全 文 ：中国科学: 生命科学 2011年 第 41卷 第 8期: 615 ~ 625

SCIENTIA SINICA Vitae www.scichina.com life.scichina.com

英文引用格式: Chai J, Qiang Y, Jia R R, et al. AtSUS3 with RNA interference affects sucrose synthase gene family expression and siliques maturation in Arabidopsis
thaliana. SCIENTIA SINICA Vitae, 2011, 41: 615–625, doi: 10.1360/052011-36
《中国科学》杂志社
SCIENCE CHINA PRESS
论 文
RNA 干涉 AtSUS3 影响拟南芥 SUS 家族表达模式
及角果成熟
柴静, 强毅, 贾荣荣, 毛杰利, 屈生宪, 俞嘉宁*
陕西师范大学生命科学学院, 西安 710062
* 联系人, E-mail: jnyu@snnu.edu.cn
收稿日期: 2011-04-18; 接受日期: 2011-06-03
中央高校基本科研业务费专项资金(批准号: GK200902028)资助项目
doi: 10.1360/052011-36

摘要 蔗糖合成酶(SuSy)是植物蔗糖代谢的关键酶, 在植物生长发育过程中起着重要作用.
为研究拟南芥中 SUS3的功能, 构建 RNAi-SUS3干涉载体, 通过农杆菌介导的真空渗透法转化
拟南芥. 筛选获得纯系转基因植株后, 对 AtSUS 家族进行表达分析, 利用环境扫描电子显微镜
观察转基因植株表型, 并对转基因拟南芥角果进行木质素组织化学染色以及透射电子显微镜
检测. 结果表明, RNA干涉技术能够抑制AtSUS3的表达, 正常培养条件下该基因沉默后对拟南
芥的表型没有显著影响, 但可引起角果中 AtSUS1, AtSUS2 和 AtSUS4表达代偿性增加, 使转基
因植株角果内果皮层细胞次生细胞壁增厚, 木质化程度加深, 同时果瓣厚度也有增加趋势. 结
果提示, 转基因拟南芥角果的发育较野生型植株更为优先, AtSUS3基因沉默可能有利于角果的
成熟.
关键词
蔗糖合成酶
RNA干涉
代偿效应
拟南芥
角果



蔗糖合成酶(sucrose synthase, EC2.4.1.13, SuSy)
是植物蔗糖代谢关键酶之一 , 由 Cardini 等人 [1]于
1955 年首次在小麦(Triticum aestivum L.)胚芽中发现.
其基因大小约为 5.9 kb, cDNA 长度约 2.7 kb, 编码
820 个氨基酸, 是相对分子质量为 83~100 kD 亚基构
成的四聚体[2]. 已有研究证明其在植物体内有 SSⅠ
和 SSⅡ两种存在形式, 大部分以可溶状态存在于细
胞质中, 不溶性的 SuSy 则附着在细胞膜上[3,4]. 该酶
可催化蔗糖+UDP↔果糖+UDPG 的可逆反应, 但通
常认为其主要起分解蔗糖的作用[5]. SuSy 在大多数植
物的贮藏器官中有明显的表达, 其活性通常与淀粉
的积累或者器官的生长发育有关[6]. 其生理功能涉及
影响库强, 蔗糖代谢, 参与细胞分化与纤维细胞壁合
成, 调节淀粉合成等方面[7].
拟南芥(Arabidopsis thaliana)中编码 SuSy 的是一
个多基因家族, 该家族由 6 个基因组成: AtSUS1,
AtSUS2, AtSUS3, AtSUS4, AtSUS5 和 AtSUS6[8]. 已有研
究表明, 多基因家族中某一基因的缺失可能会导致其
他基因表达增强来进行补偿. 如拟南芥细胞溶质转化
酶基因(AtCINV1)缺失的突变体中, AtCINV2 的表达水
平会增加 [ 9 ] ; 但也有相反的例子 , 如豌豆 (Pisum
sativum L.)中 SUS2 和 SUS3 并不能对 SUS1 的缺失起
代偿作用[10]. 拟南芥中 SUS3 在叶片失水、渗透胁迫
及后熟的种子等各种脱水条件下均有表达[8], 该基因
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的沉默是否影响 SUS 家族中其他基因表达, 目前还
不明确. 为此构建了 RNAi-SUS3 干涉载体, 转化野生
型拟南芥, 经两代筛选后, 获得纯系植株, 对 AtSUS1~
AtSUS6 表达量进行分析, 并对转基因植株的表型进行
环境扫描电子显微镜、透射电子显微镜观察, 旨在了
解 AtSUS3 基因干涉后对植株表型及该家族中其他基
因表达的影响, 以深入了解该基因家族的功能.
1 材料与方法
1.1 材料
哥伦比亚野生型拟南芥 (Arabidopsis thaliana
Columbia ecotype)种子播种于蛭石表面, 用 1/3×MS
营养液浇灌, 于温度 20℃~22℃, 相对湿度 60%~70%,
光照 16 h, 黑暗 8 h, 光照强度 120~150 mmol m−2 s−1
的温室中培养.
大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株和农杆菌
(Agrobacterium tumefacien)GV3101 菌株为本实验室
保存; pGEM-T easy 购自 Promega 公司; pKANNIBAL
和 pART-27 为江苏大学谭小力实验室惠赠.
1.2 方法
(1) RNAi-SUS3 干涉载体的构建. 通过 RT-PCR
方法获得拟南芥 SUS3 的全长 cDNA, 连入 pGEM-T
easy 载体, 测序验证后将该质粒命名为 pSUS3. 在
NCBI中Blast比对AtSUS3序列, 在该基因的特异性区
域选择 207 bp 大小的片段作为 RNAi 片段. 设计引物
Atsus3i-1, Atsus3i-2(表 1), 分别引入 XhoⅠ, EcoRⅠ和
XbaⅠ, Hind Ⅲ等限制性内切酶识别位点. 以 pSUS3
为模板用引物 Atsus3i-1 和引物 Atsus3i-2 分别扩增正
向和反向插入片段, 分别经过 XhoⅠ/EcoRⅠ, XbaⅠ/
Hind Ⅲ双酶切后连入 pKANNIBAL 载体中, 形成
RNAi 中间载体(图 1). 将中间载体用 NotⅠ单酶切,
连接到 pART-27 载体中, 转化大肠杆菌 DH5α, 经蓝
白斑筛选获得阳性克隆, 得到 RNAi-SUS3 干涉载体.
(2) 转 RNAi-SUS3 拟南芥的获得及分子检测.
电转化农杆菌 GV3101 感受态细胞, 挑取含目的基因
表 1 PCR 扩增引物 a)
引物 引物序列 5′ 3→ ′ 正向序列 反向序列
Atsus3i-1 TAACTCGAGTGTCTTCGAGCTAAGTGTTG TTAGAATTCCGGAACATAACAGAAGACAAG
Atsus3i-2 TAATCTAGATGTCTTCGAGCTAAGTGTTG TTAAAGCTTCGGAACATAACAGAAGACAAG
35s ATTTGCCACTATTACAGAGG ATTACTTGCCTTGGTTTATG
Atsus3-1 TGTCTTCGAGCTAAGTGTTG CGGAACATAACAGAAGACAAG
Atactin AGCTATGAGTTGCCTGATGG ATTGTAAGTGGTCTCGTGAATAC
Atsus1 GAACGTCTCGAGAGAGTTTATGATTCTG GTATCAGCAGCCTGATCACCATGGTAAG
Atsus2 TAGTGGTACAGAACACGCACACATTCTG GTCTCAAAGAAGCTGACCAAGGTAGCTG
Atsus3 CAGCGGAACAGAGCATACTCATATTCTC ATCAGCCATTATGTTACCCGCTTGCTCA
Atsus4 GCTGCTTCCTGACGCAGCAGGAACCACTTGT CTCTCAGCTGCCTTGTCACCATGATATGGA
Atsus5 ATGCAACCAAGAGTTGGAACCTATTTTC CAATAATCAGGATCCATACCGGATTTCTC
Atsus6 GAACTAGAAGCCATTGAAGGAACCAAGC ATACAAACCATCTGAACGGCATTTGCTG
Real-Atsus1 CTCGTCCAACACTCCACAA TCTTCATACAGCGTTTCGG
Real-Atsus2 AGGGTGTACCAAATCTCAT CATAGTGAAAGCTGTGTGG
Real-Atsus3 GAGATACCGCAGGGAGAGTT CAGCATTTCAGTCTCAAGGG
Real-Atsus4 CAAGTGTAAGCATGACCC AGGAACAGCTTGAGCCAG
Real-Atsus5 CGAACAAGAAACGGTGAACT TTCGTTTATGCGTTGTAGCC
Real-Atsus6 GATGAAGATTGCGTATGGAC AGCCGAGTTAGCACCAAAG
a) 引物 Atsus3i-1 正、反向序列中下画线分别表示 XhoⅠ, EcoRⅠ识别序列, 引物 Atsus3i-2 正、反向序列中下画线分别表示 XbaⅠ,
Hind Ⅲ识别序列

图 1 pKANNIBAL 载体中插入的正向和反向 AtSUS3 基因片段
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的阳性农杆菌菌株至 400 mL 的 LB 液体培养基中(含
50 mg/L 利福平, 50 mg/L 卡那霉素), 28℃, 220 r/min
振荡培养 12~16 h 至菌悬液 A600 为 2.0 左右. 收菌后,
4000 r/min 离心 30 min, 弃上清, 用转化液(0.5%蔗糖,
2.15 g/L MgCl2, 50 μL/L Silwet-77)重悬沉淀至 A600 值
达到 0.8 左右. 将生长至盛花期的拟南芥植株倒浸于
含农杆菌的转化液中, 0.05 MPa 抽真空, 维持 5 min.
取出植株侧放, 暗培养 24 h 后, 置温室中正常培养至
收种.
将收获的 T0 代种子经表面消毒后, 均匀播种于
MS 固体筛选培养基表面(含 50 mg/L 卡那霉素和 150
mg/L头孢霉素), 于上述温室中培养. 10~14天后挑选
阳性植株幼苗, 移栽至蛭石中培养至收种. 再经过两
代筛选, 获得纯系转基因植株. 正常培养 30 天后分别
提取转基因植株和野生型植株的总DNA(CTAB法[11]),
以质粒为阳性对照, 用引物 35s 扩增干涉片段中的
35S 启动子序列. PCR 体系为 25 μL, 其中 DNA 模板
50 ng, 上下游引物各 2 μL, 扩增参数为 95℃ 10 min;
95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min 共 30 个循环; 72℃
10 min. 取扩增产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳检测.
(3) 转基因拟南芥的干涉效率分析. 选取相同
条件下培养 30天的转基因植株和野生型植株, 单株提
取其总RNA(TRIpure Reagent 总RNA提取试剂, 北京
百泰克生物公司), 逆转录为 cDNA(PrimeScriptTM RT
reagent Kit, 大连 TaKaRa 有限公司). 选取 AtSUS3 基
因中 207 bp 长度的特异性序列设计引物 Atsus3-1 进
行扩增, 以引物 Atactin 扩增的 Atactin11 基因为内参.
PCR 体系为 25 μL, 其中 cDNA 模板 50 ng, 上下游引
物各 2 μL, 扩增参数为 95℃ 10 min; 95℃ 30 s, 55℃
30 s, 72℃ 1 min 共 28 个循环; 72℃ 10 min. 扩增产物
用 1%琼脂糖凝胶电泳检测.
(4) 转基因拟南芥 SUS 家族表达模式分析. 选
取相同条件下培养 50 天左右的转基因植株和野生型
植株, 提取花、叶、茎、莲座叶以及角果中的总 RNA,
逆转录为 cDNA. 通过 Blast比对 AtSUS1(At5g20830),
AtSUS2(At5g49190), AtSUS3(At4g02280), AtSUS4
(At3g43190), AtSUS5(At5g37180)和 AtSUS6(At1g73370)
的特异性区域设计引物 Atsus1~Atsus6, 以 Atactin11
基因为内参进行RT-PCR分析. PCR体系为 25 μL, 其
中 cDNA 模板 50 ng, 上下游引物各 2 μL, 扩增参数
为 95℃ 10 min; 95℃ 30 s, 50℃ 40 s, 72℃ 1.5 min
共 29 个循环; 72℃ 10 min. 取扩增产物进行 1%琼脂
糖凝胶电泳检测, 应用 Fluor Chem 凝胶成像系统(美
国 Alpha)扫描 PCR 扩增产物的电泳条带灰度, 计算
出 AtSUS 家族各个基因与内参 Atactin11 基因的灰度
比值(AtSUS/Atactin11), 得出目标基因的相对表达量.
以 Atactin11 基因为内参 , 设计 Real-Atsus1~
Real-Atsus6(表 1)作为 Real-time RT-PCR 扩增引物.
采用 MiniOpticon 实时 PCR 检测系统(美国 Bio Rad),
实时荧光定量 PCR 方法参照 SYBY Premix Ex
TaqⅡ(大连 TaKaRa 有限公司)说明书进行. PCR 体系
为 25 μL, 其中 cDNA 模板 20 ng, 上下游引物各 1 μL;
扩增参数为 95℃ 8 min; 95℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 1
min 共 40 个循环. 采用 2−ΔΔCt 法对数据进行分析.
(5) 转基因拟南芥的表型分析. (ⅰ) 转基因拟
南芥组培苗分析. 将 T2 代转基因植株种子和野生型
植株种子经表面消毒后分为两组. 一组均匀播种于
MS 固体培养基上, 置温室中水平培养; 另一组播种
于 MS 固体培养基的同一水平线上, 竖直培养, 用于
观测根部发育; (ⅱ) 转基因拟南芥实生苗分析. 将 T2
代转基因植株种子和野生型植株种子播种于蛭石表
面, 用 1/3×MS 营养液浇灌, 于上述温室中培养. 在
生长 30 和 50 天后观察结果, 进行统计和拍照.
(6) 转基因拟南芥环境扫描电子显微镜分析. 选
取培养 50 天的转基因植株及野生型植株中相同部位
的叶片、茎、花以及角果, 用 0.1 mol/L 磷酸缓冲液
冲洗表面灰尘杂质, 晾干表面水分后将新鲜的植物
组织置于样品台上, 于 Quanta 200(FEI 公司)环境扫
描电子显微镜低真空模式下观察, 在 50~100 放大倍
数下观测拍照.
(7) 转基因拟南芥木质素组织化学染色分析. 采
用 Wiesner 反应法[12], 选取开花后 8 天(8DAF)和 13
天(13DAF)角果制作徒手切片, 室温条件下在 1%(质
量体积比, 溶于 95%无水乙醇)的间苯三酚溶液中染
色约 5 min, 再滴加 3 mol/L 盐酸孵育约 5 min, 最后
用3 mol/L盐酸封片, 于Leica DFC490显微镜下观察,
在 100~200 放大倍数下观测拍照.
(8) 转基因拟南芥透射电子显微镜分析. 切取
8DAF 的拟南芥角果(体积≤1 mm3) 放入新鲜配制的
2.5%戊二醛固定液中, 于 4℃进行前固定 4~6 h, 然后
用 0.1 mol/L 磷酸缓冲液漂洗, 用 1%四氧化锇进行后
固定1~2 h, 再用0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗, 乙醇梯度
脱水, 包埋剂渗透后用环氧树脂(Epon812)包埋, 聚合,
进行超薄切片, 醋酸铀染色, 于 JEM-2000EX 电子透
柴静等: RNA 干涉 AtSUS3 影响拟南芥 SUS 家族表达模式及角果成熟

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射显微镜下观察, 在 1500~8000放大倍数下观测拍照.
(9) 转基因拟南芥角果产率及成熟率统计. 选
取相同条件下培养的野生型及转基因拟南芥(两个株
系)各 90株, 生长 50天后分别统计其角果总数和开裂
的角果数目, 用以计算角果产率及成熟率. 角果产率
以角果总数/植株总数表示, 角果成熟率以开裂角果
总数/角果总数表示.
2 结果
2.1 转基因拟南芥的获得与分子检测
RNAi-SUS3 干涉载体经农杆菌介导的真空渗透
法转化盛花期的野生型拟南芥, 温室条件继续培养至
收获T0代种子. 该种子经表面消毒后均匀播种于含50
mg/L 卡那霉素的 MS 固体培养基表面. 培养 12 天后
可见, 转基因植株正常生长, 幼苗茁壮, 叶片鲜绿; 非
转基因植株则不能正常生长, 幼苗矮小, 逐渐黄化.
经两代筛选后获得纯系植株, 进行 PCR 检测, 以含有
干涉片段的质粒为阳性对照, 以野生型植株为阴性对
照. 由图 2 可以看出, 转基因植株能扩增出大小约为
573 bp 的条带, 与质粒中的扩增产物大小一致, 而野
生型植株中则不能扩增出目的条带, 说明目的基因已
插入阳性植株中, 成功获得转基因拟南芥.
2.2 转基因拟南芥植株的干涉效率分析
单株提取转基因植株的 RNA, 并逆转录为
cDNA, 以野生型植株为对照, 以 Atactin11 基因为
内参. 可见 AtSUS3 基因在各转基因拟南芥株系中的
表达量大幅下降 , 几乎检测不到 ( 图 3), 说明
RNAi-SUS3 干涉载体转化拟南芥后, 该基因的表达
被抑制.
2.3 转基因拟南芥 SUS 家族表达模式分析
以 Atactin11 为内参, 用 RT-PCR 的方法扩增


图 2 转基因植株的 PCR 检测
M: DL2000; 泳道 0: 空白对照; 泳道 1: 阳性对照; 泳道 2: 野生型植株; 泳道 3~9: 转基因植株

图 3 转基因拟南芥 RT-PCR 分析
(A) Atactin11 基因扩增产物电泳结果; (B) 转基因拟南芥 SUS3 基因 RT-PCR 分析. M: DL2000; 泳道 0: 空白对照; 泳道 1: 野生型植株; 泳道
2~4: 转基因植株
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AtSUS1~AtSUS6. 由 Atactin11 的扩增条带亮度一致
说明 cDNA 的模板量相同(图 4(A)). 由此可见 ,
AtSUS3 在野生型植株中, 除了莲座叶, 在其他组织
部位均有表达, 且在角果中有较高表达, 而转基因植
株除了在角果中略有表达, 在其他组织部位不表达;
AtSUS1 在植株的各个部位均有表达, 但在转基因植
株角果中的表达量明显高于野生型植株; AtSUS2 在野
生型植株茎中有微量表达, 转基因植株中几乎没有;
在野生型植株及转基因植株角果中高度表达, 但转
基因植株中该基因的表达量高于野生型; AtSUS4 在野
生型植株的花、茎和角果中有明显表达, 转基因植株
除了在花、茎、角果中有表达外, 莲座叶中也有明显
表达, 且转基因植株角果中的表达量明显高于野生型
植株, 但茎中的表达量低于野生型; AtSUS5 在野生型
植株茎中的表达量略高于转基因植株, 在其他组织部
位没有明显差异; AtSUS6 在野生型植株茎中的表达量


图 4 转基因拟南芥 SUS 基因家族 RT-PCR 分析及相对表达水平
(A) 转基因拟南芥 SUS 基因家族 RT-PCR 分析; (B) 转基因拟南芥 SUS 基因家族相对表达水平.
目标基因相对表达水平以该基因 PCR 产物灰度/内参 Atactin11 灰度表示
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图 5 AtSUS1~AtSUS6 基因在拟南芥角果中的 RT-PCR 分析
高于转基因植株, 而在莲座叶中的表达量则低于转
基因植株(图 4(A)和(B)). 用 Real-time RT-PCR 分析
AtSUS1~6 在角果中的表达模式, 结果与 RT-PCR 的
分析结果有相似性, 即 AtSUS3 在转基因拟南芥角果
中的表达被抑制; 而 AtSUS1, AtSUS2, AtSUS4 的表达
较野生型显著增加; AtSUS5, AtSUS6 表达在二者之间
没有明显差异.
2.4 转基因拟南芥表型分析
为了分析转基因拟南芥表型是否受影响, 比较
了野生型植株与转基因植株组培苗与实生苗的生长
差异. 结果表明, 培养在 MS固体培养基上 10天的转
基因拟南芥生长状态正常, 幼苗茁壮, 植株大小及真
叶数目与野生型一致(图 6(A)). 竖直培养的转基因植
株及野生型植株的根长及侧根数目没有明显差异(图
6(B)). 生长于蛭石基质上 30 和 50 天的转基因拟南芥
及野生型拟南芥状态正常, 莲座叶形态数目、茎粗、
开花时间及角果的发育基本相同(图 6(C)和(D)). 表
明AtSUS3基因沉默对植株的表型可能没有显著影响.
2.5 转基因拟南芥环境扫描电子显微镜分析
为了观察转基因植株与野生型植株的表观结构
差异, 将生长 50 天的植物样品置于环境扫描电子显
微镜下观察. 结果显示, 转基因植株及野生型植株
叶的表皮毛数量及单个表皮毛的形态没有明显差异
(图 7(A)和(E)), 二者茎的粗度基本一致且都长有茎
表皮毛(图 7 (B)和(F)), 花和角果的形态也基本相同,
花朵结构完整, 角果表面平滑度一致(图 7(C), (D),
(G)和(H)).
2.6 转基因拟南芥木质素组织化学染色分析
组织化学染色技术可以检测出植物组织中细胞
壁木质素含量的差异. 木质素成分用间苯三酚和盐
酸溶液处理后, 可以呈现出红色反应, 染色深浅代表
木质化程度的高低. 对转基因植株进行组织化学染
色并观测. 结果显示, 转基因植株与野生型植株的茎
中木质化程度大致相同, 没有明显差异(图片未显示).
但转基因植株 8DAF 的角果果瓣 (valve)内果皮层
(endocarp)细胞的红色区域较野生型多, 且边缘较厚,
颜色较深, 说明其木质化程度较之野生型植株要高
(图 8(A), (B), (E)和(F)); 在 13DAF 的角果中, 与野生
型植株相比, 转基因植株染色区域颜色仍较深, 但与
野生型植株相比, 差异不如 8DAF 的角果中显著, 此
外转基因植株的果瓣有显著增厚趋势(图 8(C), (D),
(G)和(H)).
2.7 转基因拟南芥透射电子显微镜分析
对 8DAF 的角果经前固定、漂洗、后固定、脱水、
浸透、包埋、聚合、超薄切片及染色等处理后, 应用
透射电子显微镜观察细胞内的超微结构. 由图 9 可见,
野生型拟南芥角果果瓣中, 中果皮是由含叶绿体的
薄壁细胞组成, 细胞排列疏松且无规则; 内果皮层的
细胞木质化, 排列紧密有序. 转基因拟南芥角果果瓣
与野生型植株相比, 中果皮细胞无明显变化, 但内果
皮层细胞的次生细胞壁有增厚现象, 尤其在细胞的
非弯折区域, 增厚现象更为显著.
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2.8 转基因拟南芥角果产率及成熟率统计
选取生长 50 天的同龄野生型植株及两个转基因
株系各 90株, 统计角果产率和角果成熟率. 结果如表
2 所示, 拟南芥生长 55 天时, 野生型角果产率为转基
因型的 76%, 表明转基因植株的角果产率高于野生型;
至 60 天时, 二者的差异减小. 65 天角果开始开裂时进
行成熟度统计, 野生型角果成熟率为转基因型的 60%;
至 75天时, 野生型角果成熟率为转基因型的 80%, 转
基因植株的角果成熟率均高于野生型植株.
3 讨论
RNA 干涉(RNA interference, RNAi)是指将与内
源性 mRNA 序列同源的双链 RNA(dsRNA)导入细胞,


图 6 野生型及转基因拟南芥表型对比
(A)和(B) 10 天组培苗; (C) 30 天实生苗; (D) 50 天实生苗

图 7 野生型及转基因拟南芥扫描电子显微镜图对比
(A) 野生型植株叶片及表皮毛; (B) 野生型植株茎; (C) 野生型植株花; (D) 野生型植株角果; (E) 转基因植株叶片及表皮毛; (F) 转基因植株
茎; (G) 转基因植株花; (H) 转基因植株角果
柴静等: RNA 干涉 AtSUS3 影响拟南芥 SUS 家族表达模式及角果成熟

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图 8 野生型及转基因拟南芥角果木质素组织化学染色对比
(A)和(B) 野生型植株 8DAF 角果; (C)和(D) 野生型植株 13DAF 角果; (E)和(F) 转基因植株 8DAF 角果; (G)和(H) 转基因植株 13DAF 角果.
va: 果瓣; en: 内果皮

图 9 野生型及转基因拟南芥角果透射电子显微镜图对比
(A) 野生型植株角果果瓣细胞; (B) 野生型植株角果内果皮层细胞; (C) 转基因植株角果果瓣细胞; (D) 转基因植株角果内果皮层细胞.
me: 中果皮; en: 内果皮
表 2 转基因拟南芥角果产率及成熟率 a)
野生型拟南芥 转基因拟南芥
SUS3-2 SUS3-15
角果产率(角果总数/植株总数)
55 天 8.43±0.31 11.07±0.45 10.92±0.19
60 天 17.6±0.42 18.36±0.47 18.27±0.21
成熟率(开裂角果总数/角果总数)
65 天 0.03±0.002 0.05±0.003 0.05±0.002
67 天 0.05±0.003 0.10±0.003 0.09±0.002
75 天 0.41±0.03 0.52±0.02 0.50±0.01
a) 上述统计重复 3 次(P<0.05)
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致使该 mRNA 被高效地降解, 从而导致该基因表达
沉默的现象[13]. 由于 RNAi 能专一性地抑制基因的表
达, 该技术很快成为研究基因功能的一种有效手段,
产生发卡结构 RNA 的载体被广泛应用, 通过转基因
在植物中表达 dsRNA, 能有效抑制植物体内靶基因
表达[14]. 当多基因家族中某一基因表达沉默后, 可能
会对其他基因的表达产生影响, 引发其他基因的代
偿效应. 本实验为了研究拟南芥 SUS3 的功能并探究
该基因沉默对同家族其他基因表达的影响, 构建了
RNAi-SUS3 干涉载体, 转化拟南芥, 经分子检测转基
因植株具有良好的干涉效率. 在获得纯系转基因植
株的基础上, 对拟南芥 SUS 家族进行了表达分析, 并
对转基因植株进行了表型、扫描电子显微镜、透射电
子显微镜和木质素染色等一系列指标的鉴定.
通过分析不同组织部位 AtSUS 基因家族的表达
水平, 发现 AtSUS3 在野生型植株的花、叶、茎中有
表达, 但角果中表达量最高; 在转基因植株中, 该基
因在花、叶、茎、莲座叶中无表达, 在角果中仍有少
量表达, 可能由于干涉未达到 100%所致. 与野生型
植株相比, 转基因植株角果中 AtSUS1和 AtSUS4的表
达量显著增加, 二者同属于双子叶 SUS1 亚家族, 具
有高度相似的氨基酸序列[8,15]. 在其他研究中还发现,
这两个基因在缺氧胁迫条件下表达量增加[8]. AtSUS2
基因在角果中特异性高表达, 在转基因植株中该基
因的表达量高于野生型, 可能由于 AtSUS3 的表达量
降低, AtSUS2 代偿性增加所引起. AtSUS5 和 AtSUS6
基因的表达不具有组织特异性, 且二者对胁迫条件
无响应[8]. 本实验发现, AtSUS5 基因在各个组织中均
没有较高的表达, 而 AtSUS6 基因在花中表达量较高,
这与 Baud 等人[8]的研究结果类似, 但 Fallahi 等人[16]
认为, AtSUS5 基因在角果中表达量较高, 而 AtSUS6
基因在各个组织中表达量都较低. 其原因可能是培
养条件及植株样品采集时期的差异所致.
转基因拟南芥同野生型植株相比, 表型并没有
发生明显变化. 而在其他农作物中, SUS 基因表达的
缺失会引起显著的表型差异. 利用 RNA 干涉技术抑
制棉花(Gossypium hirsutum)胚珠中 SUS3 基因的表
达, 可导致纤维细胞分化数目减少, 伸长速度下降以
及次生壁加厚受阻, 并产生无纤维表型[17]. Chourey
等人[18]的研究表明, 玉米(Zea mays L.)SUS 基因家族
中的 Sh1 缺失会引起种粒的缩小及淀粉含量的下降.
Zrenner 等人[19]报道, 在表达 SuSy 反义 RNA 的转基
因马铃薯(Solanum tuberosum L.)中, 块茎总干重降低,
可溶性蛋白减少, 淀粉积累受到抑制, 从而导致产量
下降. D’Aoust 等人[20]发现, 番茄(Solanum lycoper-
sicum L.)中 SuSy反义RNA的表达导致植株生长率变
慢, 座果减少, 成熟时每株果实数量明显减少. Tang
和 Sturm[21]在研究 SuSy cDNA 反义转化的胡萝卜
(Daucus carota L.)时发现, 转基因植株的叶片和根显
著变小, SuSy 活性的降低也导致了整体植株的矮小.
对此有观点认为, 这些农作物的果实种粒密集或体
积较大, 导致了组织内部氧水平的下降, 进而引起
ATP 的供给不足, 为保存能量, 依赖于 SuSy 的蔗糖
代谢途径显得尤为重要, 因为该过程不需要消耗能
量, 此时若 SuSy 的活性降低, 则会引起一系列有害
的效应, 而在转基因拟南芥中可能由于氧限制性代
谢的缺乏, 导致相关表型变化不明显[9]. Bieniawska
等人[22]研究表明, AtSUS1/AtSUS4 双基因突变体拟南
芥在通风良好的条件下可正常生长, 而在氧胁迫条
件下生长被抑制.
木质素组织化学染色的红色区域边缘厚度及透
射电子显微镜分析结果显示, 转基因植株角果内果
皮层细胞次生细胞壁有增厚现象. McCollum 等人[23]
认为, SuSy 的活性在合成淀粉或细胞壁的组织中最
高, 蔗糖被 SuSy 分解为尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG),
可为细胞壁胼胝质及纤维素的合成提供底物 [3,17,24].
Ruan 和 Churey[25]发现, 在棉花无纤维突变体中, 胚
珠 SuSy 活性下降或没有 SuSy 的转录. Persia 等人[26]
研究表明, SuSy与烟草(Nicotiana tabacum)花粉管细胞
壁的合成有关, 从而影响花粉管的形态发生. 由此推
测 , 本实验转基因植株角果中 AtSUS1, AtSUS2 和
AtSUS4 表达代偿性增加可能引起蔗糖分解反应的加剧,
为细胞壁合成提供了更多的 UDPG, 从而造成内果皮
细胞次生细胞壁增厚, 增厚的细胞壁木质化程度也较
野生型高. 植物发育越成熟, 木质化程度越高[27,28], 在
8DAF 及 13DAF 的角果中, 转基因植株内果皮层细
胞的木质化程度高于野生型植株, 表明在该阶段转
基因植株角果的发育更为优先, 成熟较早. 通过统
计角果的产率及成熟率, 也发现转基因植株角果的
这两项指标均高于野生型, 进一步支持了上述结论.
Angeles-Núñez 和 Tiessen[29]通过研究 SUS2, SUS3 突
变体拟南芥 9~21DAF 的种子发现, 野生型植株与突
变体植株的淀粉含量、己糖/蔗糖比率以及脂肪酸含
量在 9DAF 的种子中差异显著, 突变体植株的各项指
柴静等: RNA 干涉 AtSUS3 影响拟南芥 SUS 家族表达模式及角果成熟

624
标均高于野生型植株, 随着种子的发育, 差异逐渐减
小. 说明 SUS 突变体植株的种子发育早于野生型植
株, 这与本实验结论一致.
综上所述, 拟南芥中 SUS3 基因的沉默不影响植
株在正常条件下的生长发育, 且还能促使该家族中
AtSUS1, AtSUS2 及 AtSUS4 基因表达的代偿性增加,
使转基因植株的角果内果皮细胞次生细胞壁增厚 ,
有助于角果的发育及成熟. 但在逆境胁迫下, AtSUS3
基因的沉默是否也能促使该家族中其他基因代偿性
表达, 使植株正常生长, 还有待进一步深入研究.

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AtSUS3 with RNA interference affects sucrose synthase gene family expression
and siliques maturation in Arabidopsis thaliana
CHAI Jing, QIANG Yi, JIA RongRong, MAO JieLi, QU ShengXian & YU JiaNing
College of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China

Sucrose synthase, a key enzyme to sucrose metabolism, plays an important role in plant growth and development. We
constructed RNAi-SUS3 vector and transferred it into Arabidopsis using Agrobacterium tumefacien mediated vacuum
infiltration for analyzing the function of SUS3. We investigated each AtSUSs expression pattern in transcriptional level
and compared phenotype in both wild and transgenic plants. We stained lignin of siliques via Wiesner reaction and
observed endocarp cells by using transmission electron microscopy. The results show that AtSUS3 transcriptional
expression is suppressed in transgenic plants with no significant phenotypes changing under normal growth condition.
However, in transgenic siliques, the expression of AtSUS1, AtSUS2 and AtSUS4 increase for compensation AtSUS3
silence. As a result, the secondary wall of endocarp cells in transgenic siliques is thickened and the lignification degree
is also enhanced. Compared with wild types, the siliques matured earlier and the valves are thinked in transgenic
plants during fruit development and maturity. We conclude that AtSUS3 silence may promote siliques maturation.

sucrose synthase, RNA interference, compensation, Arabidopsis thaliana, silique

doi: 10.1360/052010-549