全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(11): 19521961 http://zwbx.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(31271715)和国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2012AA10A309)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 陈明, E-mail: chenming02@caas.cn, Tel: 010-82108750
第一作者联系方式: E-mail: zhxh2493@126.com, Tel: 029-87032493
Received(收稿日期): 2013-04-07; Accepted(接受日期): 2013-06-09; Published online(网络出版日期): 2013-08-01.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130801.1725.005.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01952
拟南芥 G蛋白 α亚基 GPA1互作蛋白铜离子结合蛋白 AtBCB的鉴定
及功能分析
张小红 1 许鹏博 1,2 郭萌萌 1,2 徐兆师 2 李连城 2 陈 明 2,* 马有志 2
1 西北农林科技大学生命科学学院, 陕西杨凌 712100; 2 中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科
学工程 / 农业部麦类生物学与遗传育种重点实验室, 北京 100081
摘 要: 拟南芥 G蛋白复合体(异源三聚体包括 α、β、γ亚基)参与植物多个信号转导途径, G蛋白复合体通过膜上的
G蛋白偶联受体(GPCR)接受胞外信号后通过 3个亚基将信号传递给下游效应器。目前, 有关植物 G蛋白复合体的效
应器及其信号传递途径的报道较少, 寻找新的 G蛋白的效应器有助于阐明 G蛋白复合体相关的信号传导途径。本研
究以拟南芥 G 蛋白 α 亚基 GPA1 为诱饵蛋白, 利用泛素分离系统筛选拟南芥 cDNA 文库, 获得一个与 GPA1 互作的
铜离子结合蛋白 AtBCB。荧光双分子杂交(BiFC)试验证明, GPA1 与 AtBCB 的互作发生在细胞膜上。基因表达特性
分析结果显示, GPA1和 AtBCB受金属铝胁迫的诱导表达。进一步以野生型拟南芥(WT)、GPA1拟南芥突变体 gpa1-4
和 AtBCB拟南芥突变体 bcb为材料, 研究该基因对植物耐金属铝胁迫的功能, 结果显示, 在无胁迫情况下, 2个突变
体和 WT根部的丙二醛含量无显著差异; 在 100 µmol L–1 Al3+处理下, gpa1-4突变体根部丙二醛含量显著(P<0.05)低
于 WT低; bcb根部丙二醛含量极显著(P<0.01)高于 WT。对 3个铝胁迫响应基因(苹果酸转运体基因 AtALMT1、半类
型 ABC转运蛋白基因 ALS1和 ABC转运蛋白基因 ALS3)的表达进行 Real-time PCR分析, 比较它们在突变体和野生
型之间的表达差异, 发现在有铝和无铝处理情况下, ALS1和 ALS3的表达水平在突变体和 WT间均无显著差异; 在铝
处理下, gpa1-4中 AtALMT1的表达量极显著高于 WT; 在 bcb中的表达量显著低于 WT。以上结果表明, 植物通过细
胞膜上的 G 蛋白 α 亚基 GPA1 和铜离子结合蛋白 AtBCB 的相互作用调控下游基因 AtALMT1 的表达, 参与植物对铝
胁迫的响应, 其中 GPA1对铝胁迫耐受起负向作用, AtBCB对铝胁迫耐受起正向作用。
关键词: G蛋白; 泛素分离系统; 蛋白互作; 铝离子胁迫; 双分子荧光互补
Characteristic and Function Analysis of a Copper Ion Binding Protein, AtBCB
Interacting with G Protein α Subunit GPA1 in Arabidopsis thaliana
ZHANG Xiao-Hong1, XU Peng-Bo1,2, GUO Meng-Meng1,2, XU Zhao-Shi2, LI Lian-Cheng2, CHEN Ming2,*,
and MA You-Zhi2
1 College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2 Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sci-
ences / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae
Crops, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China
Abstract: Heterotrimeric G protein, including three subunits of α, β, and γ, is involved in a lot of signaling pathways in plants. It
receives extracellular signals via G-protein coupled receptor (GPCR) and transmits them to the downstream effectors by the three
subunits. Till now, the downstream effectors and signaling pathway related to G-protein complexes have been rarely reported.
Furthermore, identifying more novel G protein effectors would be helpful to elucidate signaling pathway associated with the G
protein complex. In order to find some novel effectors, G protein α subunit (GPA1) was used as a biat to screen interaction protein
in Arabidopsis by the split-ubiquitin screening system in this study. One of the GPA1-interacting proteins was identified as copper
ion binding protein, AtBCB. The interaction between GPA1 and AtBCB was verified on cell membrane by BiFC (bimolecular
第 11期 张小红等: 拟南芥 G蛋白 α亚基 GPA1互作蛋白铜离子结合蛋白 AtBCB的鉴定及功能分析 1953
fluorescence complementation). The expressions of GPA1 and AtBCB were confirmed to be induced by aluminium stress. To study
the function of the two genes, we treated Arabidopsis mutant gpa1-4 and bcb, in which GPA1 and AtBCB were knocked out, with
100 µmol L–1 Al3+, respectively, and then measured MDA (malonaldehyde) content in roots. The results showed that MDA content
in both mutant and WT (wild type) under normal condition was no significant difference, but when exposured to 100 µmol L–1
Al3+ the content in gpa1-4 was lower than that in WT (P<0.05), and it in bcb was higher than that in WT (P <0.01). Furthermore,
the expression patterns of three responsive genes of ALMT1, ALS1 and ALS3 to aluminum toxicity were analyzed by Real-time
PCR. The results showed that no matter the condition with or without aluminum stress, the expression of ALS1 and ALS3 appeared
no significant difference in the mutants and WT. However, in the treatment with less than 100 µmol L–1 Al the expression level of
ALMT1 in gpa1-4 was higher than that in WT, and the expression level of ALMT1 in bcb was lower than that in WT. In short,
GPA1 and AtBCB directly interact in the cell membrane, and regulate the expression of the downstream gene of ALMT1. In the
tolerance process to aluminum stress in plants, GPA1 plays a negative role but AtBCB has positive effect.
Keywords: G protein; Split-ubiquitin system; Protein interaction; Aluminium ion stress; BiFC
G 蛋白复合体是一个异源三聚体, 由 α、β 和 γ
亚基组成。目前, 拟南芥中发现一个 α 亚基 GPA1,
一个 β 亚基 AGB1, 3 个 γ 亚基 AGG1、AGG2 和
AGG3[1]。G蛋白信号传导途径广泛存在于动植物体
内 , 主要由 G 蛋白偶联受体 (G-protein coupled
receptor, GPCR)接受外界信号, 再将信号通过 α、β
或者 βγ二聚体传递给下游的效应器, 最终引起细胞
产生一系列生理生化的应答反应。研究表明, G蛋白
参与植物对光[2-4]、激素[5-6]和糖[7]等信号的传导, 也
参与对离子通道的调控[1,5,8]以及对病原菌的防卫反
应[9]等过程。寻找 G 蛋白的互作蛋白, 对于发现新
的 G蛋白的效应器以及揭示 G蛋白相关的信号途径
具有重要意义。Lapik等[10]用酵母双杂交方法筛选出
一个与 G 蛋白 α 亚基互作, 并参与调控种子萌发和
早期幼苗发育的蛋白因子 AtPirin。Assmann等[11]发
现, GPCR 受体蛋白 GCR1 与 GPA1 互作, 并调控
ABA的信号传导过程。GPA1与磷脂酶 D(PLD)的互
作依赖于 PLD蛋白中的DRY氨基酸序列的存在, 并
依赖于二者的互作调节彼此的活化状态[12]。利用反
向 Ras 拯救系统[13-14], 苑国良[15]发现 GPA1 与一个
质膜定位的蛋白AtXB31互作, 并可能参与Xcc8004
病原菌的信号调控过程。Kaufman 等 [16]研究发现,
GPA1 可以和拟南芥的预苯酸水解酶 PD1 互作并激
活 PD1, 从而激活其自身苯丙氨酸的合成途径, 使
拟南芥在低剂量 UV 下免受损伤。Friedman 等[17]通
过遗传学方法发现, ARD1与 G蛋白 β亚基 AGB1互
作, 并参与下胚轴的发育过程。Tsugama 等[18]发现
AGB1与蛋白磷酸酶 PP2C52互作。目前, 有关植物
G 蛋白复合体的效应器及其信号传递途径的报道较
少。同时, G蛋白复合体成员参与植物对金属离子胁
迫的应答还未见报道。
G蛋白的 3个亚基中, G蛋白 α亚基不仅可以和
膜上接受信号的 GPCR 类蛋白结合, 并将信号传递
给下游的效应器, 同时也具有 GTP 的水解酶活性,
影响 β和 γ亚基的活性, 因此, 在G蛋白相关信号途
径中, G蛋白 α亚基发挥重要的作用。本实验以拟南
芥G蛋白 α亚基GPA1为诱饵, 通过泛素分离系统[19]
筛选拟南芥 cDNA 文库, 获得一个 GPA1 的互作蛋
白-铜离子结合蛋白 AtBCB, 对 GPA1参与植物对铝
胁迫的应答反应机制进行初步分析, 为阐明 G 蛋白
途径在调控植物胁迫应答过程中的作用模式提供了
新的线索。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料 野生型拟南芥(Columbia 生态
型, WT)由本实验室保存, 拟南芥 G 蛋白 α 亚基
GPA1 (AT2G26300)突变体 gpa1-4和 AtBCB (AT5G
20230)的突变体 bcb 购于 Arabidopsis Biological
Resource Center (ABRC)。
1.1.2 菌株和载体 酵母菌株 NMY51、pDHB1
质粒和 pPR3N 质粒购于 Dualsystems Biotech 公司,
GFP、YFPN和 YFPC质粒以及拟南芥 cDNA 文库由
本实验室保存。
1.1.3 试验试剂 限制性内切酶和 T4 DNA连接
酶购于 Promega 公司; X-α-gal 购于 Sigma 公司; 其
他化学药品为国产分析纯试剂。引物合成和测序由
北京三博远志生物技术有限责任公司完成。
1.2 利用泛素分离系统筛选拟南芥 cDNA文库
通过 PCR方法扩增 GPA1的全长 CDS序列, 并
将其克隆到诱饵载体 pDHB1。泛素分离系统筛选文
库的方法及酵母转化所用培养基的配制均按
Dualsystems Biotech 公司 hunter 系统操作说明书
(http://www.dualsystems.com/, P01601-P01629)。先将
诱饵载体 pDHB1-GPA1-Cub 单独转入 NMY51 酵母
细胞 , 再将 cDNA 文库质粒转入含诱饵载体
1954 作 物 学 报 第 39卷
pDHB1-GPA1-Cub 的酵母感受态细胞, 将转化产物
涂于选择性平板 SD/–Trp–Leu–His–Ade (含 1.5
mmol L–1 3-AT)。挑取选择性平板上的单克隆重新点
于含 X-α-gal 的选择性平板, 观察报告基因 LacZ 的
表达活性。提取 3 个报告基因(His+、Ade+和 LacZ+)
均为阳性的酵母单克隆质粒, 转入大肠杆菌 TOP10
(TIANGEN, 北京), 选取阳性克隆菌送至三博远志
生物技术公司测序, 并对结果进行 Blast比对分析。
1.3 利用泛素分离系统验证 GPA1 与 AtBCB
互作
对阳性克隆进行测序和 Blast比对分析, 获得一
个 GPA1的互作蛋白 AtBCB。将 AtBCB的全长 CDS
序列克隆到捕获载体 pPR3N。将诱饵载体 pDHB1-
GPA1-Cub 和捕获载体 pPR3N-NubG-BCB 共同转化
到 NMY51 酵 母 感 受 态 细 胞 中 , 分 别 涂 于
SD/–Trp–Leu和 SD/–Trp–Leu–His–Ade (含 1.5 mmol
L–1 3-AT)选择性平板 , 30℃培养 3~5 d。从
SD/–Trp–Leu–His–Ade 选择性平板上挑取 3 个单克
隆, 分别培养至 OD600等于 0.6~0.8后, 取 1 μL点于
含 40 mg L–1 的 X-α-gal 选择性平板 SD/–Trp–
Leu–His–Ade (含 1.5 mmol L–1 3-AT), 观察报告基
因 LacZ 的表达活性。同时设置对应的阴性对照
试验。
1.4 GPA1 和 AtBCB 的亚细胞定位和双分子荧
光互补(BiFC)
将 GPA1 和 AtBCB 与 GFP 融合表达, 构建
35S::GPA1-GFP和 35S::BCB-GFP亚细胞定位载体。
将 GPA1与 YFPN, AtBCB与 YFPC融合表达, 构建成
35S::GPA1-YFPN和 35S::BCB-YFPC双分子荧光互补
表达载体。采用基因枪轰击法[20]将 35S::GFP对照质
粒、35S::GPA1-GFP和 35S::BCB-GFP单独转入洋葱
表皮细胞; 将 35S::GPA1-YFPN和 35S::BCB-YFPC
及阴性对照组合分别共同转化洋葱表皮细胞。25℃
黑暗培养 12~16 h后于 Zeiss LSM700激光共聚焦显
微镜下观察。每个转化重复 3次。
1.5 gpa1-4和 bcb纯合突变体鉴定
将订购的 gpa1-4和 bcb突变体种子分别用 75%
的酒精消毒处理 5 min, 用 0.5%的次氯酸钠灭菌处
理 10 min, 再用高压灭菌的蒸馏水洗涤 3 次。将无
菌的种子在 4℃, 黑暗条件下春化 4 d。用牙签将春
化后的种子点播在 MS 固体培养基上, 在培养室培
养(16 h光照/8 h黑暗; 22℃) 10 d后, 将突变体的苗
子移栽到装有营养土的花盆中培养至成熟。移栽 14
d 后, 取单株的叶片, 按照植物基因组 DNA 提取试
剂盒(TIANGEN, 北京)的操作说明提取 DNA, 采用
“三引物法”[21]进行纯合突变体的鉴定。利用 T-DNA
Primer Design (http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.
html)设计突变体鉴定引物(表 1)。取鉴定为纯合突变
体的植株叶片 , 按照植物总 RNA 提取试剂盒
(TIANGEN, 北京)的操作说明书提取总 RNA, 采用
RT-PCR的方法分析 GPA1和 AtBCB在WT和突变体
中的表达情况。
1.6 GPA1和 AtBCB的表达分析
将 WT 的种子按照 1.5 的方法消毒处理和春化
后, 按照改进的 Murphy 等[22]方法进行铝离子胁迫
处理。将 5层滤纸平铺于直径 15 cm的培养皿中, 一
层纱布平铺在五层滤纸上面, 向培养皿中加入适量
1/6 MS 液体培养基(MS 培养基的无机盐成分和
表 1 引物序列
Table 1 Primer sequences
引物名称
Primer name
基因座位
Gene locus
正向引物
Forward primer (5–3)
反向引物
Reverse primer (5–3)
AtBC z a At5g20230 AGTTTCCACCGACTGATGTTG TGATTCACGTCGATCAGACAC
GPA1 a At2g26300 TAAAGCTTCGTTTATGCAGCC ATCGCTAAGTCTTTTGTCCCG
LB — ATTTTGCCGATTTCGGAAC —
GPA1 b At2g26300 GATACTGATGAGAATACACAGGCTGCTG ATTGGCATGAATGACTGGAACATAGCTC
AtBCB b At5g20230 TGATACGGAATGGACGAGACCTATGG CTTCTGATACAACTGCCACATCATGCC
ALMT1 At1g08430 CGACAGTGGTGATTGGAGGAGTCAG AAGTTAGAGGCAAGGAGAGAATGTAGATC
ALS1 At5g39040 TCGTAACGTAACAACTGCGCTTATAGG AGTCCTAGCTTCAGAGTCTCATCGAC
ALS3 At2g37330 TTCATGGTCTCTGTCGCCGGTTAC CGTTGAGGAGGACGAGCAAGAAC
ACTIN2/8 At3g18780 GAAATCACAGCACTTGCACC AAGCCTTTGATCTTGAGAGC
a: 突变体 gpa1-4 and bcb鉴定引物; b: RT-PCR引物。
a: primers for identification of homozygous mutants of gpa1-4 and bcb; b: RT-PCR primers.
第 11期 张小红等: 拟南芥 G蛋白 α亚基 GPA1互作蛋白铜离子结合蛋白 AtBCB的鉴定及功能分析 1955
B5培养基的有机成分各稀释 6倍), 待滤纸和纱布被
营养液完全浸透后, 将春化后的种子用无菌牙签直
接点播于纱布上, 将培养皿转移到培养室培养(16 h
光照/8 h黑暗; 22℃)10 d, 将带有幼苗的纱布取出于
含 100 µmol L–1Al2(SO4)3的 1/6 MS液体培养基(pH
4.0)中处理 10 h, 每 2 h取一次根部样品, 提取 RNA,
并用相对定量 PCR方法分析铝离子胁迫处理不同时
间下 GPA1和 AtBCB在 WT中的表达情况。
1.7 铝离子胁迫处理下丙二醛含量测定
将 WT、gpa1-4和 bcb的种子按照 1.6的方法培
养 10 d, 将带有幼苗的纱布取出在无菌蒸馏水中洗
涤 3次, 置含铝离子(终浓度为 100 µmol L1)和不含
铝离子的 1/6 MS液体培养基(pH 4.0)中处理 8 h后,
测定根部丙二醛(MDA)含量[23]。
1.8 铝离子胁迫相关基因的变化
将 WT、gpa1-4和 bcb的种子按照 1.7的方法用
100 µmol L–1 Al2(SO4)3胁迫处理 8 h, 提取根部总
RNA。依照 cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN, 北
京)的操作说明, 取 5 μg总 RNA合成 cDNA第一链,
将 cDNA 原液稀释 5 倍后作为模板待用。实时荧光
定量 PCR反应总体积为 20 μL, 其中含 2 μL稀释后
的 cDNA模板, 10 µmol L–1正反向引物(表 1)各 0.5
μL, 2×SuperReal PreMix Plus 10 μL和 50×Rox Ref-
erence Dye (TIANGEN, 北京 ) 1 μL, 无 RNase
ddH2O 6 μL。将配制好的 PCR反应管置 ABI7500荧
光定量 PCR仪上, 按照 95℃ 15 min, 95℃ 15 s, 60
℃ 20 s, 72℃ 32 s, 共 40个循环的程序进行 PCR。
分别检测在铝离子处理和不处理情况下 , WT、
gpa1-4 和 bcb 材料中铝离子胁迫下相关基因的表达
情况。
2 结果与分析
2.1 利用泛素分离系统筛选 GPA1的互作蛋白
采用泛素分离系统筛选拟南芥 cDNA 文库, 获
得一个阳性克隆, 测序和 NCBI blast 比对分析结果
显示, 该基因为 AtBCB (AT5G20230)。用 GPA1和
AtBCB 的基因全长进行酵母双杂互作验证(图1)发
现, GPA1-Cub 和 NubG-BCB 以及相对应的对照分
别共转化 NMY51酵母感受态细胞后 , 均可在缺
陷型 (SD/–Trp–Leu)培养基上正常生长 , 只有
GPA1-Cub 和 NubG-BCB 可在含有 X-α-gal 的缺陷
型(SD/–Trp–Leu–His–Ade+1.5 mmol L–1 3-AT)培养
基上正常生长并显蓝 , 其余的对照组均不能生长
(图1), 说明转入GPA1-Cub与NubG-BCB, 使3个报
告 基 因 (His+Ade+LacZ+)均 正 常 表 达 , GPA1和
AtBCB 二者存在相互作用。有研究 [24-25]表明 ,
AtBCB 含有一个铜离子结合结构域 , 并受铝离子
胁迫的诱导表达。
图 1 用泛素分离系统验证 GPA1与 AtBCB的相互作用
Fig. 1 Identification of interaction of GPA1 and AtBCB by
split-ubiquitin system
GPA1-Cub和 AtBCB-NubG及阴性对照共转化酵母感受态细胞,
左图为 SD/-Trp-Leu选择性培养基生长结果; 右图为
SD/-Trp-Leu-His-Ade+1.5 mmol L–1 3-AT+40 mg L–1 X-α-gal选择
性培养基生长结果。100, 10–1, 10–2代表不同的稀释浓度。
GPA1-Cub and AtBCB-NubG were co-transformed into yeast com-
petent cells. Left: yeasts grown on SD/-Trp-Leu; Right: yeats grown
on SD/-Trp-Leu-His-Ade+1.5 mmol L–1 3-AT+40 mg L–1 X-α-gal.
100, 10–1, 10–2: different concentration gradients.
2.2 GPA1 与 AtBC 的亚细胞定位及双分子荧光
互补
利用生物信息学数据库 (SoftBerry, http://linu-
x1.softberry.com/berry.phtml)预测 GPA1和 AtBCB在
细胞中的定位显示, 二者均定位于细胞膜上(AtBCB
score 6.3; GPA1 score 5.9)。在激光共聚焦显微镜下
观察35S::GPA1-GFP和35S::BCB-GFP的亚细胞定位,
发现只转化对照质粒35S::GFP 的细胞(图2-A), 绿色
荧光分布于洋葱表皮细胞的细胞膜、细胞质及细胞
核中。分别转化 35S::GPA1-GFP (图 2-B)和 35S::
BCB-GFP (图2-C)融合蛋白的洋葱表皮细胞 , 均只
在细胞膜上观察到绿色荧光, 说明 GPA1与 AtBCB
二者均分布于细胞膜上, 与软件预测和文献报道结
果一致[26]。35S::GPA1-YFPN和35S::BCB-FPC共轰击
洋葱表皮细胞后, 在细胞膜上观察到强烈的黄色荧
光(图2-F), 说明 GPA1与 BCB 在细胞膜上发生了相
互作用, 这与 GPA1和 AtBCB 都定位于细胞膜上相
一致。
2.3 纯合突变体的鉴定
提取突变体单株叶片的 DNA, 用“三引物法”
鉴定纯合突变体(图3-A, B)。其中, WT 中只能用
1956 作 物 学 报 第 39卷
图 2 GPA1与 AtBCB的亚细胞定位及双分子荧光互补
Fig. 2 Subcellular localization and bimolecular fuorescence complementation (BiFC) of GPA1 and AtBCB
A: GFP质粒对照; B和 C: 分别为 GPA1和 AtBCB的亚细胞定位; D和 E: BiFC的阴性对照; F: GPA1和 AtBCB的互作验证。
A is GFP control; B and C are subcellular localization of GPA1 and AtBCB, respectively; D and E are negative controls of BiFC; F is BiFC
result between GPA1 and AtBCB.
图 3 突变体纯合体鉴定
Fig. 3 Identification of homozygous mutants
A: bcb纯合体鉴定; B: gpa1-4纯合体鉴定; M为 DL2000; LP和 RP为扩增目的基因的正反向引物; LB为 T-DNA插入的左边界引物;
WT为野生型, 其余为突变体。
A: verification of gpa1-4 homozygous mutant; B: verification of bcb homozygous mutant; M: DL2000; LP and RP: forward and reverse
primer of target genes; LB: left border primer of the T-DNA insertion; WT: wild type and others are mutants.
LP+RP 扩增出一条特异条带 ; 纯合突变体只能用
LB+RP扩增出一条特异条带; 杂合突变体用 LP+RP
和 LB+RP可分别扩增出一条特异条带。鉴定结果显
示, gpa1-4 中共有 5 株为纯合突变体; bcb 中共有 3
株为纯合突变体。对鉴定为纯合突变体的植株进行
RT-PCR分析(图 4), 结果显示, gpa1-4和 bcb纯合突
变体中, GPA1和 AtBCB的转录受到抑制, 基因功能
缺失。
图 4 GPA1和 AtBCB在突变体和 WT中的表达分析
Fig. 4 RT-PCR analysis expression of GPA1 and AtBCB in WT
and mutants
WT: 野生型; gpa1-4: GPA1突变体; bcb: AtBCB突变体;
Actin2/8基因为内标。
WT: wild type; gpa1-4: GPA1 mutant; bcb: AtBCB mutant;
Actin2/8: internal standard.
第 11期 张小红等: 拟南芥 G蛋白 α亚基 GPA1互作蛋白铜离子结合蛋白 AtBCB的鉴定及功能分析 1957
2.4 铝胁迫下 GPA1和 AtBCB的表达
对于 WT, 随着铝处理时间的延长 , GPA1 和
AtBCB的表达量均上升, 在 8 h 达到最高值。在铝
诱导下, AtBCB 的表达量在不同时间点均比 GPA1
高。GPA1 和 AtBCB 参与了植物对铝的应答反应
(图 5)。
图 5 铝胁迫下 GPA1和 AtBCB的表达
Fig. 5 Relative expression level of GPA1 and AtBCB
GPA1和 AtBCB的表达倍数以 WT未作铝处理时的值为
基准计算。
The fold change of GPA1 and AtBCB are relative value to the
expression level of WT without aluminum treatment.
2.5 铝离子胁迫下膜脂过氧化程度
植物在受到金属铝胁迫时, 根的生长会受到抑
制[27], 根部细胞膜受损, 发生过氧化反应[28-29]。为了
检测 WT、gpa1-4和 bcb在受到铝离子毒害时, 根部
细胞的质膜受损程度, 对这三种材料分别进行 100
µmol L–1 Al2(SO4)3胁迫处理后, 测定其根部丙二醛
的含量, 丙二醛含越高证明植物细胞受损越严重。
在铝处理下, WT、gpa1-4和 bcb三种材料根部的丙
二醛含量均比没有铝处理时高。在没有铝时, 三种
材料间根部的丙二醛含量没有差异 ; 在铝处理下 ,
gpa1-4根部的丙二醛含量比 WT低(P<0.05); bcb根
部丙二醛含量比 WT 高(P<0.01)(图 6)。说明在 100
µmol L–1 Al2(SO4)3 处理下, 与 WT 相比, 突变体
gpa1-4受铝离子的毒害作用小于WT, 而突变体 bcb
受铝离子的毒害作用大于 WT。
图 6 WT、gpa1-4和 bcb根部丙二醛含量
Fig. 6 MDA content in whole root region of WT, gpa1-4, or bcb
lines
–Al代表不用铝处理; +Al代表用 100 μmol L–1 Al2(SO4)3处理 8 h。
标以不同小写字母的柱值差异显著(P<0.05); 标以不同大写字母
的柱值差异极显著(P<0.01)。
–Al and +Al represent without 100 μmol L–1 Al2 (SO4)3 treatment or
with Al2(SO4)3 treatment for 8 hours, respectively. Bars super-
scribed by different lowercase letters are significantly different at
P<0.05 and those by different capital letters are significantly
different at P<0.01.
2.6 铝离子胁迫下相关基因表达变化
研究表明, 拟南芥苹果酸转运体蛋白 ALMT1,
半类型 ABC转运蛋白 ALS1和 ABC转运蛋白 ALS3
对拟南芥耐受铝离子毒害具有重要作用[30-32]。本研
究用 100 µmol L–1 Al2(SO4)3对 WT、gpa1-4和 bcb
三种材料进行处理 , 采用相对定量 PCR 法检测
ALMT1、ALS1 和 ALS3 的在 3 种拟南芥材料中表达
的变化(图 7、图 8 和图 9)。结果显示, 在铝胁迫处
理下, ALMT1在 3种材料中的表达量均有所提高, 其
中, ALMT1在 gpa1-4中的表达量比 WT高(P<0.01);
在 bcb 中的表达量比 WT 低(P<0.05)(图 7)。在有铝
和无铝情况下, ALS1和 ALS3的表达量在 3种材料间
均无显著差异(图 8和图 9)。
3 讨论
G 蛋白复合体介导的细胞信号传导是真核生物
中最保守的信号传导机制之一[33], 筛选拟南芥 G 蛋
白 α 亚基 GPA1 的互作蛋白有助于更好地理解胞外
到胞内的信号传导过程。利用经典的酵母双杂交系
统(GAL4 系统或者 LexA 系统)筛选文库, 通常筛选
1958 作 物 学 报 第 39卷
图 7 ALMT1在铝胁迫下的相对表达量
Fig. 7 Relative expression level of ALMT1 under aluminum stress
目标基因的表达倍数是以 WT在不加铝时为基准计算。–Al表示
不加铝处理; +Al表示用 100 µmol L–1 Al2(SO4)3处理 8 h。标以不
同小写字母的柱值差异显著(P<0.05); 标以不同大写字母的柱值
差异极显著(P<0.01)。
The expression fold of the target genes is relative to the expression
level of WT without Al treatment. –Al and +Al represent without
100 µmol L–1 Al2(SO4)3 treatment or with Al2(SO4)3 treatment for 8
hours. Bars superscribed by different lowercase letters are signifi-
cantly different at P<0.05 and those by different capital letters are
significantly different at P<0.01.
图 8 ALS1在铝胁迫下的相对表达量
Fig. 8 Relative expression level of ALS1 under aluminum
stress
目标基因的表达倍数是以 WT在不加铝处理时为基准计算。–Al
表示不加铝处理; +Al表示用 100 µmol L–1 Al2(SO4)3处理 8 h。小
写字母 a表示差异不显著(P>0.05)。
The expression fold change of the target genes is relative to the
expression level of WT without Al treatment. –Al and +Al represent
without 100 µmol L–1 Al2(SO4)3 treatment or with Al2(SO4)3 treat-
ment for 8 hours. Bars superscribed by different lowercase letters
are significantly different at P<0.05.
图 9 ALS3在铝胁迫下的相对表达量
Fig. 9 Relative expression level of ALS3 under aluminum
stress
目标基因的表达倍数是以 WT在不加铝时为基准计算。–Al表示
不加铝处理; +Al表示用 100 µmol L–1 Al2(SO4)3处理 8 h。
小写字母 a表示差异不显著(P>0.05)。
The expression fold change of the target genes is relative to the
expression level of WT without Al treatment. –Al and +Al represent
without 100 µmol L–1 Al2(SO4)3 treatment or with Al2(SO4)3 treat-
ment for 8 hours. Bars superscripted by different lowercase letters
are significantly different at P<0.05.
到的都是在细胞核中具有相互作用的蛋白, 对筛选
膜蛋白的互作蛋白具有一定的局限性。本研究通过
膜蛋白筛选系统-泛素分离系统筛选拟南芥 cDNA文
库并对阳性克隆进行验证, 发现 GPA1与 AtBCB存
在相互作用(图1)。对该互作的 BiFC验证确认二者
在细胞膜上发生相互作用 (图2-D), 这与二者的亚
细胞定位结果一致(图2-B, C)。Van 等[24]对 AtBCB
的氨基酸序列分析发现, 其 N端的23个氨基酸包含
大量疏水性残基, 可形成一个 α 螺旋结构; C 端的
20个疏水性残基可形成一个 β 折叠层结构; 铜离子
结合区域(24~127氨基酸)为核心区域, 总共104个氨
基酸, 该区域与拟南芥质体蓝素蛋白的铜离子结合
区的氨基酸序列同源性较高, 其中与铜离子直接结
合的氨基酸残基(His50、Cys115和 His120)保持一致; 在
核心区域与 C端间为脯氨酸富集区(128~176氨基酸),
该区域仅含7种氨基酸, 除 Asp174外, 均为非极性氨
基酸。Adman 等[34]对铜离子结合蛋白进行 X 晶体
衍射分析, 发现这类蛋白可作为电子载体参与多种
途径。GPA1可能是通过与 AtBCB 互作 , 影响
AtBCB 的电子载体活性, 从而调控 AtBCB 相关的
信号过程。
Richards等[25]研究发现, AtBCB受铝离子的诱导
表达, 且在铝处理下, 与氧化胁迫相关的 GST、PER
第 11期 张小红等: 拟南芥 G蛋白 α亚基 GPA1互作蛋白铜离子结合蛋白 AtBCB的鉴定及功能分析 1959
和 CAB 等基因的表达量也呈上升趋势。本研究中,
野生型拟南芥在经过 100 µmol L–1 Al2(SO4)3处理后,
GPA1 和 AtBCB 的表达量上升(图 5), 说明 GPA1 和
AtBCB 均参与了植物对铝的应答过程。用铝处理
AtBCB 过表达植株, 其根部 MDA 的含量明显低于
WT 对照植株[26,29], 表明 AtBCB 参与了铝离子胁迫
对植物体造成的氧化胁迫应答。Joo 等[35]将 WT 和
gpa1-4置 700 109臭氧环境中 3 h后, 转入正常生
长环境培养 24 h, 发现 WT 的叶片上出现明显的受
臭氧氧化损伤的斑块, 而 gpa1-4 的叶片上未见明显
的损伤, 这表明突变体 gpa1-4 在抵抗氧化胁迫方面
比 WT强。本研究中, WT、gpa1-4和 bcb三种材料
对 100 µmol L–1 Al2(SO4)3的耐受能力不同, gpa1-4细
胞膜受损程度较低, 其根部 MDA含量比WT和 bcb
低; 而 bcb根部的 MDA含量最高, 细胞膜受损严重
(图 6), 说明在拟南芥对铝的耐受作用中, GPA1起负
向作用; AtBCB起正向作用。
目前, 关于植物抵抗铝毒害的作用机制尚不清
楚, 但有研究表明, 苹果酸转运体基因 ALMT1 的突
变体在 500 µmol L–1AlCl3处理下, 根部出现明显的
生长抑制现象[30]; 转小麦ALMT1基因的大麦植株不
论是在 pH 4.0的营养液还是酸性土壤中, 对铝的耐
受性均明显提高[36]。在本研究中, 用 100 µmol L–1
Al2(SO4)3处理WT、gpa1-4和 bcb, 3种材料中 ALMT1
的表达水平具有显著差异(图 7)。在 gpa1-4中, 由于
ALMT1的表达量较高, ALMT1可转运更多的苹果酸
螯合铝离子, 降低铝对植物的毒害, 从而使 gpa1-4
受铝毒害作用小, 根部细胞膜的过氧化损伤程度较
小, 丙二醛含量较低; 与此相反, bcb中 ALMT1的表
达量在 3 种材料中较低, 受铝毒害作用较大, 根部
丙二醛的含量较高(图 6), GPA1和 AtBCB参与拟南
芥对铝的应答反应, 可能是通过间接地调控 ALMT1
的转录来发挥作用。Larsen等[32,37]发现, 突变体 als3
和 als1在 25 µmol L–1 AlCl3处理下, 根的生长均受
抑制, 但根部铝的积累总量无明显差异。在 als3 中
铝主要积累在根尖; 在 WT 中铝从根尖到根成熟区
都有积累[31]。本研究中, 有铝或无铝情况下, ALS1
和 ALS3 在 WT、gpa1-4 和 bcb 三者中的表达量均
无明显差异(图 8 和图 9), 这表明 GPA1 和 AtBCB
不是通过影响铝在植物体内的再分布来应答铝的
胁迫。
此外, 通常都是将植物置酸性(pH 4.0)环境下来
研究植物对铝胁迫的耐受性, Iuchi 等[38]发现, 拟南
芥中对酸性环境的应答有关键作用的转录因子
STOP1也参与植物对铝的应答过程, 并调控 ALMT1
的转录水平。本研究中, 在无铝处理时, ALMT1在 3
种材料中的表达也有差异(图 7), 推测可能是受酸性
(pH 4.0)培养环境的影响。Van等[24]发现, 将拟南芥
黑暗处理 48 h 后, AtBCB 的表达量显著升高。Xia
等 [39]在水稻中已经发现了一个铝的转运体基因
Nrat1。GPA1和 AtBCB的互作是否影响植物对酸性
环境的应答和光信号的传递, 以及拟南芥中是否存
在铝的转运体尚有待进一步研究。
4 结论
GPA1 与 AtBCB 定位于细胞膜上, 并在细胞膜
上发生直接的相互作用。植物对铝胁迫的耐受作用
中, GPA1起负向作用, AtBCB起正向作用。对铝胁
迫应答有重要作用的基因 AtALMT1, 其转录受
GPA1 负调控; 受 AtBCB 正调控。植物通过细胞膜
上的 G蛋白 α亚基 GAP1和铜离子结合蛋白 AtBCB
的相互作用影响了下游基因苹果酸转运体基因
AtALMT1的表达, 调控植物对铝胁迫的响应。
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