全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(3): 541548 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31071454), 教育部新世纪优秀人才项目(NCET-10-0693)和中央高校基本科研业务费专项(QN2009008)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 于澄宇, E-mail: yu1009@nwsuaf.edu.cn; 董振生, E-mail: dzs05319@163.com
第一作者联系方式: E-mail: suiyun112123@163.com
Received(收稿日期): 2011-09-05; Accepted(接受日期): 2011-12-15; Published online(网络出版日期): 2012-01-04.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120104.1652.018.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00541
甘蓝型油菜光、温敏雄性不育系 Huiyou50S花粉败育的
细胞学观察
葛 娟 1 郭英芬 1 于澄宇 1,* 张国云 2 董军刚 1 董振生 1,*
1西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100; 2西北农林科技大学大型仪器设备管理中心, 陕西杨凌 712100
摘 要: Huiyou50S 是从甘蓝型油菜品种汇油 50 中发现的半不育株选育而成的光、温敏雄性不育系, 育性受隐性核
基因控制, 在高温、长光周期下不育而在低温、短光周期条件下可育。本文通过半薄树脂切片、扫描电镜、花粉压
片染色、花药整体透明方法对 Huiyou50S及其近等基因系 Huiyou50F的花药发育过程及花粉形态观察比较。结果表
明, Huiyou50S的花药造孢细胞、花粉母细胞、减数分裂、四分体阶段均正常, 在单核期出现明显异常, 虽然能形成
花粉壁, 但小孢子细胞质收缩、解体, 最终只剩余空瘪的花粉壳; Huiyou50S 的花药绒毡层在单核后期提前降解, 绒
毡层解体速度快于可育株 Huiyou50F。Huiyou50S的小孢子的完全败育主要发生在单核时期, 绒毡层发育与小孢子异
常有某种关联, 该结论为油菜光、温敏雄性不育类型划分及育种应用提供了依据。
关键词: 甘蓝型油菜; 光、温敏雄性不育; 花粉败育; 小孢子; 细胞学
Cytological Observation of Anther Development of Photoperiod/Thermo-
sensitive Male Sterile Line Huiyou50S in Brassica napus
GE Juan1, GUO Ying-Fen1, YU Cheng-Yu1,*, ZHANG Guo-Yun2, DONG Jun-Gang1, and DONG Zhen-Sheng1,*
1 College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2 Management centre for large equipment, Northwest A&F University,
Yangling 712100, China
Abstract: A photoperiod/thermo-sensitive male sterile line, named Huiyou50S, was developed from a spontaneous semi-sterile
plant found in Brassica napus cultivar Huiyou50. The male sterility of Huiyou50S was controlled by recessive nuclear genes.
Huiyou50S presents male sterile under high temperature and long photoperiod condition, and fertility under low temperature and
short photoperiod. The cytological characters of pollen and the anther development of Huiyou50S at the different stages were
compared with its near isogenic line Huiyou50F, which is the male fertile sibling, by techniques including semi-thin sections, scan
electronic microscopy, pollen grains staining with aceto-carmine, and whole anther clearing with methyl salicylate. The result
indicated that the anther development of Huiyou50S was similar to that of Huiyou50F from sporogenous cell, pollen mother cell,
meiosis, to tetrad stage. At the uni-nucleate stage, although the exine formed, the protoplast of microspores condensed, and the
cell became empty. At last all cellular content of pollen degraded completely and only the empty and distorted shell remained. The
tapetum development of Huiyou50S was similar to that of Huiyou50F up to tetrad stage, but its tapetal cells rapidly disintegrated
at the uni-nucleate stage, which occurred earlier than that in Huiyou50F, while the tapetum of Huiyou50F did not degenerate at
this stage. In conclusion, the microspores of Huiyou50S abort mainly at the uni-nucleate stage, and there are some associations
between pollen abortion and tapetal cells’ disintegration. This result is helpful to classification and utility of photoperiod/thermo-
sensitive genic male sterility.
Keywords: Brassica napus; Photoperiod/thermo sensitive genic male sterility; Pollen abortion; Microspore; Cytology
油菜同其他作物一样, 品种间存在明显的杂种优势。
油菜杂种优势的利用途径主要有细胞质雄性不育、细胞核
雄性不育、光温敏核不育、自交不亲和、化学杀雄、基因
工程雄性不育等[1]。甘蓝型油菜中相继发现湘油 91S[2]、
H90S[3]、N196S[4]、373S[5]等隐性核基因控制的光、温敏
雄性不育系。与细胞质雄性不育相比, 光、温敏核不育具
542 作 物 学 报 第 38卷

有广泛的恢复源, 组配杂交组合比较自由, 具有更大的杂
种优势潜力。目前已经有光、温敏核不育两系杂交种湘杂
油 5号[6]等通过品种审定。
研究不同类型油菜雄性不育系败育时期的细胞学特
征[7-15], 对于雄性不育系的分类、育种应用具有十分重要
的意义。一般将油菜花药的发育分为孢原细胞分化时期、
造孢细胞分化时期、花粉母细胞分化期与减数分裂期、单
核花粉期、二核花粉期和三核花粉期等不同发育阶段[10-15],
油菜细胞质、细胞核不育材料可基本划分为无花粉囊型、
花粉母细胞败育型与单核花粉败育型 3个大类[10-15]。作为
一类新的雄性不育类型, 油菜光、温敏雄性不育的花药发
育及细胞学败育机理的研究很少报道。近年来温敏细胞质
雄性不育系 533S[7]、光、温敏核不育 373S[8]、H50S[9]的
花粉发育过程已有报道。
1999 年, 课题组从甘蓝型油菜品种汇油 50 中发现 1
株半不育株, 经过连续分离纯化选育出一种光、温敏核不
育系 Huiyou50S, 其育性主要受隐性核基因控制。Huiyou
50S 在陕西关中秋播, 次年春季初花期表现可育或半不育,
随着温度升高、光周期延长后, 逐渐转变为全不育。在人
工控制温度和光周期条件下, Huiyou50S 败育较课题组选
育的另一类似不育系 373S更为彻底。本试验对Huiyou50S
的小孢子发育过程进行半薄切片细胞学观察 , 并在扫描
电镜下对成熟花粉粒进行观察比较 , 探讨小孢子败育时
期、方式和特点, 旨在为光、温敏雄性不育类型划分及两
系杂交种的选育奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
由 Huiyou50S 的早代材料中不育株、可育株连续的
姊妹交得到近等基因系 Huiyou50S和 Huiyou50F。秋季播
种材料, 12月初通过春化后移栽温室内培养。温室内人工
光源为 Philips SonT Agro 430 生长灯, 照度大于 1 000
µmol m2 s1, 设置光周期为昼 13 h/夜 11 h, 温度为昼
24℃/夜 18℃。
1.2 Huiyou50F和 Huiyou50S花发育过程比较
在盛花期, 采集 Huiyou50S 和 Huiyou50F 新鲜开放
的花各 40朵, 以游标卡尺测量 8个指标, 即花冠径、花瓣
长、花瓣宽、雌蕊长、雄蕊长(四强雄蕊和二弱雄蕊)、花
药长、花丝长和花柄长 , 采用专业统计软件 SPSS11.0
(http://www.spss.com/spss)分析所得数据。
1.3 花粉粒扫描电镜观察
取当天开放的花朵, 将花粉直接粘于双面胶上(因花
粉易散失, 不进行固定、脱水、干燥处理), 转移至扫描电
镜专用的金属台上, 以 LB3 型离子溅射仪镀上一层金属
膜后, 用日本产 JSM6360LV型扫描电镜观察。
1.4 小孢子发育观察
油菜开花后 , 取不同大小不育株和可育株花药 , 挤
压雄蕊释放小孢子, 以 1%醋酸洋红染色后镜检, 确定小
孢子发育各个时期, 分组取样, 迅速投入 4%戊二醛, 抽
气令花蕾浸没, 4℃固定 24 h。后固定及半薄切片方法基本
同杨光圣等[11]。
1.5 油菜花药整体透明观察方法
花期采集发育成熟但未开放花蕾, 以卡诺氏液固定,
4℃放置。透明前去掉固定材料的花瓣, 用 75%、95%、
99%和 100%乙醇梯度溶液脱水, 时间各为 2 h。然后在乙
醇∶冬青油＝4∶1, 3∶2, 1∶3的溶液中分别过渡 2 h, 最
后在冬青油中透明过夜, 用 Olympus BX51显微镜的微分
干涉模式观察。
2 结果与分析
2.1 Huiyou50S和 Huiyou50F花发育过程比较
近等基因系 Huiyou50S 和 Huiyou50F 的花蕾发育过
程差异比较明显 , 可育花药在发育过程中始终比较饱满
肥大, 颜色由黄绿色逐渐变为浅黄色, 最终可以释放大量
花粉。不育花药在 3 mm长度以后开始肉眼可见异常, 花
药纤细, 颜色前期暗绿, 后期褐黄, 至成熟期花丝较短、
花药干瘪, 不能释放有活力的花粉(图 1)。
与 Huiyou50F相比, Huiyou50S花朵也为浅黄色, 花
瓣平展, 雄蕊 6 枚, 四强二弱。但可育株与不育株的花器
形态表现不同(表 1)。所测的参数中, 除花瓣长度外都具有
显著差异, 其中雄蕊长、花药长和花丝长差异都达到极显
著水平。不育株的花冠大小、花瓣长、花瓣宽均稍小于可
育株 , 雄蕊和花丝均明显短于可育株 , 但雌蕊和花柄稍
长。不育株花器最明显的特征主要表现在雄蕊上, 雌蕊形
态正常, 经授粉可以正常结实, 可见 Huiyou50S的不育基
因表达对雌性器官的发育影响甚微。
2.2 花粉扫描电镜观察结果
可育株 Huiyou50F 的花粉绝大多数形态完好, 很少
畸形(图 2-A)。可育花粉粒为椭圆型, 外形饱满。花粉壁
表面呈网状, 网眼不规则, 具有 3条萌发沟(图 2-B)。半不
育株花药上可育、不育花粉粒共存(图2-C)。不育株 Huiyou
50S 花粉粒很少, 花粉粒畸形, 且明显比可育花粉小, 干
瘪、形态不规则, 花粉壁在萌发沟处内陷(图 2-D)。
2.3 花药发育的细胞学特点
2.3.1 可育花药 Huiyou50F 的花药发育与普通油菜
一致。在花药的 4个角隅处形成药室内壁、中层、绒毡层
和造孢细胞(图 3-A)。进入减数分裂期, 花粉母细胞变为
椭圆形 ; 绒毡层细胞体积增大 , 个别细胞可见双核 (图
3-B)。减数分裂后形成四分体, 呈四面体型, 由胼胝质包
裹, 绒毡层收缩(图 3-C)。单核初期, 刚释放出来的游离小
孢子形状不规则 , 细胞壁很薄 , 细胞质浓厚且染色较深
(图 3-D)。小孢子液泡化, 细胞核被挤向一边, 进入单核靠
边期, 花粉外壁开始发育(图 3-E)。单核晚期, 细胞壁逐渐
加厚且趋于圆球形, 绒毡层持续降解(图 3-F)。单核小孢子
发生有丝分裂后, 进入二核期, 绒毡层只余残迹(图 3-G)。
生殖核再次有丝分裂形成 2个精核, 花粉粒趋于成熟(图
第 3期 葛 娟等: 甘蓝型油菜光、温敏雄性不育系 Huiyou50S花粉败育的细胞学观察 543




图 1 Huiyou50F、Huiyou50S的花蕾发育过程比较(标尺刻度单位为 1 mm)
Fig. 1 Comparison of buds development between Huiyou50F and Huiyou50S (scale=1 mm)
I: 单核期; II: 单核后期; III: 双核期; IV: 三核期; V: 花粉成熟期; VI: 开花期。
I: uni-nucleate; II: late uni-nucleate; III: bi-nucleate; IV: tri-nucleate; V: mature pollen; VI: flowering.

表 1 开花期 Huiyou50S和 Huiyou50F的花器性状比较
Table 1 Comparison of flower traits between Huiyou50S and Huiyou50F at flowering stage (mm)
育性类型 Types of male sterility 花器特性
Flower trait 汇油 50F Huiyou50F 汇油 50S Huiyou50S
花冠径 Diameter of corolla 19.67±1.51 19.03±1.11*
花瓣长 Length of petal 9.06±0.79 8.82±0.60
花瓣宽 Width of petal 7.86±0.57 7.48±0.52**
雌蕊长 Length of pistil 11.32±1.46 12.14±1.45*
四强雄蕊长 Length of four stronger stamens 10.01±0.34 6.22±0.47**
二弱雄蕊长 Length of two weaker stamens 7.41±0.68 5.14±0.44**
四强花药长 Length of four stronger stamens’ anther 2.90±0.34 2.66±0.14**
二弱花药长 Length of two weaker stamens’ anther 2.86±0.33 2.64±0.15**
花丝长 Length of four long filaments 7.12±0.41 3.56±0.46**
花柄长 Length of stalk 13.02±1.63 14.04±2.08*
表中所列数据均为平均值±标准偏差(n= 40)。*差异达到显著水平; **差异达到极显著水平。
All data are average ±standard deviation (n= 40). * and ** mean significance at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

3-H)。花粉压片后经醋酸洋红染色为暗红色, 表明花粉内
染色质丰富(图 3-I)。
2.3.2 不育花药 与可育株相比, 不育株的花药也能
分化出 4 个花粉囊, 呈蝴蝶形排列, 花粉囊内细胞均被染
色, 核质染色深浅一致, 核仁清晰(图 4-A)。绒毡层紧临造
孢细胞, 紧密排列呈环状; 表皮和药室内壁清晰可辨, 中
层很薄(图 4-B)。进入减数分裂期, 胞间层消失, 花粉母细
胞由多边形变为椭圆形, 各细胞间隔明显; 绒毡层细胞体
544 作 物 学 报 第 38卷



图 2 Huiyou50F、Huiyou50S花粉粒的扫描电镜图
Fig. 2 Scan electronic microscopic structure of Huiyou50F and Huiyou50S
A: 可育花粉; B: 可育花粉; C: 半不育花粉; D: 不育花粉。
A: fertile pollen grains; B: fertile pollen grains; C: partially sterile pollen grains; D: sterile pollen grains.

积增大, 可见有双核(图 4-C)。四分体由胼胝质包裹, 绒毡
层出现大液泡, 中层被挤压解体(图 4-D)。可见从孢原细
胞时期至四分体时期, 花药发育基本正常。
然后胼胝质溶解 , 四分体释放小孢子 , 刚游离的小
孢子形状不规则, 细胞核位于中间, 细胞壁很薄, 绒毡层
紧贴药室内壁(图 4-E)。在单核期, 小孢子细胞质收缩, 细
胞内出现空腔 , 绒毡层细胞提供合成花粉外壁和小孢子
发育所需的营养而逐渐收缩(图4-F)。花粉接受绒毡层提供
的孢粉素等使外壁发育。单核后期可以清楚看到三边加厚,
但与正常花药发育相比, 绒毡层提前降解并快速解体(图
4-G)。小孢子内未出现明显的液泡, 原生质体降解(图 4-H),
小孢子挤压粘连堆积在一起 , 花粉囊壁只余表皮与药室
内壁(图 4-H~I)。对应正常油菜的二核期, Huiyou50S花粉
细胞内容物消失殆尽, 只剩空花粉壳, 绒毡层完全消失,
药室变形(图 4-J)。对应于 Huiyou50F的花粉成熟期, Huiyou
50S 花粉细胞内物质完全降解, 只余空瘪的花粉壳堆积在
药室内, 花粉壳形状扭曲畸形(图 4-K), 花粉压片后经醋
酸洋红处理难以着色(图 4-L)。后期形成的畸形花粉和图
2-D 的扫描电镜结果一致。细胞学观察结果表明 Huiyou
50S的花粉败育发生于单核期, 属小孢子败育型。
2.4 花药整体透明观察
成熟期的花药经冬青油整体透明处理显示, 正常油
菜 Huiyou50F花药中广泛分布花粉, 数目众多, 形态近似
球形, 外形完整, 壁细胞仍可见(图 5-A), 不育系 Huiyou50S
花药内则出现空白区域, 小孢子数目减少, 且大都破裂变
形, 壁细胞塌陷(图 5-B)。与图 2-D 所看到的扫描电镜、
半薄切片(图 4-K)结果一致。
3 讨论
3.1 花粉败育时期
前人已经对植物花粉败育做了大量细胞学研究[7-26]。
Laser等[17]认为被子物雄性不育系花粉败育的方式和时期
是多种多样的, 双子叶植物花粉败育则多在四分体时期
或单核早期。Sanders 等[18]观察比较了几百种不同的拟南
芥雄性不育诱变系, 发现其败育的时期、方式各不相同。
余凤群等[10]把国内的常见不育系分成无花粉囊型、花粉母细
胞败育型以及单核花粉败育型 3 大类。Polima CMS[12]、
nap CMS[13]和 533S[7]等属于无花粉囊败育型, Hau CMS则
败育很早, 在雄蕊原基分化期[14], Ogura CMS在四分体至
单核期败育[15], NCa CMS的花药败育发生在单核晚期[16],
而多数核不育材料在花粉母细胞至单核花粉期败育[8-12]。
目前关于油菜光温敏雄性不育系花药败育的细胞学研究
很少。油菜生态不育系 533S 花药发育受阻于孢原细胞时
期[7], 属无花粉囊型不育系。光温敏核不育系 373S 败育
发生于单核晚期[8], 而光温敏核不育系 H50S 的花粉败育
始于单核早期, 绒毡层延迟退化 [9]。本文对 Huiyou50S
第 3期 葛 娟等: 甘蓝型油菜光、温敏雄性不育系 Huiyou50S花粉败育的细胞学观察 545




图 3 Huiyou50F花粉囊及小孢子发育过程
Fig. 3 Cytological structure of the anther and microspore of Huiyou50F
A: 造孢细胞, ×400; B: 花粉母细胞, ×400; C: 四分体时期, ×400; D~F: 单核期, D, F×200, E, ×400; G: 双核期, ×200; H: 成熟花粉,
×200; I: 醋酸洋红染色的成熟花粉, ×400。
A: sporogenous cell, ×400; B: microspore mother cell, ×400; C: tetrad stage, ×400; D–F: uni-nucleate stage, D and F, ×200, E, ×400;
G: bi-nucleate stage, ×200; H: mature pollen grains, ×200; I: mature pollen grains stained with aceto-carmine, ×400.

的花粉发育的细胞学观察表明 , 小孢子的发育在减数分
裂、四分体时期均正常, 花粉败育主要发生在单核期, 属
于单核花粉败育型, 且绒毡层提前降解, 与孙晓敏等 [8-9]
的研究结果有所不同, 说明Huiyou50S可能是一种具有新
特点的光、温敏不育系。
3.2 花粉败育原因
Glover 等[19]认为任何干扰雄蕊发育、孢原细胞分化
或开花的基因突变, 均有可能导致植物的雄性不育。谢潮
添等 [20]总结了引起花粉败育的诸多因素, 包括绒毡层发
育、ATP酶、Ca2+浓度、细胞骨架和细胞程序性死亡等。
绒毡层位于药室最内层 , 是花粉母细胞及花粉的保护层
和营养物质提供者, 尤其是其分泌的胼胝质酶对四分体释
放小孢子, 分泌的孢粉素等对花粉外壁形成必不可少[21-22],
因此许多学者认为植物雄性不育的发生与绒毡层细胞的
发育异常有关 [21-25], 绒毡层细胞降解的提前或者延迟都
将导致雄性不育。Scoles和 Evans[25]将由绒毡层导致的小
孢子败育分为两类, 一类是绒毡层细胞过度肥大, 侵占药
室而挤压小孢子; 另一类是绒毡层细胞提前解体, 胼胝质
不能适时酶解, 小孢子不能及时释放出来, 解体的绒毡层
细胞形成周原质团, 侵入药室引起小孢子败育。但谢潮添
等 [26]从花药超微结构的观察中得出相反的因果关系, 认
为绒毡层细胞结构与功能的异常是由于花粉败育失去了
对绒毡层细胞营养物质的需求引起的。
Huiyou50S 在四分体时期之前小孢子发育正常, 绒
毡层细胞的发育亦无明显异常。单核前期, 绒毡层向小孢
子输送孢粉素等营养物质使得花粉外壁正常发育, 但中
546 作 物 学 报 第 38卷



图 4 Huiyou50S的花粉囊及小孢子发育过程
Fig. 4 Cytological structure of the anther and microspore of Huiyou50S
A: 造孢细胞, ×400; B: 花粉母细胞, ×400; C: 减数分裂期, ×200; D: 四分体期, ×200; E~I: 单核期 G, ×400; E, F, H, I: ×200; J: 双核期,
×200; K: 败育花药, ×200; L: 醋酸洋红染色的败育花粉, ×400。
A: sporogenous cell, ×400; B: microspore mother cell, ×400; C: meiosis, ×200; D: tetrad stage, ×200; E–I: uni-nucleate stage G, ×400;
E, F, H, I, ×200; J: bi-nucleate stage, ×200; K: sterile anther, ×200; L: aborted pollen stained with aceto-carmine, ×400.

后期绒毡层迅速解体, 小孢子未及液泡化, 绒毡层便已退
化消失, 小孢子原生质体开始收缩、降解。绒毡层的解体
和单核花粉的解体有关联 , 推测可能和其他雄性不育一
样 , 绒毡层的过早衰亡使其无法向花粉囊内小孢子提供
营养成分和信号, 使小孢子无法液泡化, 导致花粉败育。
鉴于显微观察只能发现细胞结构的差异 , 而超微观察可
以发现细胞器水平的异常 , 败育的原因还需要通过超薄
切片在电镜下进一步观察确认。
第 3期 葛 娟等: 甘蓝型油菜光、温敏雄性不育系 Huiyou50S花粉败育的细胞学观察 547




图 5 Huiyou50F(A)与 Huiyou50S(B)的花药整体透明比较
Fig. 5 Comparison of the transparent anther between
Huiyou50F (A) and Huiyou50S (B)
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