全 文 ：1999-12-14收到 , 2000-06-22接受。
国家自然科学基金委资助项目(批准号:39670164)。
＊通讯作者。
从拟南芥表达文库中筛选钙调素结合蛋白 cDNA克隆
李国亮　詹红利　李翠凤　刘　华　凌启阆＊
(南开大学生物化学与分子生物学系 ,天津 300071)
Ren Zhang
(Depar tment of Biological S ciences , Universi ty of Wollongong , Aust ralia)
摘要:以生物素标记的钙调素为探针 , 筛选拟南芥
λZAPⅡ表达文库 ,分离得到 9 个阳性克隆。融合蛋白
的Western 印迹分析表明 , 这些阳性克隆确是编码钙
调素结合蛋白的(图 2 , 3), 并且其中 Y9 等 8 个克隆编
码的融合蛋白与钙调素有依赖于钙离子的结合(图
3B);而唯独 Y7 编码的融合蛋白与钙调素的结合 , 与
CaM BP-10 一样 ,不依赖于钙离子的存在(图 3A)。
关键词:生物素标记钙调素 , 钙调素结合蛋白 ,表达文
库筛选
学科分类号:Q946
　　钙调素(calmodulin , CaM)为真核细胞的主要
钙受体蛋白。现已查明 ,它的众多调节功能是通过
与其结合蛋白的相互作用而实现的。因此钙调素
结合蛋白(CaM BP)的发现 、结构特点及其与 CaM
之间结合方式的研究对最终阐明 CaM 在生物体内
的复杂调控机制具有重要的意义(Zielinski 1998)。
目前 ,有关动物细胞 CaM BP 的报告较多 ,而在植
物细胞中 ,相应的研究极为有限 ,在鉴定 、结构及功
能研究方面缺乏有价值的信息(Lu 和 Harrington
1994 , Reddy 等 1996),严重限制了对植物细胞中
Ca2+/CaM 介导的精密调控过程的全面认识 。
CaM BP-10为本研究组从中国大白菜中分离
得到的一种新的CaM BP(尚克进等 1991),它在植
物激素的应答(凌启阆等 1993 ,刘华等 1998 , 向左
云等 1998)、光合作用的调节等方面具有重要功能
(李翠凤等 1998)。CaM BP-10 与 CaM 的结合不
依赖于钙离子的存在 ,这一结合特性完全不同于一
般CaM BP 与 CaM 结合时遵循的依赖于钙离子的
flip-f lop模式 ,说明 CaM BP-10 的 CaM 结合结构
域的结构有别于其它 CaM 结合蛋白。
为了获得植物 CaM BP 的 cDNA克隆 ,以便进
一步研究它们的一般结构特征;更为了最终从中鉴
别出编码 CaM BP-10 的 cDNA 克隆 ,了解其结构
特性 ,我们以生物素标记的CaM 为探针 ,筛选拟南
芥λZAP Ⅱ表达文库 ,获得了 9个阳性克隆 ,其中阳
性克隆 Y7 编码的融合蛋白与 CaM 的结合 , 和
CaM BP-10一样 ,不依赖于钙离子的存在 。
1　材料与方法
1.1　材料
拟南芥λZAPⅡ表达文库和 E.coli XL-1 Blue
菌株由美国 The Arabidopsis Biological Resource
Center惠赠 ,SOLR细胞和 M13 辅噬菌体(S trate-
gene 公司)由香港科技大学 Jerry H.Wang 教授惠
赠。
生物素(biot in)、生物素酰己酸 N-羟基琥珀酰
亚胺酯(BCNHS)、链亲和素(st reptavidin)、亲和素-
过氧化物酶(avidin-peroxidase)、二氨基联苯胺
(DAB)、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)购自
Sigma公司;硝酸纤维素膜(NC 膜)、胶体金(col-
loidal gold)溶液(直径 15 nm , pH 5.3)购自华美公
司;限制性内切酶购自 Promega公司;其它化学试
剂均为分析纯试剂 。
1.2　CaM的制备
按凌启阆等(1986)法经硫酸铵盐析 、DEAE-纤
维素柱层析及 3520吸附树脂柱层析 ,从牛脑中分
离纯化 CaM 。
1.3　标记 CaM的制备
按 Bilingsley等 (1985)法制备生物素-CaM;戴
立新等(2000)方法制备胶体金-CaM 。生物素-
CaM 的结合能力分析 ,用部分纯化的 CaM BP-10
为样品 ,以Western印迹技术进行 。为保证生物素
-CaM 探针的结合特异性 ,蛋白样品转至 NC 膜上
后 ,膜先后依次用含 BSA 、链亲和素 、生物素的
TBS(Tris-HCl 50 mmol/L , NaCl 200 mmol/L , pH
7.5)预温育 ,再在含生物素-CaM 15 μg/ml的 TBS
28 植物生理学报 , Acta Phytophysiologica Sinica　2001 , 27(1):28 ～ 32
中温育 3 h。最后与亲和素-过氧化物酶反应 ,
DAB-H2O2 显色 ,并需加设省略生物素-CaM 温育
步骤的对照。
1.4　表达文库的筛选
以λZAP Ⅱ噬菌体转染 E .coli XL-1 Blue ,铺
10个 2×104 pfu/板(Υ15 cm)的平板 ,当噬斑刚生
长到肉眼可见时 ,用 IPTG 10 mmol/L 饱和的 NC
膜覆盖 ,诱导表达。以生物素-CaM 为探针筛选出
印渍在 NC 膜上的阳性菌斑(NC膜的屏蔽 、与生物
素-CaM 的结合 、呈色等皆按 1.3节中所述各步进
行),最后从琼脂板的相应位置上挑取阳性噬斑 ,溶
于无菌 SM 缓冲液中。阳性噬斑循环筛选 3 次 ,加
以纯化。
1.5　阳性克隆的确认
取单个阳性克隆 ,铺两个 3×104 pfu/板(Υ15
cm)的平板 ,于 42℃生长 4 h 后 ,在其中一个平板
中加入 3 ml 10 mmol/ L 的 IPTG 溶液 ,诱导融合
蛋白的表达;另一个平板中加入 3 ml无离子水 ,作
为对照 。培养过夜 ,离心去菌体 ,上清液冷冻干燥
后 ,以胶体金-CaM 为探针进行Western印迹分析 。
为检测融合蛋白与 CaM 结合的钙依赖性 ,Western
印迹分析分别在 CaCl2 0.5 mmol/ L 和 EGTA 0.5
mmol/L 下进行。
1.6　阳性克隆的体内切割与测序
按S trategene所述程序 ,用 ExAssist/SOLR系
统对阳性克隆进行体内切割 ,得到含有外源 cDNA
片段的 pBluescript质粒 ,以双脱氧核苷酸末端终止
法测序。
2　结果与讨论
2.1　标记 CaM的制备
筛选用 CaM 探针 ,选择生物素标记 ,标记强度
按BCNHS衍生物的 E1mmol/ L260 nm =2 .3 (Bilingsley 等
1985)计为 7.26 mol biotin/mol CaM 。当探针使用
浓度按 CaM 计为 15 μg/ml 时 ,检出灵敏度为 ng
级 ,并且背景清晰。
　　早期表达文库的筛选 ,选用125 I 标记的 CaM
(Sikela和 Hahn 1987 ,Watillon等 1992),因碘化过
程易引起 CaM 结构损伤 ,影响其与结合蛋白的结
合 ,加之同位素自显影的高噪声背景 ,筛选效果不
甚理想。另一个可供选择的方法是直接酶标法 ,将
辣根过氧化物酶等直接连接到探针上 ,最后通过酶
促活性进行发光或呈色检测 。但考虑到 CaM 分子
量较小 ,连接上庞大的酶分子后造成的空间障碍将
不利于 CaM BP 的检出;而选用小分子生物素标
记 ,便可避免这一弊病 。由图 1可见 ,通过用 BSA 、
链亲和素进行多级屏蔽后 ,生物素-CaM 探针具有
理想的结合特异性 ,当省却生物素-CaM 温育步骤
时 ,呈阴性结果(第 2列)。
图 1　生物素-CaM探针与部分纯化 CaM BP-10 样品的结合
Fig.1　 Binding of bio tinylated CaM probe with partially pu-
rified CaM BP-10
Lane 1:Probed with bio tiny lated CaM ;Lane 2:Negative con-
trol;Lane 3:Stained with Amino Black 10B.
　　确认阳性克隆时 ,换用胶体金-CaM 为探针 ,辅以
银染技术显色 ,可检出10 ng以下的融合蛋白。
2.2　CaM结合蛋白阳性克隆的检出和确认
基于拟南芥与中国大白菜同属十字花科 ,加之
其基因组最小 ,故选用拟南芥菜λZAP Ⅱ表达文库
进行筛选 。
　　以生物素-CaM 为探针筛选表达文库时 ,为排
除内源生物素化蛋白质造成的假阳性 ,除采用白蛋
白进行一般性屏蔽外 ,我们特采用链亲和素作专一
性屏蔽 ,以提高检出特异性。同时在对初筛所得阳
性克隆进行复筛时 ,加设省却生物素-CaM 温育步
骤的对比处理 。当对比组不出现阳性反应时 ,表明
所得克隆不是由于酶标亲和素与内源生物素化蛋
白质相互作用而造成的假阳性 ,从而进一步保证了
检出的准确性 。用上述方法我们从 2×105个重组
体中获得了 9个阳性克隆。
　　为确证所分离的克隆是编码CaMBP的 , 用
291 期　　　　　　　　　 　李国亮等:从拟南芥表达文库中筛选钙调素结合蛋白 cDNA 克隆
图 2　融合蛋白的 Western 印迹分析
Fig.2 　Western blo tting of the fusion pro teins from positive clones Y7(A)and Y9(B)
Lane No. IPTG induction Amino Black 10B staining Colloidal go ld-CaM probing
1 - - +
2 + - +
3 + + -
4 - + -
Arrows indicate the positio n of fusion pro teins.
PTG诱导表达融合蛋白;以胶体金-CaM 为探针进
行Western 印迹分析 , 反应分别在有 CaCl2 0.5
mmol/L 和有 EGTA 0.5 mmol/L 的条件下进行 ,
结果如图 2和 3 所示 ,它们确是编码 CaM BP 的 。
并且其中 8个克隆编码的融合蛋白与 CaM 有依赖
于钙离子的结合 ,在 EGTA 下结合被完全抑制(图
3B),而唯独克隆 Y7编码的融合蛋白与 CaM 的结
合 ,和 CaM BP-10一样 ,不依赖于钙离子的存在 ,
在 EGTA下同样有特异性结合(图 3A)。
2.3　CaM BP克隆的结构信息
从阳性克隆 Y7 、Y9切下的 pBluescript质粒 ,
经 EcoRⅠ酶切 ,得到大小分别为 387和 571 bp的
外源插入片段 。将外源插入片段的 DNA 序列输
入EMBL Databank 进行的初步分析显示:由 Y9
编码的蛋白质 ,在其 C 端存在由 14个氨基酸形成
的双亲α-螺旋结构。这是大多数已知 CaM BP 分
子中 CaM 结合 domain的结构特点(O Neil和 De-
Grado 1990 , Lu 和 Harring ton 1994), 故很可能是
一个潜在的 CaM 结合位点。而 Y7编码的结合蛋
白 ,其顺序虽也存在α-螺旋结构 ,但未呈现明显的
双亲性质 ,而是含有较多的疏水氨基酸 ,这或许就
是 Y7与 CaM 的结合不依赖于钙离子的结构基
础 ,因为它可以更多地借助于疏水相互作用 。这与
我们先前根据实验结果提出的 , CaM 与 CaM BP-
10之间的结合力主要依赖于分子上固有的(而不
是由钙离子诱导的)疏水相互作用的论点十分吻合
(尚克进等 1991),当然 ,这一推测还需要进一步实
验的支持 。目前我们正在进行更深入的结构分析
和同源性比较研究 ,并使 Y7在 pGEX 表达载体系
统中表达 ,以最终对 Y7作出鉴别。
30 植　物　生　理　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　27 卷
图 3 　融合蛋白与 CaM 结合的钙依赖性
Fig.3　 Calcium-dependent binding assay of the fusion pro-
teins from positive clones Y7(A)and Y9(B)to colloidal gold-
CaM
Lane 1:CaCl2 0.5 mmol/ L;Lane 2:EGTA 0.5 mmol/ L.
参 考 文 献
凌启阆 ,李翠凤 , 尚克进 ,杜立林 , 葛常辉(1993).CaM BP-
10 对生长素诱导的小麦芽鞘伸长及介质酸化的抑制
作用.科学通报 , 38:2005 ～ 2008
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Shang KJ(尚克进)(1998).Effects of calmodulin and
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国科学 C 辑), 28:1 ～ 6(in Chinese)
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Shang KJ(尚克进)(1998).Regulatory action of a
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311 期　　　　　　　　　 　李国亮等:从拟南芥表达文库中筛选钙调素结合蛋白 cDNA 克隆
Cloning of cDNAs Encoding Calmodulin-binding Protein from Ara-
bidopsis cDNA Expression Library
LI Guo-Liang　ZHAN Hong-Li　LI Cui-Feng　LIU Hua　 LING Qi-Lang
(Depar tment of Biochemistr y and Molecular Biology , Nankai Univer si ty , Tianjin 300071)
Ren Zhang
(Depar tment of Biological S ciences , Un iversity of Wollongong , Aust ralia)
Abstract:Using protein-protein interaction ,
an Arabidopsis λZAP Ⅱ cDNA expression li-
brary was screened with biotinylated calmod-
ulin as a probe.Nine positive clones were iso-
lated.The results of Western blotting of fu-
sion proteins indicated that all these positive
clones could synthesize peptides which could
bind calmodulin (Figs.2 , 3).Eight of them
bound calmodulin depending on the presence of
Ca
2+(Fig.3B), but only one fusion protein
encoded by Y7 cDNA clone , which was the
same as CaM BP-10 , could bind CaM in a way
independent of Ca
2+(Fig.3A).
Key words:biotinylated CaM , calmodulin binding protein , ex-
pression library screening
32 Acta Phytophysiologica Sinica　2001 , 27(1):28 ～ 32