全 文 ：第4 3卷第 3期 上海师范大学学报(自然科学版) Vol ． 43，No． 3
2 0 1 4 年 6 月 Journal of Shanghai Normal University(Natural Sciences) Jun ． ，2 0 1 4
DOI:10． 3969 /J． 1SSN． 100 － 5137． 2014． 03． 006
转录因子 TDF1 对拟南芥雄性不育突变体
atms1 的温敏调控机制研究
郑亚洁，高 贝，夏群芳，周树敏，张 卫
(上海大学 生命科学学院 上海市能源作物育种及应用重点实验室，上海 200444)
摘 要:TDF1 作为 MYB家族的转录因子，参与了胼胝质的降解过程，并控制绒毡层的分化从
而影响着花粉粒的正常发育．以一株通过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变 Col － 0 野生型拟南芥获得
的温敏雄性不育突变体 atms1(ambient temperature － sensory male sterility1)对温度敏感机制进行
了研究．通过构建 TDF1 反义 ＲNA表达载体，在 atms1 突变体背景下抑制 TDF1 的表达来观察
突变体花粉育性的变化，发现在 27℃时的 atms1 突变体花粉的育性得以恢复．这一结果表明在
花粉发育的过程中 TDF1 对 ATMS1m 具有一定的调控作用．
关键词:atms1;温敏雄性不育;TDF1;花药育性;Ｒeal － time PCＲ
中图分类号:Q 94 文献标识码:A 文章编号:1000-5137(2014)03-0259-07
收稿日期:2014-03-27
基金项目:国家自然科学基金面上项目(30870225) ;上海市教委浦汇人才计划(08PJLH05500)
通信作者:张 卫，中国上海市上大路 99 号上海大学生命科学学院，邮编:200444，E-mail:zhw62207@ shu． edu． cn
在拟南芥的花药发育过程中，已知有一些转录因子在调控中起到决定性的作用［1］:如 bHLH家族的
转录因子，MYB家族的转录因子等［2］． 其中 MYB 家族的转录因子如:TDF1［3 － 5］(TAPETAL DEVELOP-
MENTAND FUNCTION1)编码的是 MYB － Ｒ2Ｒ3 家族的转录因子．它主要在绒毡层以及小孢子母细胞中
表达，突变体中因绒毡层发育异常，导致胼胝质无法降解，使得小孢子聚集在花粉囊中，不能形成正常的
花粉粒，最终引起雄性不育表型．
本实验室在前期的研究中得到了 1 株在非胁迫温度范围内花粉育性受温度显著影响的拟南芥温敏
雄性不育突变体 atms1［6］．在 16 ℃时，该突变体育性与野生型相似，花粉全部可育;但随温度的升高，育
性逐渐下降，到 23 ℃时，突变体花粉有一半表现为不育;而到 27℃时，突变体花粉则全部不育．经过对
突变基因的图位克隆，发现该突变体在 AT1G62940 基因上的第四外显子 202 bp 处发生点突变，由“G”
变为“A”(图 1 ～ 2) ，ATMS1 编码的蛋白第 398 个氨基酸由野生型的甘氨酸变为天冬氨酸．
图 1 AT1G62940 基因上的第四外显子上发生点突变
本实验就是通过在拟南芥 atms1 突变体中过量表
达 TDF1反义 ＲNA，结合对 atms1 温敏雄性不育表型
的分析，拟从遗传分子水平初步探究其中的作用机制．
1 材料与方法
1． 1 材 料
Col － 0 生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana)及 atms1 温敏雄性不育突变体种子由本实验室提供．
上海师范大学学报(自然科学版) 2014 年
图 2 ATMS1 CDS序列上的突变位点
菌株 DH5ɑ(E． Coli)和 GV3101(Agrobacterium tumefaciens)为本实验室自制感受态细胞并保存;载体
pCAMBIA －1300 为本实验室所有并改造后使用;载体 pMD18 － T、DNA Marker、各种限制性内切酶、T4
连接酶均购自 TaKaＲa公司．
1． 2 方 法
1． 2． 1 植物 cDNA的提取
Col野生型拟南芥 23 ℃条件下培养，待其抽薹后，取花序，迅速置于液氮中，Trizol 法提取 ＲNA，反
转录得 cDNA，Trizol等试剂及 cDNA反转录试剂盒均购自 TaKaＲa公司．
1． 2． 2 引物设计及 TDF1 基因片段的克隆
自 www． arabidopsis． org网站上下载 TDF1 的 CDS序列，大小为 954 bp．根据 CDS 序列设计引物，上
下游引物两端分别添加 Sal I和 Xba I酶切位点．引物由上海生工生物工程公司进行合成．
引物序列为:上游 F(Sal I)5 － GCGTCGACATGGGAAGACCTCCTTGTT －3，
下游 Ｒ(Xba I)5 － CGTCTAGACTAATAATCGAAATCATTCAAGAG －3．
采用 PCＲ方法对目的序列进行扩增，扩增采用 TaKaＲa公司生产的 KOD PCＲ扩增试剂盒．
扩增条件参数为:
变性:94 ℃ 2 min
98 ℃ 30 s
退火:58 ℃ 30 s
延伸:
}
68 ℃ 1 min
32 cycles ．
68 ℃ 10 min
10 ℃ 10 min
由高保真聚合酶扩增得到的 PCＲ产物割胶回收后，加 PolyA并纯化，与 pMD18 － T载体连接，得到
pMD18 － T － TDF1．采用热激法将重构的 T质粒转化到大肠杆菌 DH5ɑ 感受态细胞中进行扩增，重组 T
质粒经酶切鉴定正确后送往上海美吉公司进行测序．
1． 2． 3 表达载体构建
图 3 为本实验室改造后的 pCAMBIA －1300 质粒图谱．首先，将 p1300 质粒用 Sal I、Xba I 进行酶切
062
第 3 期 郑亚洁，高 贝，夏群芳，等:转录因子 TDF1 对拟南芥雄性不育突变体 atms1 的温敏调控机制研究
并回收质粒片段．然后从 pMD18 － T载体上切取
图 3 p1300 质粒多克隆位点示意图
测序正确的带有 Sal I、Xba I 酶切位点的 TDF1
CDS片段，回收后连入 p1300 质粒中，并将重组质
粒转化大肠杆菌进行筛选和鉴定．
1． 2． 4 农杆菌的转化与鉴定
采用热激法将重组质粒 p35S:TDF1(－)转
化到根癌农杆菌 GV3101 中．在含有 Ｒifa，Kana 和
Gen三重抗性的 YEP固体培养基上进行筛选，挑取单菌落进行 PCＲ 检测． 将鉴定正确的菌落接种到
YEP液体培养基中进行扩增培养，利用浸染法［7 － 9］转化拟南芥 atms1 杂合子植株，收取 T0 代种子．
1． 2． 5 阳性苗筛选及鉴定
用 50 μg /mL潮霉素 B(Hygromycin B)对转化的 T0 代种子进行筛选，待抗性板上长出阳性苗后，将
其移入土中生长．直至抽薹后，取 2 ～ 3 片叶子，用 Edwards一步抽提法提取植株基因组 DNA，进行遗传
背景鉴定．
引物序列为:与突变体匹配上游 F(M) :5 － AGCCAATGTGTAATGCAAGA －3，
与 WT匹配上游 F(WT) :5 － AGCCAATGTGTAATGCAAGG －3，
通用下游 Ｒ:5 － TGGACGGCTCTAACCTTC －3．
扩增条件参数为:
变性:94 ℃ 2 min
94 ℃ 30 s
退火:50 ℃ 30 s
延伸:
}
72 ℃ 40 s
25 cycles ．
72 ℃ 10 min
10 ℃ 10 min
1． 2． 6 花药育性观察
将阳性植株置于 23 ℃的培养间生长，待其抽薹后，分两组分别放到 16、27 ℃的人工气候培养箱中
培养，2 d后重新置于 23 ℃培养间中生长，取温度处理时处于花药发育第八期的花，用亚历山大染色法
处理后，观察花粉育性．
1． 2． 7 过量表达植株 Ｒeal － time PCＲ检测
常温培养拟南芥 atms1 突变体和 p35S:TDF1(－)转基因植物，抽薹后平均分成两组，分别移至 16
和 27 ℃处理 24 h后，取花序，抽提 ＲNA反转录成 cDNA，以此为模板进行荧光定量 PCＲ的检测，选用的
仪器是 BIOＲAD IQ5，管家基因 UBQ10 作为内参，反应体系为 20 μL，如下:
SYBＲ Primix Ex Taq (2 ×) 10 μL
F primer (10 ×) 0． 4 μL
Ｒ primer (10 ×) 0． 4 μL
DNA 模板 2 μL
ddH2O 7． 2 μL
TOTAL 20 μL
Ｒeal － time PCＲ 扩增条件参数为:
95 ℃ 30 s
95 ℃ 5 s }60 ℃ 30 s 40 cycles．
162
上海师范大学学报(自然科学版) 2014 年
表 1 Ｒeal － time PCＲ 所用引物
AGI Annotation 5→3 Primer Sequences(F /Ｒ) Primer Efficiency Amplicon Length(bp) Amplicon TM(℃)
AT1G62940 ATMS1
CTGACAAACTTACACTGCCTGAAT
AGTCCGAGAGATGTCAACGCT
0． 73 ± 0． 01 157 67． 6
AT3G28470 TDF1
CAAAAAAGCAGGTCTGAATCGAG
GGAAGACCACCTGCTGCCAATGG
0． 81 ± 0． 01 151 69． 3
AT4G05320a UBQ10
GGCCTTGTATAATCCCTGATGAATAAG
AAGAGATAACAGGAACGGAAACATAGT
0． 91 ± 0． 02 61 70． 4
2 结果与分析
2． 1 目的片段过量表达载体构建
根据合成引物的退火温度，设计温度梯度测试，得到最佳退火温度为 58 ℃，然后进行 PCＲ扩增，得
到 970 bp左右的目的条带(图 4)．目的片段连入 pMD18 － T 质粒，经扩增、筛选和鉴定后进行测序，在
NCBI网站上对测序结果进行比对分析，显示匹配率 100%;将目的片段连入 pCAMBIA － 1300 质粒，构
建成 p35S:TDF1(－)过量表达载体，用 Xba I、Sal I酶对重组质粒进行酶切，得到约 970 bp 的条带及剩
余载体条带(图 5) ，以上结果说明正确的目的基因被成功连入了 pCAMBIA － 1300 质粒，构建成了反义
ＲNA载体．
1:扩增产物条带;M:分子 marker
图 4 TDF1 CDS扩增
1、2:p35S:TDF1(－)过表达质粒载体;M:分子 marker
图 5 p35S:TDF1(－)表达载体的酶切鉴定
2． 2 转基因植株的鉴定
转基因鉴定采用扩增 TDF1 CDS全长的引物，阳性苗中会扩增出 2 个条带，分别约为 1230、970 bp，
前者为 TDF1 的 Genomic序列，后者为 TDF1 的 CDS序列，为目的条带． atms1 背景鉴定采用实验室已有
SNP引物(图 2) ，目的片段大小为 523 bp，即:若使用 F(M)/Ｒ、F(WT)/Ｒ引物同时 PCＲ转基因植株的
基因组 DNA，只有 F(M)/Ｒ扩增出目的条带，则该植株为 atms1 突变体纯合子;若只有 F(WT)/Ｒ 引物
能够扩增出目的条带，则该植株为野生型;若两对引物都能扩增出条带，则该转基因植株背景为 atms1
杂合子．对 12 株阳性苗基因组进行 PCＲ鉴定，显示其中 9 株为转基因植株，分别为 1、2、3、4、5、6、8、9、
10 号(图 6) ，然后再将这 9 株植物进行 atms1 背景的鉴定，结果显示转基因植株 1、2、3、4、5、8、9、10 号
为 atms1 杂合子，6 号为野生型(图 7)．
262
第 3 期 郑亚洁，高 贝，夏群芳，等:转录因子 TDF1 对拟南芥雄性不育突变体 atms1 的温敏调控机制研究
1 ～ 12:阳性苗;+:阳性对照;M:分子 marker
图 6 转基因植物 PCＲ鉴定
1 ～ 6、8 ～ 10:转基因阳性苗;F(M)Ｒ:突变体基因扩增引物;F(WT)/Ｒ:野生型基因扩增引物
图 7 转基因植物 atmsl背景鉴定
2． 3 花药育性观察
将鉴定后 1、2、3 号阳性苗进行传代，在 T3 代植株中筛选获得既是转基因纯合子又是 atms1 纯合子
背景的植株．通过温度处理后，对花粉育性进行观察． 结果显示:atms1 突变体在 16 ℃时花粉粒饱满呈
红色，育性良好(图 8A) ;27℃时花药中的花粉粒呈绿色，且降解呈碎片状，表现为完全不育(图 8B) ;而
转基因 atms1 植株的花药花粉在 16、27 ℃时育性都得到恢复(图 8C、D)．
A、B:atms1 突变体 16、27 ℃处理的花药;C、D:p35S:TDF1(－)转基因 atms1 植株 16、27 ℃处理的花药(Bars为 20 μm)
图 8 不同温度下转基因植物的花粉亚历山大染色
2． 4 Ｒeal － time PCＲ
温度处理后的 atms1 突变体和转基因植物经 Ｒeal － time PCＲ检测结果显示(图 9) :atms1 突变体中
TDF1 的表达量 16 ℃处理组远高于 27 ℃处理组;而在 p35S:TDF1(－)转基因 atms1 中，16、27 ℃组
TDF1 的表达量与 16 ℃atms1 相比明显下降，说明转基因植株中 TDF1 的转录水平受到明显下调，但是
362
上海师范大学学报(自然科学版) 2014 年
与 atms1 突变体27℃的表达量比较，总体水平还是略有增加．另外，ATMS1m 表达量在 atms1 中呈现16 ℃
处理组高于 27 ℃处理组，约为 27 ℃处理组的 5 倍，而在 p35S:TDF1(－)转基因 atms1 中 ATMS1m 的表
达量在16 ℃和 27 ℃时都较 atms1 突变体 27 ℃时有所增加，这说明 ATMS1m 的表达量的上升对于突变
体 atms1 育性的恢复有积极的作用．
A:p35S :TDF1 (－)转基因植株和 atms1 突变体中，TDF1 的表达;
B:p35S :TDF1 (－)转基因植株和 atms1 突变体中，ATMS1m 的表达
图 9 p35S:TDF1(－)转基因植物和 atms1 中 TDF1、ATMS1m 的转录表达
3 讨 论
ATMS1 是目前已知的第一个在非胁迫温度变化范围内直接影响拟南芥雄性不育性状的基因．在 at-
ms1 突变体中，16 ℃时 ATMS1m mＲNA的积累量明显高于 27 ℃的积累量，表明转录水平上的变化可能
导致了该突变体育性随温度不同而发生变化，即:27 ℃时花药完全不育，23 ℃时呈现部分不育，16 ℃时
育性与野生型相同．
TDF1 是 MYB － Ｒ2Ｒ3 家族的转录因子． 它的突变体中胼胝质无法降解使得小孢子聚集在花粉囊
中，表现为完全不育［10］．通过在 atms1 突变体中导入用于降低 TDF1 转录水平的反义 ＲNA表达载体，发
现在 p35S:TDF1(－)转基因植株中 TDF1 的表达量明显下降，约为 atms1 突变体 16 ℃时的四分之一，
表明 p35S:TDF1(－)这个反义 ＲNA表达载体在拟南芥体内有效地抑制了 TDF1 的表达．但这种抑制作
用还不足以使转基因植物表现出 tdf1 突变体的表型［10］;Ｒeal － time PCＲ的结果显示 p35S:TDF1(－)反
义 ＲNA虽然抑制了 TDF1 的表达，但与 atms1 突变体在 27 ℃的情况比较，TDF1 的表达量还是有所提高
的，反应到 ATMS1m 的表达水平上就更加明显，p35S:TDF1(－)转基因 atms1 中不论 16 ℃还是 27 ℃，
ATMS1m 的表达水平都高于 atms1 突变体在 27 ℃的水平．这提示在拟南芥体内 ATMS1m 的表达量可能
存在一个阈值，低于此阈值时，植株表现为完全不育，高于此阈值时，对植株育性的影响较小． 而 TDF1
又正调控于 ATMS1m 的表达;当 TDF1 表达受抑制时，ATMS1m 的表达量也会减少，但只有当 ATMS1m 表
达量低于一定阈值时，花粉的育性才会受到显著影响．而这个阈值可能就是 ATMS1m 在 27 ℃的表达水
平．因此，本研究认为 TDF1 对 ATMS1m 具有一定的正向调控作用，通过 ATMS1m 表达水平的变化最终影
响花粉育性的变化，而对于其中更深入的调控机制则有待于进一步的研究．
462
第 3 期 郑亚洁，高 贝，夏群芳，等:转录因子 TDF1 对拟南芥雄性不育突变体 atms1 的温敏调控机制研究
参考文献:
［1］ 陈丽．植物转录因子的结构与功能［J］．植物生理学通讯，1997，33(6):401 － 409．
［2］ JIN H L，CATHIE M． Multifunctionality and diversity within the Plant MYB － gene family ［J］． Plant Mol Biol，1999
(41):577 － 585．
［3］ ZHU J，CHEN H，YANG Z N． Defective in Tapetal development and function 1 is essential for anther development and ta-
petal function for microspore maturation in Arabidopsis［J］． Plant J，2008，55(2):266 － 277．
［4］ ZHANG W，SUN Y，TIMOFEJEVA L，et al． Ｒegulation of Arabidopsis tapetum development and function by DYSFUNC-
TIONAL TAPETUM1 (DYT1)encoding a putative bHLH transcription factor［J］． Development，2006，133(16):3085
－ 3095．
［5］ YANHUI C，XIAOYUAN Y，KUN H，et al． The MYB transcription factor superfamily of Arabidopsis:expression analysis
and phylogenetic comparison with the rice MYB family［J］． Plant Mol Biol，2006，60(1):107 － 124．
［6］ 戴文懿，孙亚梅，高贝，等．拟南芥温敏雄性不育突变体 atms1 的获得及表型分析［J］．上海大学学报，2011，17(5):
681 － 686．
［7］ 樊荣，万小荣，张文涛，等． LE － ACS6 启动子在 LE － ACS6: :GUS 转基因拟南芥中的特异性［J］．植物生理与分子
生物学学报，2004，30(3):351 － 358．
［8］ 张秀春，李文彬，夏亦荠，等． AtNUDT8 过量表达的拟南芥转基因植株［J］．热带生物学报，2010，1(1):9 － 10．
［9］ 张好富，张宪银．一种不依赖于无菌培养的拟南芥活体转基因种子筛选方法［J］．浙江大学学报:农业与生命科学
版，2009，35(4):372 － 376．
［10］ 陈辉．拟南芥雄性不育突变体 tdf1 的基因克隆和功能分析［D］．上海:上海师范大学，2007．
Ｒeaserch on temperature-sensitive regulation mechanism of
transcription factor TDF1 to thermo-sensitive male sterile mutant
atms1 of arabidopsis thaliana
ZHENG Yajie，GAO Bei，XIA Qunfang，ZHOU Shumin，ZHANG Wei
(Shanghai Key Laboratory of Bio － Energy Crops，School of Life Sciences，Shanghai University，
Shanghai 200444，China)
Abstract:TDF1 is a transcription factor of MYB family． It is involved in the process of callose degradation and regulating the ta-
petum differentiation，thus affecting the normal development of pollen． This paper investigates the temperature － sensitive mecha-
nism of an Arabidopsis male sterile mutant atms1 (ambient temperature － sensory male steility1)obtained by screening in the
progeny generations of wild － type Col － 0 mutagenized by EMS． TDF1 Antisense ＲNA vector was introduced into atms1 back-
ground to inhibit the expression of TDF1 to observe the changes of atms1 mutant pollen fertility． We found that the fertility was re-
stored at 27 ℃ ． The results show that TDF1 may have regulatory effects on ATMS1m in the process of pollen development．
Key words:atms1;temperature － sensory male sterile;TDF1;anther fertility;Ｒeal － time PCＲ
(责任编辑:顾浩然)
562