) 10 3． 90
Cys (C) 5 2． 0 Ser (S) 15 5． 90
Gln (Q) 19 7． 50 Thr (T) 10 3． 90
Glu (E) 23 9． 0 Trp (W) 3 1． 20
Gly (G) 18 7． 10 Tyr (Y) 8 3． 10
His (H) 11 4． 30 Val (V) 10 3． 90
Ile (I) 9 3． 50 Pyl (O) 0 0． 00
Leu (L) 29 11． 4 Sec (U) 0 0． 00
Col-0 SbAGL6 Col-0 SbAGL6
1/2MS 1/2MS+Dex
Col-0．野生型拟南芥;SbAGL6．转基因拟南芥;
SbAGL6 + Dex． Dex诱导的转基因拟南芥。
Col-0． Wild type Arabidopsis;SbAGL6． Transgenic Arabidopsis;
SbAGL6 + Dex． Dex induced transgenic Arabidopsis．
图 5 Dex处理两周龄转基因幼苗后的开花表型
Fig． 5 The flowering phototype of transgenetic plants
Dex treatment using two-week-old seedlings
3 讨论
植物经过一定阶段的营养生长期，会在内外因
子作用下，进入生殖生长阶段，这一过程受到一系列
转录因子的调控，其中包括MADS 转录因子。为解析
高粱花期转换的机制，我们克隆了一个高粱MADS 转
录因子基因 SbAGL6，通过生物信息学分析发现，该基
因与水稻(Oryza sativa)、拟南芥 (Arabidopsis thali-
ana)和小麦(Triticum aestivum)的 AGL6 的氨基酸序
列同源性依次为 47． 1%，56． 81%和 32． 81%，基因属
于 MADS-box基因家族，具有 MADS 盒、K 盒、I 区、C
末端和 N9末端等典型的结构特征［14 － 16］。
关于 AGL6 基因的功能和作用机制，在拟南芥
中的研究表明，AGL6 激活 SOC1，SOC1 又激活 LFY
进而促进开花;同时，AGL6 在叶片中也促进了 SOC1
和 LFY 的转录，导致拟南芥的花期转换［11］。另有研
究表明，矮牵牛的 FBP2［17］、番茄的 TM5［18］、非洲菊
的 GＲCD1［7］基因等是 AGL6 的同源基因，也能导致
植物提前开花。有些单子叶植物 AGL6 基因的功能
也已鉴定，OSMADS8 是水稻中的 AGL6 基因，在转基
因烟草中过表达能引起提早开花。百合花基因
LMADS3 属的 AGL6 基因，在转基因拟南芥中过表达
能促使植物提早开花。还有玉米的 ZMM8 基因，兰
花的 DOMADS1 基因都有提前开花的表型。本研究
克隆的高粱 SbAGL6 基因，若在拟南芥中过量表达，
会使转基因植株提前开花，表明 SbAGL6 基因与其
他物种中的 AGL6 基因的功能相似，也参与了对植
26 华 北 农 学 报 29 卷
物花期转换的调控。
有些物种 AGL6 基因还参与了花器官的发生，过
量表达该基因会造成花器官发育异常。在挪威云杉
DAL1［5］、文心兰 OMADS1 和风信子 HoAGL6 ［19］的异
位转化拟南芥植株研究中，发现 AGL6 类基因能促
进开花诱导，引起提早开花和花器官形态或数量的
异常［5 － 6，9，11，20 － 21］。然而在百合花中，AGL6 类基因
LMADS4 过表达只导致开花提前，没有造成花器官
发育的异常，这与本研究中 SbAGL6 基因过量表达
的表型相似。这些研究表明，AGL6 基因的生物学功
能在不同物种中存在差异，同源基因的功能差异是
物种多样性的分子基础，而其产生的原因，可能与物
种长期进化有关。
此外，本研究中发现，如果过早进行 Dex 诱导，
SbAGL6 基因的异位表达会影响植株花期表型的鉴
定，而 14 d时，植物营养器官长到足够大，转基因植
株花期表型鉴定结果更加准确，因而，本研究使用的
可诱导表达系统能在适当的发育时期诱导植物，避
免了组成型表达系统中异位表达外源基因对功能分
析的干扰。本研究为进一步解析高粱 SbAGL6 基因
的功能奠定了基础，同时也为高粱花期性状遗传改
良提供了优异基因资源。
参考文献:
［1］ Paenicová L，de Folter S，Kieffer M，et al． Molecular and
phylogenetic analyses of the complete MADS-Box tran-
scription factor family in Arabidopsis． New openings to the
MADS world［J］． Plant Cell，2003，15(7):1538 － 1551．
［2］ Alvarez-Buylla E Ｒ，Pelaz S，Liljegren S J，et al． An an-
cestral MADS-box gene duplication occurred before the
divergence of plants and animals［J］． Proc Natl Acad Sci
USA，2000，97(10) :5328 － 5333．
［3］ Purugganan M D，Ｒounsley S D，Schmidt Ｒ J，et al． Mo-
lecular evolution of flower development:Diversification of
the plant MADS-box regulatory gene family［J］． Genetics，
1995，140(1) :345 － 356．
［4］ Theissen G，Saedler H． Floral quartets［J］． Nature，2001，
409(6819) :469 － 471．
［5］ Schomburg F M，Patton D A，Meinke D W，et al． FPA，a
gene involved in floral induction in Arabidopsis，encodes a
protein containing ＲNA-recognition motifs［J］． Plant
Cell，2001，13(6) :1427 － 1436．
［6］ Mouradov A，Glassick T V，Hamdorf B A，et al． Family of
MADS-box genes expressed early in male and female re-
productive structures of monterey pine［J］． Plant Physiolo-
gy，1998，117(1) :55 － 62．
［7］ Tsuchimoto S，Mayama T，van der Krol A，et al． The
whorl-specific action of a petunia class B floral homeotic
gene［J］． Genes Cells，2000，5(2) :89 － 99．
［8］ Sung S K，An G． Molecular cloning and characterization of
a MADS-box cDNA clone of the Fuji apple［J］． Plant Cell
Physiol，1997，38(4) :484 － 489．
［9］ Mena M，Mandel M A，Lerner D Ｒ，et al． A characteriza-
tion of the MADS-box gene family in maize［J］． Plant J，
1995，8(6) :845 － 854．
［10］ Wigge P A，Kim M C，Jaeger K E，et al． Integration of
spatial and temporal information during floral induction
in Arabidopsis［J］． Science，2005，309(5737) :1056 －
1059．
［11］ Hsu H F，Huang C H，Chou L T，et al． Ectopic expres-
sion of an orchid (Oncidium Gower Ｒamsey)AGL6-like
gene promotes flowering by activating flowering time
genes in Arabidopsis thaliana［J］． Plant and Cell Physi-
ology，2003，44(8) :783 － 794．
［12］ Yang C H，Cheng L J，Sung Z Ｒ． Genetic regulation of
shoot development in Arabidopsis:the role of EMF genes
［J］． Dev Biol，1995，169(2) :421 － 435．
［13］ Zhang H，van Nocker S． The vernalization independence
4 gene encodes a novel regulator of flowering locus C
［J］． Plant J，2002，31(5) :663 － 667．
［14］ 张玉刚，韩振海． 小金海棠金属硫蛋白基因 MxMT2
克隆与生物信息学分析［J］． 华北农学报，2010，25
(2):60 － 63．
［15］ Kater M M，Dreni L，Colombo L． Functional conservation of
MADS-box factors controlling floral organ identity in rice
and Arabidopsis［J］． J Exp Bot，2006，57(13):3433 －3444．
［16］ 孙晓茜，戴洪义，张玉刚．柱型苹果 MADS-box家族的
2 个同源基因克隆与生物信息学分析［J］． 华北农学
报，2012，27(2):50 － 54．
［17］ Ma H，Yanofsky M F，Meyerowitz E M． AGL1-AGL6，an
Arabidopsis gene family with similarity to floral homeotic
and transcription factor genes［J］． Genes Dev，1991，5
(3) :484 － 495．
［18］ Ｒoldán M，Gómez-Mena C，Ｒuiz-García L，et al． Effect of
darkness and sugar availability to the apex on morpho-
genesis and flowering time of Arabidopsis［J］． Flowering
Newsl，1997，24:18 － 24．
［19］ Fan H Y，Hu Y，Tudor M，et al． Specific interactions be-
tween the K domains of AG and AGLs，members of the
MADS domain family of DNA binding proteins［J］． Plant
J，2007，12(5) :999 － 1010．
［20］ Boss P K，Sensi E，Hua C，et al． Cloning and character-
ization of grapevine (Vitis vinifera L．)MADS-box genes
expressed during inflorescence and berry development
［J］． Plant Sci，2002，162 (6) :887 － 895．
［21］ Moon J，Sub S S，Lee Ｒ，et al． The SOCl MADS-box gene
integrates vernalization and gibberellins ignalsf or flower-
ing in Arabidopsis［J］． Plant Journal，2003，35(5) :
613 － 623．