全 文 ：分子植物育种，2006年，第4卷，第6期，第811-818页
MolecularPlantBreeding,2006,Vol.4,No.6,811-818
研究报告
ResearchReport
pBI121载体酶切位点添加及拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因表达载体
的构建
张俊莲 1,2 王蒂 1,2* 张金文 1,2 陈正华 3
1甘肃农业大学农学院,兰州,730070;2甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室,兰州,730070;3甘肃亚盛集团博士后科研工作站北京分站,北京,100101
*通讯作者,wangd@gsau.edu.cn
摘 要 对pBI121载体GUS基因后的终止子序列 (SacⅠ-EcoRⅠ)通过PCR扩增法进行了酶切位点的添
加，即在SacⅠ后添加了XhoⅠ、在EcoRⅠ前添加了KpnⅠ。序列分析发现，两个酶切位点的添加是成功的，
但扩增的终止子序列与原序列的同源性间有差异，即有4个碱基发生了变异，特别是第17个碱基位点出现
了缺失。利用绿色荧光蛋白(GFP)对添加酶切位点载体进行了终止子活性的检测，结果发现，它与携带GFP
的pBI121载体一样，GFP基因能正常表达，说明pBI121载体终止子序列酶切位点的添加是成功的。利用改
造后的载体(pBI121-GZ)构建了CaMV35S启动子驱动AtNHX1基因的植物表达载体。
关键词 pBI121,终止子,限制性酶,绿色荧光蛋白,植物表达载体
ModificationofpBI121VectorandExpressionVectorConstructionNa+/H+
AntiporterofArabidopsisthaliana
ZhangJunlian1,2 WangDi1,2 ZhangJinwen1,2 ChenZhenghua3
1AgronomicColegeofGansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,730070;2GansuKeyLaboratoryofCropGenetic&GermplasmEnhancement,
Lanzhou,730070;3PostdoctorWorkstationofYashengIndustrialLtd.,Beijing,100101
*Corespondingauthor,wangd@gsau.edu.cn
Abstract Thetwoexonuclease(XhoⅠ andKpnⅠ)wereaddedtoNOS-ter(SacⅠ-EcoRⅠ)behindGUSof
pBI121vectorbyPCR.Thesequenceanalysisshowedthatitwasasuccessforaddingtoexonuclease,but
NOS-tersequencebyPCRdiferedfromoriginalsequence,thatmeantNOS-tersequencebyPCRhadfourmuta-
tionsites,specialy17sitedeletion.However,theterminationsignalofthisNOS-tersequencewasassameaso-
riginalpBI121withGFPwhenGFPgenewasusedformonitoringterminatoractivity,itmeantitwasasuccessfor
NOS-termodification.TheexpressionvectorswereconstructedbyfusingAtNHX1genewithCaMV35Susing
pBI121-GZvector.
Keywords pBI121,Terminator,Exonuclease,Greenfluorescentprotein(GFP),Plantexpressionvector
利用外源基因进行作物遗传改良已成为植物育
种的重要手段。目前，外源基因的导入方法已由多种
手段逐渐过渡到多采用农杆菌介导法和基因枪轰击
法(王蒂,2003;耿立召等,2005)。但这两种方法都需
将外源目的基因整合在植物表达载体中。目前，使用
到的植物表达载体主要是双元载体，如pBI121(刘召
华等,2005;张宁,2004)、pCAMBIA(黄永红等,2005;
李卫民等,2004;王清等,2003)、pGA643(李丽莉等,
2005)等。在使用这些载体时，由于目的基因插入区段
可利用酶切位点的限制，人们常采用中间载体(张宁,
2004;李卫民等,2004)、两种载体组合(王清等,2003;
李丽莉等,2005)等方法使目的基因有效整合进载体
中。我们分析了目的基因(AtNHX1等)和表达载体的
核酸序列，发现pBI121载体和几种目的基因中均无
XhoⅠ和KpnⅠ限制性内切酶位点，而pCAMBIA载
体则具这两个酶切位点。为了构建多种基因可方便使
用的表达载体，本研究将pBI121载体中GUS基因后
的终止区段(SacⅠ-EcoRⅠ)进行了酶切位点的添加
改造，即在SacⅠ酶切位点后添加了XhoⅠ酶切位点，
在EcoRⅠ酶切位点前添加了KpnⅠ酶切位点，以利
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
目的基因的整合和双价基因表达载体的构建。
Na+/H+逆向转运蛋白基因(NHX)为细胞液泡膜上
的一种Na+/H+逆向运输体，可将细胞中过多的Na+区
隔化进液泡，起细胞质Na+解毒、调节渗透压和平衡离
子的作用 (吕慧颖等,2004;BarklaandPantoja,1996)，
从而赋予植物抗盐性。应用来自于拟南芥(Arabidopsis
thaliana)液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(AtNHX1)
进行拟南芥的遗传转化，发现过量表达该基因产物的
植株在200mmol/LNaCl中可正常生长发育 (Apseet
al.,1999)；将该基因转入番茄(Lycapersicumesculen-
tum)和油菜(Brassicacampestris)中，转基因植株的耐盐
性也得到明显提高 (Zhangetal.,2001;Zhangand
Blumwald,2001)。因此，利用Na+/H+逆向转运蛋白基
因的转基因技术是提高作物抗盐性的有效手段。
绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)是
水母(Aequoreavictoria)体内的天然蛋白，自 Chalfie
等(1994)揭示了该蛋白作为报告蛋白的潜在应用价
值以来，它已作为报告蛋白成功地在植物、动物和微
生物中获得表达。我们将改造的pBI121载体上的
GUS基因用GFP基因进行了替换，利用基因枪介导
法，在洋葱(Aliumcepa)表皮细胞中诱导GFP基因瞬
时表达，检测终止子的功能。然后，用目的靶基因
(AtNHX1)替换了该载体上的 GFP基因，构建成
CaMV35S启动子驱动 AtNHX1基因的植物表达载
体，为进一步遗传转化奠定基础。
1材料和方法
1.1菌株和载体
大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株为 DH5α；根癌
农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株为LBA4404，
抗性标记为利福平(Rifr)和链霉素(Strr)；T-载体为
pGEM-TEasyVector，抗性标记为氨苄青霉素(Am-
pr)；植物表达载体为pBI121，抗性标记为卡那霉素
(Kanr)。GFP基因信息见白斌(2004)，pGEM-NHX1质
粒序列见张俊莲等(2005a)。
1.2试剂
各种限制性内切酶和 T4DNA连接酶购自
TaKaRa公司；pGEM-TEasyVector购自Promega公
司；TaqDNA聚合酶购自鼎国公司；DNA凝胶回收
试剂盒购自上海开瑞公司；抗生素为Sigma产品，其
他生化试剂为国产分析纯。
1.3pBI121载体酶切位点的添加
1.3.1pBI121NOS终止子区段(SacⅠ-EcoRⅠ,265bp,
以下简称N区段)的PCR扩增
根据pBI121的N区段设计二对引物，并分别添
加4个限制性酶切位点：即上游引物p1：5-CGCTC-
GAG(XhoⅠ)GAATTTCCCCGATCGTTCAAAC-3，
下游引物 p2：5-CGGGTACC (KpnⅠ)CCGATC-
TAGTAACATAGATGACACCG-3，上游引物 p3：
5-CGGAGCTC (SacⅠ)CTCGAGGAATTTCCCC-
GATC-3，下游引物 p4：5-CGGAATTC (EcoRⅠ)
GGTACCCCGATCTAGTAACATAGATG-3，由北京
赛百盛公司合成。扩增反应体系为25μl，扩增条件
为：94℃预变性 2min后，进行 94℃30s、52℃40s、
72℃40s30个循环，72℃下延伸10min。扩增产物经
1%琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收方法见胶回收
试剂盒说明书。以回收产物为模板进行第二次扩增，
扩增体系和条件同上，仅将引物改为p3和p4。
1.3.2pBI121N区段与T-载体连接
第二次PCR的回收产物与T-载体相连，连接
产物转化感受态细胞。感受态细胞的制备及转化参
见分子克隆实验指南(萨姆布鲁克等,2002)。
1.3.3重组质粒的鉴定及测序
将转化细胞涂布在含 50μg/mlAmpr、100μl
(20mg/ml)X-gal和20μl(100mg/ml)IPTG的LB平
板上进行蓝白斑筛选。对所获得的白斑通过滞后质
粒、PCR扩增及酶切鉴定后，送阳性菌株到上海博亚
公司测序，所测序列用Lynnonbiosoft公司的DNA-
MANvirsion5.0软件与原序列进行比较。
1.3.4T-载体上的 N区段替换 pBI121载体上 GUS
基因后的NOS-ter区段
将测序后正确的N区段和pBI121载体用EcoRⅠ
和SacⅠ酶切，T-载体回收 N区段，pBI121回收大
片段，然后进行连接。连接产物转化感受态细胞，经
PCR和酶切鉴定，完成pBI121载体酶切位点的添
加，定义为pBI121-GZ。
1.4pBI121-GZ载体终止子功能鉴定
1.4.1pBI121-GZ与绿色荧光蛋白基因连接
根据pBI121+GFP和pBI121-GZ载体的酶切位
点，对GFP和pBI121-GZ分别进行XmaⅠ和SacⅠ
双酶切，回收pBI121-GZ大片段和GFP小片段进行
连接并转化。转化细胞在 LB固体平板上进行
50μg/mlKan筛选后，进行PCR和酶切鉴定，获得
812
1.4.2洋葱表皮细胞培养
切取约2cm×2cm的洋葱表皮组织置含MS培养基
的固体平板上，28℃弱光下预培养4~6h，然后利用基因
枪进行GFP基因的转化。每种处理2皿，重复3次。
1.4.3基因枪转化
参考张俊莲等 (2005b)方法进行。取钨粉
(Φ1.2nm)悬液(60mg/ml)50μl，加入 5μl质粒 DNA、
50μl2.5mol/LCaCl2、20μl0.1mol/L亚精胺，充分混
匀后静置 10min，18000g离心 5s，弃上清。加入
250μl无水乙醇振荡3min，静置5min，18000g离心
5s，弃上清。加入60μl无水乙醇并悬浮沉淀，每枪取
12μl混合悬液。采用BiolisticPDS-1000/He基因枪
进行轰击，可裂膜片压力为1.1kPa，每皿轰击2次。
转化后材料置28℃弱光下培养16h，然后制片，荧光
显微镜下观察。
1.4.4GFP绿色荧光观察
在OLYPUSBX51/BX52型荧光显微镜下，用蓝
光激发以观察所发出的绿色荧光，利用计算机拍摄
和存贮图象。
1.5CaMV35S启动子驱动AtNHX1基因表达载体构建
1.5.1CaMV35启动子驱动的AtNHX1基因表达载体
构建
对pGEM-NHX1和 pBI121-GZ载体分别进行
BamHⅠ和XhoⅠ双酶切。pGEM-NHX回收小片段，
pBI121-GZ回收大片段，连接回收产物并转化
DH5α感受态细胞。转化细胞经Kan筛选后，进行
PCR和酶切鉴定，获得 pBI12135-GZ-NHX1植物表
达载体。
1.5.2植物表达载体转化根癌农杆菌
利用冻融法(王关林和方宏筠,2002)将pBI12135-
GZ-NHX1载体导入感受态农杆菌LBA4404中，转化
细胞经50μg/ml的利福平、链霉素和卡那霉素筛选后，
经PCR鉴定，获得pBI12135-GZ-NHX1工程菌。
2结果与分析
2.1pBI121载体酶切位点的添加
2.1.1pBI121N区段的分离
以pBI121质粒为模板、p1和p2为引物，利用
DNA聚合酶进行PCR扩增，期望获得约265bp大小
的DNA终止区段。扩增产物电泳检测结果表明，扩
增产物与预期片段的大小是一致的(图2)。进一步用
该序列的回收产物进行p3和p4引物的二次扩增，
经电泳检测证实，同样也获得了与预期片段大小一
致的N区段。
图1pBI121及其携带GUS(A)和GFP(B、C)的T-DNA示意图
Figure1SchematicrepresentationofT-DNAofpBI121with
GUS(A)orGFP(B,C)
pBI121-GZ+GFP表达载体。同时以未添加酶切位点
的pBI121(携带GUS或GFP基因)为对照(图1)。
2.1.2N区段与T-载体连接及重组子鉴定
将纯化的N区段与T-载体连接，转化DH5α感
受态细胞。通过蓝白斑和滞后质粒筛选，进行PCR(图
3a)及 EcoRⅠ和 SacⅠ酶切(图 3b)鉴定，均获得约
265bp大小的DNA片段。说明可能分离到添加Xho
Ⅰ和KnpⅠ酶切位点的pBI121载体终止区段。
2.1.3T-载体上N区段测序结果分析
将鉴定的阳性克隆交上海博亚公司测序，测序
结果用 Lynnonbiosoft公司的 DNAMANvirsion5.0
软件与原序列比较(图4)。结果发现：两个酶切位点
添加成功。但经过两次TaqDNA聚合酶扩增后，该
终止子区段有4个碱基发生了改变，特别是第17个
碱基位点发生了缺失，这种改变是否会影响终止子
的功能需进行鉴定。
pBI121载体酶切位点添加及拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因表达载体的构建
ModificationofpBI121VectorandExpressionVectorConstructionNa+/H+AntiporterofArabidopsisthaliana
图2pBI121载体N区段的分离
注:M:MarkerV分子量标记;1~3:PCR扩增产物
Figure2AmplificationofNos-ter
Note:M:DNAmarkerV;1~3:AmplifacationproductbyPCR
813
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
2.1.4pBI121载体终止子区段的替换
T-载体和pBI121载体用EcoRⅠ和SacⅠ进行
双酶切，回收T-载体小片段和pBI121大片段，连接
后导入DH5α中，经Kan筛选，进行PCR、BamHⅠ和
XhoⅠ或 SacⅠ (图 5a)(期望得到 1890bp大小
DNA)、EcoRⅠ或KpnⅠ和HindⅢ(图5b)(期望得到
3030bp大小DNA)酶切鉴定。结果与预期值吻合，表
明 pBI121载体终止区段被成功替换，定义为
pBI121-GZ。
2.2pBI121-GZ载体终止子功能的鉴定
图3白斑滞后质粒的鉴定
注:a:PCR鉴定;M:DNA分子量标记V;1~2:白斑滞后质粒;b:
EcoRⅠ和SacⅠ酶切鉴定;M:分子量标记V
Figure3Identificationofwhitecolorplasmid
Note:a:PCRidentification;M：DNAmarkerV;1~2:whitecolor
plasmid;b:IdentificationdigestedbyEcoRⅠ andSacⅠ;M:
DNAmarkerV
图5pBI121-GZ载体的双酶切鉴定
a:BamHⅠ和XhoⅠ(1)或SacⅠ(2)酶切;M:MarkerV分子量
标记;b:HindⅢ和KpnⅠ(1)或EcoRⅠ(2)酶切;M:MarkerIV
分子量标记
Figure5IdentificationofpBI121-GZbyenzymedigestion
Note:a:pBI121digestedbyBamHⅠandXhoⅠ(1)orSacⅠ(2);
M:DNAmarkerV;b:pBI121digestedbyHindⅢ
图4终止子扩增序列与原序列间的比较
注:NOS-ter表示终止序列;NOS-GZ表示NOS-ter添加酶切位点(XhoⅠandKpnⅠ)后的序列
Figure4AlignmentofnucleotidesequenceofNOS-terandNOS-GZofpBI121
Note:NOS-tershowsterminationsequence;NOS-GZshowsnucleotidesequencewithXhoⅠandKpnⅠsiteaddition
814
图7洋葱表皮细胞中GFP基因的表达
注:a:pBI121+GUS (CK);b:pBI121+GFP (CK);c:pBI121-
GZ+GFP
Figure7GFPgeneexpressionofonionepidermalcel
Note:a:pBI121+GUS(CK);b:pBI121+GFP(CK);c:pBI121-
GZ+GFP
图8植物表达载体pBI12135-GZ-NHX1的NHX1基因鉴定
注:a:PCR鉴定(M:DNA分子量标记V;1:克隆载体(阳性对照);2:pBI121载体(阴性对照);3~6:pBI12135-GZ-NHX1);b:BamHⅠ
和XhoⅠ酶切鉴定(M:DNA分子量标记V;1~4:pBI12135-GZ-NHX1);c:HindⅢ和XhoⅠ酶切鉴定(M:DNA分子量标记Ⅲ;1~
4:pBI12135-GZ-NHX1)
Figure8IdentificationNHX1geneofexpressionvectorpBI12135-GZ-NHX1
Note:a:PCRidentification (M:DNAmarkerV;1:Clonevector(CK);2:pBI121vector(CK);3~6:ExpressionvectorpBI12135-
GZ-NHX1);B:IdentificationofpBI12135-GZ-NHX1byBamHⅠ和XhoⅠ (M:DNAmarkerV;1~4:pBI12135-GZ-NHX1);c:Identi-
ficationofpBI12135-GZ-NHX1byHindⅢ和XhoⅠ(M:DNAmarkerⅢ;1~4:pBI12135-GZ-NHX1)
图6pBI121-GZ+GFP载体鉴定
注:A:酶切鉴定;M:DNA分子量标记 V;1:pBI121-GZ+
GFP/XmaⅠ+SacⅠ;B:PCR鉴定;M:DNA分子量标记 V;1:
pBI121+GFP (正对照);2:pBI121+GUS (负对照);3~4:
pBI121-GZ+GFP的PCR产物
Figure6IdentificationofpBI121-GZ+GFPvector
Note:A:IdentificationbyenzymedigestionM:DNAmarkerV;
1:pBI121-GZ+GFP/XmaⅠ+SacⅠ;B:IdentificationbyPCRM:
DNAMarkerV;1:pBI121+GFP (positivecontrol);2:pBI121+
GUS(negativecontrol);3~4:PCRproductsofpBI121-GZ+GFP
利用基因枪将3种质粒(图1)转入洋葱表皮细胞
中进行瞬时表达。结果发现：pBI121+GUS载体(阴性
对照)中未见绿色荧光蛋白(图7a)，而经酶切位点添加
的pBI121-GZ+GFP载体与原载体pBI121+GFP(阳性
对照)一样，绿色荧光蛋白表达正常(图7b、7c)，说明我
们对GUS基因的终止子区段的酶切位点的添加是成
功的。该载体可直接用于目的基因表达载体的构建。
2.3CaMV35S启动子驱动AtNHX1基因表达载体的
构建
2.3.1CaMV35启动子驱动AtNHX1基因表达载体的
构建
利用 BamHⅠ和 XhoⅠ对 pGEM-NHX1和
pBI121-GZ载体双酶切，回收目的片段进行连接并
转化，经Kan筛选后，对重组子进行 PCR(图 8a)和
BamHⅠ和XhoⅠ双酶切(图8b)鉴定，表明目的基因
已插入植物表达载体的特定位点中。进一步利用Hind
Ⅲ和XhoⅠ进行基因插入方向的鉴定，获得了约2
2.2.1pBI121-GZ载体与GFP基因连接
根据GFP基因酶切位点，对pBI121-GZ和GFP
载体分别进行 XmaⅠ和 SacⅠ双酶切，回收
pBI121-GZ大片段和GFP小片段(约750bp)，从而替
换pBI121-GZ中的GUS基因。PBI121-GZ+GFP重
组子经XmaⅠ+SacⅠ双酶切(图6a)和PCR鉴定(图
6b)，说明pBI121-GZ载体携带GFP基因的表达载体
构建成功，定义为pBI121-GZ+GFP。
2.2.2pBI121-GZ+GFP载体在洋葱表皮细胞中瞬时
表达
pBI121载体酶切位点添加及拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因表达载体的构建
ModificationofpBI121VectorandExpressionVectorConstructionNa+/H+AntiporterofArabidopsisthaliana 815
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
图9植物表达载体pBINH35导入农杆菌的PCR鉴定
注:a:NHX1基因的 PCR鉴定 [M:DNA分子量标记 V;1:
pGEM-NHX1克隆载体(阳性对照);2:农杆菌Ti质粒(阴性对
照);3~6:pBINH35];B:启动子的PCR鉴定 [M:DNA分子量
标记V;1:pBI35S(阳性对照);2:农杆菌Ti质粒(阴性对照);
3~4:pBINH35;5:水(空对照)]
Figure9PCRidentificationofexpressionvectorpBINH35after
introducedintoAgrobacteriumtumefaciens
Note:a:NHX1geneidentificationbyPCR [M:DNAmarkerV;
1:pGEM-NHX1vector(positivCK);2:TiplasmidofA.tumefa-
ciens(negativeCK);3~6:pBINH35];b:Promoteridentification
byPCR[M:DNAmarkerV;1:pBI35S(positivCK)2:Tiplas-
midofA.tumefaciens(negativeCK);3~4:pBINH35;5:Water
(emptyCK)]
3讨论
根癌农杆菌Ti质粒上的T-DNA被独立地构建
在其他质粒上也可以有效地转移到植物细胞中，这
一发现产生了农杆菌介导的转基因方法。因此，能方
便、快速、有效地整合外源目的基因的载体的研发就
显得十分重要。目前，人们广泛使用的是pCAMBIA、
pBEKES、pBin19及其衍生载体 pBI121和 pROKI
等双元T-DNA载体，其中pBI121和pCAMBIA由
于携带组成型强启动子(CaMV35S)而得到较普遍的
使用。但是由于目的基因插入位点区的酶切位点不
匹配，在使用它们时常采用中间载体(张宁,2004;李
卫民等,2004)、或载体间组合(王清等,2003)、或进行
酶切位点的修饰(张宁,2004)等措施使目的基因得以
连接。本实验进行目的基因AtNHX1的连接时也遇
500bp的酶切带谱(图8c)，表明AtNHX1基因是正向
插入特定位点的，说明pBI12135-GZ-NHX1植物表达
载体构建成功，定义为pBINH35。
2.3.2pBINH35工程菌的获得
将 pBINH35质粒通过冻融法转化感受态根癌
农杆菌LBA4404菌株，在含利福平(50μg/ml)、链霉
素(25μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的平板上获得白色
菌斑。经PCR(图9)鉴定，表明pBINH35植物表达载
体已导入农杆菌中。
到了同样问题，通过pBI121载体和AtNHX1等基因
序列的分析后发现，一些基因序列与pBI121载体一
样，都无XhoⅠ和KpnⅠ酶切位点，因此，将GUS基因
后的终止区段(SacⅠ-EcoRⅠ)进行酶切位点的添加，
即在SacⅠ后添加XhoⅠ，在EcoRⅠ前添加KpnⅠ，
可方便外源基因的有效插入。
TaqDNA聚合酶具有扩增效果好，重复性高等
优点，被广泛用于目的基因克隆和检测中，但其保真
性低，易造成碱基突变，特别是易出现碱基的插入或
缺失突变，使功能基因丧失活性，因此进行功能基因
克隆时，应避免使用TaqDNA聚合酶。然而，如果进
行功能基因5端或3端非翻译区段的扩增，则该酶
因其效率高、价格低廉成为首选(白斌等,2004)。本实
验用TaqDNA聚合酶进行终止子区段的改造时发
现，它所扩增的产物出现了4个位点的碱基改变，特
别是第17位点出现了碱基缺失。应用TaqDNA聚
合酶和PyrobestTMDNA聚合酶进行rd29A基因启动
子的扩增时，也出现了碱基变异及插入和缺失现象
(白斌等,2004;张宁等,2005)，通过洋葱表皮细胞中
绿色荧光蛋白的瞬时表达或马铃薯中GUS基因的稳
定表达发现，5端非翻译区碱基的插入和缺失对启
动子的活性无影响(张宁等,2005;张俊莲等,2005b)。
本实验用绿色荧光蛋白在洋葱表皮细胞中进行了终
止子功能的鉴定，结果也是同样的，即3端非翻译区
个别碱基的缺失不影响终止子的功能。
目前，GFP基因已被用作新型报告基因，用于细
胞中启动子活性、基因表达和蛋白定位的检测。GFP
基因较之 GUS基因的优越性在于它不需固定材料
和进行前处理，可在各种荧光显微镜下检测，且同
一细胞可以在不同条件下反复进行观察 (石玮等,
2002)。洋葱表皮细胞结构清晰，取材方便，是观察细
胞部分功能、外源基因瞬时表达的好材料。利用基
因枪转化法对其进行 GFP基因的转化后，可在
1~2d内检测出启动子的活性 (张俊莲等,2005b)，利
用该技术，也可以快速检测终止子的功能，以利进
一步的研究工作。
致谢
本研究由甘肃省科技攻关项目(2GS054-A41-
005-01)和甘肃省农业厅生物技术项目资助。
参考文献
ApseM.P.,AharonG.S.,SneddenW.A.,andBlumwaldE.,1999,Salt
816
toleranceconferedbyoverexpressionofavacuolarNa+/H+
antiportinArabidopsis,Science,285(5431):1256-1258
BaiB.,2004,Cloningofrd29ApromoterandAcInVgene,con-
structingofantisenseplantexpressionvectorandgenetic
transformationtopotato,ThesisforM.S.,GansuAgricultur-
alUniversity,Supervisor:ZhangJ.W.,pp.25-40 (白斌,
2004,rd29A启动子与AcInV基因的克隆、rd29A低温诱
导型启动子驱动的AcInV基因反义植物表达载体的构建
及其对马铃薯的遗传转化,硕士学位论文,甘肃农业大
学,导师:张金文,pp.25-40)
BaiB.,ZhangJ.W.,GuoZ.H.,andChenZ.H.,2004,Cloning
cold-inducedpromoterrd29Aanditsresponsibilitytolow
temperature,GansuNongyeDaxueXuebao(JournalofGan-
suAgriculturalUniversity),39(3):249-254(白斌,张金文,
郭志鸿,陈正华,2004,rd29A启动子克隆及对低温响应
的研究,甘肃农业大学学报,39(3):249-254)
BarklaB.J.,andPantojaO.,1996,Physiologyofiontransport
acrossthetonoplastofhigherplants,Annu.Rev.PlantPhys-
iol.PlantMol.Bio.,47:159-184
ChalfieM.,TuY.,EuskirchenG.,WardW.W.,andPrasherD.C.,
1994,Greenfluorescentproteinasamarkerforgeneexpres-
sion,Science,263:802-805
GengL.Z.,LiuC.L.,andLiF.G.,2005,Applicationofthecom-
binationofAgrobacterium-mediatedtransformationandpar-
ticlebombardmentinplantgenetictransformation,Xibei
ZhiwuXuebao(ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica),
25(1):205-210(耿立召,刘传亮,李付广,2005,农杆菌介
导法与基因枪轰击法结合在植物遗传转化上的应用,西
北植物学报,25(1):205-210)
HuangY.H.,TaoX.L.,LuL.,andZhaoC.Z.,2005,Studyonthe
constructionofavectorexpressingmelonACO1antisense
geneanditstransferencetoNicotianstabacum,XibeiZhiwu
Xuebao(ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica),25(2):
262-268(黄永红,陶兴林,陆璐,赵长增,2005,甜瓜ACC
氧化酶反义基因植物表达载体的构建及转化烟草的研
究,西北植物学报,25(2):262-268)
LiL.L.,HuY.M.,HuH.P.,LiuM.Q.,andSuH.M.,2005,Con-
structionofplantexpressionvectorwithtomatoU3snRNA
promoterandtransformationoftobacco,NeimengguDaxue
Xuebao (ActaScientiarumNaturaliumUniversitatisNei-
Mongol),36(1):63-67(李丽莉,扈延茂,扈会平,刘明秋,
苏慧敏,2005,利用番茄U3snRNA基因上游启动区构建
植物表达载体及对烟草的转化,内蒙古大学学报(自然科
学版),36(1):63-67)
LiW.M.,WangZ.X.,andJiaS.R.,2004,Overexpressionof
GbRac1geneintransgenictobaccoenhancesdiseaseresis-
tancetoAlternariaalternatainvitro,NongyeShenhwuJishu
Xuebao(JournalofAgriculturalBiotechnology),12(4):
353-356(李卫民,王志兴,贾士荣,2004,海岛棉GbRac1
基因过量表达提高转基因烟草离体叶片对赤星病的抗
性,农业生物技术学报,12(4):353-356)
LiuZ.H.,GuoH.N.,ZhengG.Y.,andTianY.C.,2005,Cloning
ofACAgenepromoterandpreliminarystudyofitsfunction,
ShengwuGongchengXuebao(ChineseJournalofBiotech-
nology),21(1):139-143(刘召华,郭洪年,郑光宇,田颖川,
2005,ACA基因启动子的克隆及功能初探,生物工程学
报,21(1):139-143)
LvH.Y.,LiY.X.,ChenH.,LiuJ.,LiP.,andYangQ.K.,2004,
MolecularcloningandcharacterizationofaNa+/H+ an-
tiportergeneinhalophyteTetragoniatetragonioides,Gao-
jishuTongxun (ChineseHighTechnologyLeters),11:
26-31(吕慧颖,李银心,陈华,刘晶,李平,杨庆凯,2004,
番杏Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆及特性分析,高技
术通讯,11:26-31)
SambrookJ.,andRusselD.W.,eds.,HuangP.T.,WangJ.X.,
ZhuH.C.,ZhangZ.S.,ChenH.P.,FanM.,YuW.Y.,andHe
F.C.,trans.,2002,MolecularCloning:ALaboratoryManu-
al,3rd,SciencePress,Beijing,China,pp.41-56(萨姆布鲁克
J.,拉塞尔 D.W.,编著,黄培堂,王嘉玺,朱厚初,张兆山,
陈慧鹏,范明,俞炜源,贺福初,译,2002,分子克隆实验指
南,第三版,科学出版社,中国,北京,pp.41-56)
ShiW.,LiD.D.,DengX.X.,andYiH.L.,2002,Transformation
ofgfpincleopatra(Citrusreticultat)mediatedbyAgrobac-
terium tumefaciens,YuanyiXuebao (ActaHorticulturae
Sinica),29(2):109-112(石玮,李东栋,邓秀新,伊华林,
2002,根癌农杆菌介导绿色荧光蛋白基因转化印度酸桔
的研究,园艺学报,29(2):109-112)
WangD.,ed.,2003,Cytotechnology,AgriculturalPressofChina,
Beijing,China,pp.163-166(王蒂,主编,2003,细胞工程学,
中国农业出版社,中国,北京,pp.163-166)
WangG.L.,andFangH.J.,eds.,2002,PlantGeneEngineering,Sci-
encePress,Beijing,China,pp.776-777(王关林,方宏筠,主编,
2002,植物基因工程,科学出版社,中国,北京:pp.776-777
WangQ.,WangD.,HuangJ.S.,andGuoA.P.,2003,Cloningof
potatopolyphenoloxidasegeneandconstructingofantisense
PPOexpressionvector,XibeiZhiwuXuebao(ActaBotanica
Boreali-OccidentaliaSinica),23(10):1745-1749(王清,王蒂,
黄俊生,郭安平,2003,马铃薯多酚氧化酶基因克隆及反义
表达载体构建,西北植物学报,23(10):1745-1749)
ZhangH.X.,andBlumwaldE.,2001,Transgenicsalt-tolerant
tomatoplantsaccumulatesaltinfoliagebutnotinfruit,Nat.
Biotechnol.,19:765-768
ZhangH.X.,JoannaN.H.,JohnP.W.,andBlumwaldE.,2001,
Engineeringsalt-tolerantBrassicaplant:Characterizationof
yieldandseedoilqualityintransgenicplantswithincrease
vacuolarsodiumaccumulation,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
pBI121载体酶切位点添加及拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因表达载体的构建
ModificationofpBI121VectorandExpressionVectorConstructionNa+/H+AntiporterofArabidopsisthaliana 817
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
98(22):12832-12836
ZhangJ.L.,ZhangJ.W.,ChenZ.H.,andWangD.,2005a,
CloningandsequenceanalysisofacDNAencodingNa+/H+
antiporter(AtNHX1)fromArabidopsisthalianunderNaCl
stress,CaoyeXuebao (ActaPrataculturaeSinica),14(6):
87-93(张俊莲,张金文,陈正华,王蒂,2005a,NaCl胁迫
下拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因(AtNHX1)的克隆及序
列分析,草业学报,14(6):87-93)
ZhangJ.L.,WangD.,ZhangJ.W.,andChenZ.H.,2005b,Determi-
nationofpromoteractivityofrd29AgeneofArabidopsis
thalianausinggreenfluorescentproteinandonionepidermal
cel,ZhiwuShenglixueTongxun(PlantPhysiologyCommu-
nications),41(6):815-819(张俊莲,王蒂,张金文,陈正华,
2005b,用绿色荧光蛋白和洋葱表皮细胞检测拟南芥
rd29A基因启动子活性的方法,植物生理学通讯,41(6):
815-819)
ZhangN.,2004,Studiesonincreasingstressresistanceofpotato
bygeneticengineeringofbetainealdehydedehydrogenase,
DissertationforPh.D.,GansuAgriculturalUniversity,Su-
pervisor:WangD.,pp.60-70(张宁,2004,应用甜菜碱醛脱
氢酶基因工程提高马铃薯抗逆性的研究,博士学位论文,
甘肃农业大学,导师:王蒂,pp.60-70)
ZhangN.,SiH.J.,andWangD.,2005,Cloningofrd29Agene
promoterfromArabidopsisthaliananditsapplicationin
stress-resistancetransgenicpotato,ZuowuXuebao(ActaA-
gronomicaSinica),31(2):159-164(张宁,司怀军,王蒂,
2005,拟南芥rd29A基因启动子克隆及其在马铃薯抗胁
迫转基因中的应用,作物学报,31(2):159-164)
(上接785页)
(四)转基因新技术、产品及其市场
◆Newtransgenetechnologies,productsandMarkets
Organizer:Dr.WanggenZhang,MonsantoCo.,USA
(五)设计育种：基因发现和性状改良的连接
◆Breedingbydesign-linkinggenediscoverytotrait
improvement
Organizer:Dr.MarkJ.vanHaaren,KeygeneN.V.,
Netherlands
(六)转基因植物中知识产权的问题
◆UrgentissuesontheIPRissuesintransgenicplants
Organizer:Dr.XingwangDeng,YaleUniversity,USA
六、大会日程
2007年3月23日 报到
2007年3月24日 开幕式、全会、宴会、晚间研讨会
2007年3月25日 全会、晚间研讨会
2007年3月26日 全会、闭幕会
2007年3月27日 离会、自助游
七、注册登记
注册费通过银行，请寄：
开户单位：海南省生物工程协会
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
帐 号：21-160001040023776
开户银行：中国农业银行海口市海秀支行
用 途：植物分子育种国际学术研讨会注册费
注册费通过邮局，请寄：
汇款地址：海南省海口市海秀中路107号北岸青年
公寓507室，邮编：570206
收 款 人：海南省生物工程协会
用 途：植物分子育种国际学术研讨会注册费
收到注册费后，我们将用email予以确认。
八、联系方式
组委会办公室联系方式(北京):
地址：北京市海淀区知春路49号希格玛公寓B1601
邮编：100080
电话：86-10-62556198 传真：86-10-88099388
E-mail：mpbhn@vip.sina.com 联系人：李迪女士
当地会务组联系方式(海南):
地址：海南省海口市海秀中路107号北岸青年公寓
507室 邮编：570206
电话：86-898-68966415 传真：86-898-68958180
E-mail：mpbhn@vip.sina.com 联系人：吴海兰女士
国外参会者
250美元
300美元
350美元
400美元
缴纳注册费时间
2006年9月30日前
2006年10月1日至12月31日
2007年1月1日至3月20日
2007年3月20日以后
国内参会者
人民币1000元
人民币1200元
人民币1400元
人民币1800元
国内学生/随行家属
人民币1000元
人民币1000元
人民币1200元
人民币1400元
表1注册费
818