全 文 ：分子植物育种，2008年，第6卷，第2期，第286-290页
MolecularPlantBreeding,2008,Vol.6,No.2,286-290
研究报告
ResearchReport
植物RNA干涉载体的构建并用于拟南芥芥子酶基因的表达
吴宇佳 张家明 *
中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海口,571101
*通讯作者,jmzhang@vip.163.com
摘 要 为了研究RNA干涉在抑制芥子酶基因TGG4和TGG5表达中的作用，本文在TGG4、TGG5编码序列
中设计IT45siRNA的特异靶序列，以拟南芥7SL-4基因为模板扩增启动子和终止子，连接并克隆到植物表达
载体pBP5中，构建成了siRNA真核表达载体。同时利用花序浸泡法转化拟南芥。最后酶活测定的结果显示，
TGG4、TGG5基因的表达受到了大部分抑制。这说明本研究构建的RNAi载体对基因表达沉默是有效的。
关键词 RNA干涉,表达载体,芥子酶,TGG4,TGG5,基因表达
ConstructionofRNAiVectorsandtheirUseinMyrosinaseGeneDownreg-
ulationinArabidopsis
WuYujia ZhangJiaming*
InstituteofTropicalBiotechnology,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Haikou,571101
*Corespondingauthor,jmzhang@vip.163.com
Abstract TostudytheefectofRNAiinexpressionregulationofmyrosinasegeneTGG4andTGG5,targetsites
ofTGG4andTGG5weredeterminedbyalignmentanalysisandBLASTsearches.Thepromoter(7SL-p)andthe
3-untranscribedregion(7SL-t)ofAt7SL4genefromArabidopsisthaliana(Columbiaecotype)werecloned,and
assembledtoformsiRNAexpressionmodule.Themodulewassubclonedintothemulti-cloningsiteinpBP5.The
RNAifragmentofTGG4andTGG5wasinsertedbetween7SL-pand7SL-t,thus,agene-silencevectorwascon-
structed.TheArabidopsiswastransformedbyfloraldip.20linesoftransformantswereobtained.Myrosinaseac-
tivityassayindicatedthatTGG4andTGG5expressionwasmostlyinhibitedinthetransformants.Theresults
demonstratedthatthevectorisefectiveforgenesilencinginplants.
Keywords RNAi,Expressingvector,Myrosinase,TGG4,TGG5,Geneexpression
研究者们发现在许多种属中引入双链 RNA都
可以引起特异性的基因沉默，他们把这种现象称为
RNA干涉。RNAi技术已成为一种成熟的研究动植
物基因功能和复杂信号传导过程的简便而高效的
方法。
芥子酶防御系统为白花菜目植物特有，由芥子
酶及其底物硫代葡萄糖苷组成。芥子酶和硫代葡糖
苷分别储藏在不同的细胞中，在受到病虫侵袭时，底
物和酶相遇，硫代葡糖苷被降为有毒化合物，起防御
作用(BonesandRossiter,1996)。拟南芥曾经被认为
仅有3个芥子酶基因即TGG1、TGG2和TGG3(Xue
etal.,1995)，其中，TGG3是不能编码完整芥子酶的
假基因 (Zhangetal.,2002)。RT-PCR研究结果表明
TGG1和 TGG2在叶片、子叶、茎、和花器中表达
(Zhangetal.,2002)。这一结果也与Xue等(1995)人的
原位杂交结果一致。近年，张家明等通过对拟南芥
(Arabidopsisthaliana)基因组数据库的搜索，又发现3
个核基因，分别命名为 TGG4、TGG5、TGG6，它们的
某些片段的编码产物与芥子酶相似 (张家明,待发表
数据)。进一步与芥子酶的cDNA序列比对，找到了
它们的大部分编码序列。用RT-PCR和RACE的方
法克隆到TGG4、TGG5的全长cDNA。在酵母中表达
的TGG4和TGG5重组蛋白具有很强芥子酶活性。
RT-PCR和 Real-timePCR研究结果表明，TGG4和
基金项目：本研究由国家自然科学基金资助项目(30571064)资助
TGG5基因仅在拟南芥根部特异表达，在植物其它部
位均不表达。而TGG1和TGG2的表达部位刚好相
反。
本实验以拟南芥Columbia生态型为材料，利用
RNA干涉技术，试图通过对特异基因表达的抑制，
获得TGG4和TGG5基因沉默突变体，为进一步研究
拟南芥芥子酶基因的生物学功能提供基础。
1材料与方法
1.1植物材料
实验材料为拟南芥Columbia生态型的野生株。
1.2酶和主要试剂
本实验所用酶和质粒提取纯化试剂盒是大连宝
生物工程公司的产品；蛋白质浓度测定试剂盒是申
能博彩生物科技有限公司的产品；葡萄糖氧化酶-
过氧化物法葡萄糖测定试剂购于上海荣盛生物技术
有限公司；3STrizolTotalRNAIsolationKit是申能
博彩生物科技有限公司的产品；MMLV第一链合成
试剂盒是上海生工生物工程公司的产品。
1.3质粒和菌株
质粒pUC18、pBP5所用质粒、农杆菌菌株C58
和大肠杆菌菌株DH5α均由本实验室保存。
1.4siRNA真核表达载体的构建
参考Lu等 (2004)的方法，提取拟南芥基因组总
DNA，用7SLpF和7SLpR扩增出7SL-4基因的515bp
的片段作为载体的启动子部分；7SLtF和7SLtR扩增
出7SL-4基因的229bp的片段作为终止子部分。克
隆进质粒pUC18中，命名为pUC18pt。在芥子酶基因
TGG4、TGG5编码序列中设计IT45siRNA的特异靶
序列，根据siRNA表达载体的要求合成四条具有回
文结构的长链寡核苷酸：正向序列 5-GATCCC
CTGGATGGGACTATTTCACGTTCAAGA
GACGTGAAATAGTCCCATCCATTTTTT
GGAAACTGCA-3，反向序列 5-GTTTCCAAA
AAATGGATGGGACTATTTCACGTCTCT
TGAACGTGAAATAGTCCCATCCAGGG-3。
然后将正、反向序列退火形成双链DNA，即取2μL，
正、反向序列(终浓度均为10μmol/L)，加入1μL重
蒸水。复性条件为95℃5min；85℃1min；75℃1min；
65℃1min；55℃1min，冷却至室温。用限制性内切
酶BamHⅠ、PstⅠ消化质粒pUC18pt，纯化消化得到
的DNA片段。将纯化的DNA片段和以上所得的复
性产物—基因特异的干扰片段连接，转化感受态细
胞DH5α。重组质粒依次命名为pUC18pIT45t。在氨
苄青霉素抗性平板上筛选重组载体。扩增抗性菌落
并按照标准的碱裂解法提取质粒，酶切鉴定后，进一
步测序证实。用 7SLpF和 7SLtR扩增 pUC18pt、
pUC18pIT45t，将扩增片段进行KpnⅠ、HindⅢ酶切，
插入到经KpnⅠ、HindⅢ酶切的植物表达载体pBP5
中，分别命名为pBP5pt、pBP5pIT45。其中pBP5pt为
对照空白载体；pBP5pIT45t为siRNA真核表达载体。
引物合成和测序由上海闪晶生物公司完成。所用引物
如下：7SLpF:5-TTCGGTACCTGGTTCTGAGTAGG
GTTATTGCG-3,KpnⅠ;7SLpR:5-AAGGGATCCA
AGATCGGTTCGTGTAATATATAAAC-3,BamHⅠ;
7SLtF:5-ATTCTGCAGTTTTGATTTTGTTTTCCAA
AACTTTCT-3,PstⅠ;7SLtR:5-GGTAAGCTTGGTG
TTGATCACAACGATACAATTG-3,HindⅢ。
载体构建过程见图1。
1.5根癌农杆菌介导的拟南芥花序浸泡转化
拟南芥转化采用植株顶部即将开放的花蕾，在
转化前 1d，摘掉同一花序上其余的花、蕾及幼荚，
浇透水；将 pBP5pt、pBP5pIT45t电击转化农杆菌
C58，制备好农杆菌菌液10mL，转入含氨苄青霉素
25mg/L、氯霉素50mg/LYEP培养基的大瓶培养过
夜。第二天，当菌液OD600在1.2~1.6之间时取出使
用。室温2800×g离心15min，弃上清，沉淀悬浮于
相应体积的渗透培养基 (1/2MS,蔗糖5%,1mg/mL
的6-BA母液 10μL/L,0.04%吐温 20)(韩红岩等,
2003)中，使OD600在0.8左右。将农杆菌悬浮液倒在
小烧杯中，将长有拟南芥的培养杯倒扣其上，保证莲
座叶以上部分浸没于液体中浸泡。取出植株后，横放
在塑料盘中，用保鲜膜封好以保持湿度，放在恒温室
培养。第二天打开，竖直培养，仍用保鲜膜保持湿度3d
后正常培养。根据情况可隔3~5d再浸染两次(首次
浸泡8min,第二次10~15min,第三次8~10min)。尔
后要及时去掉长出的幼蕾，检查结荚情况。培养3~4
周待种子成熟后收取种子，于干燥器中存放。利用壮
观霉素(10mg/L)进行转基因植株筛选，抗性植株经
练苗后移栽。
1.6酶活测定
将野生型和转基因植株进行同期培养，种于灭
菌营养土中，控制培养条件基本达到无虫害影响，采
用生长至10~14片真叶植株进行芥子酶活性测定。
植物RNA干涉载体的构建并用于拟南芥芥子酶基因的表达
ConstructionofRNAiVectorsandtheirUseinMyrosinaseGeneDownregulationinArabidopsis
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分子植物育种
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图1RNAi载体构建过程
Figure1SchematicdiagramforconstructionoftheRNAiexpressionvector
取拟南芥野生和转基因植株的根，加入芥子酶
提取缓冲液 (50mmol/LTris-HClpH7.5;0.15mol/L
NaCl;1mmol/LEDTA;1mmol/LPMSF)研磨至匀
浆，10000×g离心10min，取上清。蛋白质标准曲线
制备及样品测定参见申能博彩生物科技有限公司的
蛋白质质量测定试剂盒说明书。葡萄糖标准曲线制
备参见上海荣盛生物技术有限公司的葡萄糖氧化
酶—过氧化物法葡萄糖测定试剂说明书。
由标准曲线算出总蛋白含量后，将野生与各转
基因株的总蛋白稀释到相同浓度后各取2~6μL(视
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植物RNA干涉载体的构建并用于拟南芥芥子酶基因的表达
ConstructionofRNAiVectorsandtheirUseinMyrosinaseGeneDownregulationinArabidopsis
蛋白浓度加入)反应，分别加入2反应缓冲液 (柠檬
酸盐 citrate100mmol/L,pH4.5)10μL、10×抗坏血
酸盐(3mmol/L)2μL、10×底物黑芥子硫苷酸钾溶液
(sinigrin100mmol/L)2μL，最后加入ddH2O至20μL。
混匀后37℃反应30min，95℃5min终止反应，冷却
后加入葡萄糖测定试剂(上海荣盛)500μL。37℃反
应10min，测OD500。根据芥子酶降解底物产生的葡
萄糖的量来计算酶活性。
2实验结果
2.1siRNA真核表达载体的鉴定
将启动子和终止子克隆进质粒pUC18中后，命
名为pUC18pt。经KpnⅠ、HindⅢ双酶切pUC18pt检
测证明成功连接了启动子和终止子片段 (图2)。在
pUC18pt上连接基因特异的干扰片段，重组质粒命
名为 pUC18pIT45t。分别用 7SLpF和 7SLtR扩增
pUC18pt、pUC18pIT45t，将扩增片段进行 KpnⅠ、
HindⅢ双酶切后插入到植物表达载体pBP5中，分别
命名为pBP5pt、pBP5pIT45t。其中pBP5pt为对照空
白载体；pBP5pIT45t为 siRNA真核表达载体。经
KpnⅠ、HindⅢ双酶切检测，证明连接了IT45siRNA
的特异靶序列dsDNA片段(图3)。最后用测序的方
法确认载体正确。
图2pUC18pt双酶切鉴定结果
注:1~2:pUC18pt的KpnⅠ、HindⅢ双酶切;3:pUC18的KpnⅠ、
HindⅢ双酶切;4:分子量标准
Figure2IdentificationofpUC18ptdigestedbyKpnⅠandHindⅢ
Note:1~2:pUC18ptdigestedbyKpn1andHindⅢ;3:pUC18di-
gestedbyKpnⅠandHindⅢ;4:DL2000+DL15000Markers
图3pBP5pt、pBP5pIT45t双酶切鉴定结果
注:1:分子量标准;2:pBP5pt的 KpnⅠ、HindⅢ双酶切;3:
pBP5pIT45t的KpnⅠ、HindⅢ双酶切
Figure3IdentificationofpBP5ptandpBP5pIT45tdigestedby
KpnⅠandHindⅢ
Note:1:DL2000+DL15000Markers;2:pBP5ptdigestedbyKpnⅠ
andHindⅢ;3:pBP5pIT45tdigestedbyKpnⅠandHindⅢ
2.2转化植株筛选
转化后，利用植物表达载体赋予转基因植株的抗
性于壮观霉素抗性培养基上进行筛选(10mg/L)。转基
因植株幼苗为绿色，未转基因的植株幼苗由于不具壮
观霉素抗性，逐渐黄化死亡，最后只剩绿色的转基因
植株存活(图4A)。将具有抗性的幼苗移出培养，成熟
后收获T1代种子。上述方法筛选T1代种子，绿色苗:
黄化苗=3:1，说明基因转入为单克隆转化子(图4B)。
未黄化植株成熟后收获T2代种子。T2代经筛选，得到
图4筛选抗性转基因植株
注:A:T0代筛选抗性转基因植株,箭头指向为转基因株;B:T1
代筛选抗性转基因植株;绿色转基因抗性苗:黄化苗=3:1
Figure4Screenthetransgeneseedlings
Note:A:ScreentheT0transgeneseedlings,thearowedplaces
arethetransgeneseedlings;B:ScreentheT1transgeneseedlings,
theratiooftransgeneseedlingstountransgeneseedlingsis3:1
1 2 3 4
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分子植物育种
MolecularPlantBreeding
稳定遗传的T3代纯合子品系。
2.3酶活分析
将同期培养的野生型和转基因植株分别采用生
长至10~14片真叶和开花植株进行根部酶活检测。
以哥伦比亚野生型和未连入基因特异干扰片段的空
载体转化株为对照。多次测量取平均值后进行酶活
分析，结果显示RNAi转化植株根部酶活显著降低。
酶活力分析见图5。
3讨论
芥子酶是十字花科蔬菜自我防御体系的一个重
要酶，在硫代葡萄糖苷—芥子酶防御体系中的芥子
酶起到降解硫代葡萄糖苷的作用，其降解产物中有
些在农业上起到抗虫的作用，硫代葡萄糖苷-芥子
酶防御体系在植物与昆虫长期协同进化过程中起非
常重要的作用；在医学上其降解产物有抗癌作用
(Smithetal.,1998;Kushadetal.,1999)，因此对于芥
子酶基因的功能研究十分必要。
RNAi比反义核酸技术有效，比基因敲除技术简
单。由于在植物中利用RNAi技术仍需要通过转化
载体导入能产生发夹结构RNA或双链RNA的表达
单位，方便有效的RNAi表达载体的构建成为高效
利用RNAi技术的关键。本载体构建快捷并成功实
现其抑制芥子酶基因的目的，可为芥子酶的功能基
因组研究奠定一定的基础。
张家明等认为TGG4和TGG5属于一个芥子酶
基因新家族，cDNA序列分析结果显示TGG4、TGG5
图5酶活力分析图
注:显示RNAi转化植株根部酶活显著低于野生对照及空载
体对照
Figure5Schematicdiagramformyrosinaseactivity
Note:MyrosinaseactivityassayindicatedthatTGG4andTGG5
expressionwasmostlyinhibitedinthetransformants
与 TGG1-3相似性均低于 60%，基因结构上比
TGG1-3多一个外显子，且仅在拟南芥根部特异表
达，在植物其它部位均不表达，而TGG4与TGG5相
似性达97.7%。因此，在成功干扰TGG4、TGG5基因
表达量后，分析拟南芥的生理生长变化对于研究拟
南芥芥子酶基因家族各基因的功能分工及相互作用
有着很大的意义(张家明,待发表数据)。目前还不清
楚是否存在不同基因编码的酶对底物有不同的要
求。但有证据显示，拟南芥的TGG1和TGG2的功能
是冗余的 (BarthandJander,2006)。那么 TGG4和
TGG5的功能是否也是冗余的呢？对于芥子酶基因新
家族的研究还有待更进一步的深入。
参考文献
BarthC.,andJanderG.,2006,ArabidopsismyrosinasesTGG1and
TGG2haveredundantfunctioninglucosinolatebreakdown
andinsectdefense,PlantJ.,46(4):549-562
BonesA.,andRossiterJ.T.,1996,Themyrosinase-glucosinolate
system,itsorganisationandbiochemistry,Physiol.Plant,97:
194-208
HanH.Y.,CuiD.C.,ZhangY.M.,andLiuT.Z.,2003,Transgenic
ArabidopsistransformedwithantisensephospholipaseDγ
(PLDγ)geneobtainedbydipmethod,ShandongNongye
DaxueXuebao(JournalofShandongAgriculturalUniversi-
ty(NatureScienceEdition),34(1):19-23(韩红岩,崔德才,
张岳民,刘天臻,2003,Dip法获得转反义磷脂酶 Dγ
(PLDγ)基因拟南芥植株,山东农业大学学报 (自然科学
版),34(1):19-23)
KushadM.M.,BrownA.F.,KurilichA.C.,JuvikJ.A.,KleinB.P.,
WaligM.A.,andJeferyE.H.,1999,Variationofglucosino-
latesinvegetablecropsofBrassicaoleracea,J.Agric.Food
Chem.,47(4):1541-1548
LuS.F.,ShiR.,TsaoC.C.,YiX.P.,LiL.G.,andVincentL.C.,
2004,RNAsilencinginplantsbytheexpressionofsiRNA
duplexes,NucleicAcidsResearch,32(21):71
SmithT.K.,LundE.K.,andJohnsonI.T.,1998,Inhibitionof
dimethylhydrazine-inducedaberantcryptfociandinduction
ofapoptosisinratcolonfolowingoraladministrationofthe
glucosinolatesinigrin,Carcinogenesis,19(2):267-273
XueJ.,J!rgensenM.,PhilgrenU.,andRaskL.,1995,Themyrosi-
nasegenefamilyinArabidopsisthaliana:geneorganisation,
expressionandevolution,PlantMol.Biol.,27(5):911-922
ZhangJ.,BoP.,XueJ.,andRaskL.,MeijerJ.,2002,Thethirdmy-
rosinasegeneTGG3isapseudogenebutspecificalyex-
pressedinstamenandpetal,PhysiologiaPlantarum,115(1):
25-34
290