全 文 ：第1期
在真核生物中,细胞内膜将细胞分隔成许多
大小不一的区室,而这些区室之间存在着丰富的
物质和信息交流.囊泡是这些区室之间进行物质
交流的主要载体.协调的囊泡运输是真核细胞生
长与发育所必需的[1].研究表明[2,3],Rab蛋白在囊
泡运输中起着关键的调控作用.Rab蛋白是 RAS
蛋白超家族中的主要成员之一.Rab蛋白是一种
能够与 GTP结合的小分子 GTP酶.这种小分子
GTP结合蛋白的相对分子质量在 20~30kDa之
间.在一些酶活性调控分子的调控下,Rab蛋白能
可逆地在GTP结合状态与GDP结合状态之间转
换,从而蛋白质也在有活性或无活性状态之间转
换.人们对Rab蛋白已研究多年,取得了许多研
究成果.当前,Rab蛋白结构的保守性及功能多样
性之间的联系仍是研究的一个重点[1,4].
拟南芥(Arabidopsisthaliana)基因组测序工
拟南芥Rab1家族基因的克隆和功能研究
伍祚斌,孙雪飘,张家明 *
(中国热带农业科学院 热带生物技术研究所 热带作物生物技术实验室,中国海南 海口 571101)
摘 要:Ypt1蛋白是酵母唯一的Rab1GTP酶,调控囊泡从内质网到高尔基体的运输.酵母温敏突变株 ASY01
是一个Ypt1基因功能部分缺失菌株,在26℃可以正常生长,但在37℃不能生长.拟南芥有 4个 Rab1基因,分
别是 AtRab1A1、AtRab1B1、AtRab1B2、AtRab1C1.克隆了所有 4个 AtRab1基因,构建酵母表达载体,转化温敏
突变型酵母 ASY01.温度敏感性实验结果表明,所有转基因菌株在 37℃都恢复正常生长.说明拟南芥 4个
Rab1基因都与酵母Ypt1基因功能互补,都具有调节囊泡从内质网到高尔基体运输的功能.
关键词:小G蛋白;GTP酶;Rab1;Ypt1;功能互补
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1007-7847(2008)01-0035-05
CloningandFunctionalStudiesoftheAtRab1GeneFamily
MembersinArabidopsisthaliana
WUZuo-bin,SUNXue-piao,ZHANGJia-ming*
(StateKeyBiotechnologyLaboratoryForTropicalCrops,InstituteofTropicalBioscienceandBiotechnology,ChineseAcademy
ofTropicalAgriculturalSciences,Haikou571101,Hainan,China)
Abstract:Ypt1istheonlyRab1GTPaseinSaccharomycescerevisiae,responsiblefortheregulationof
vesicletrafickingbetweenendoplasmicreticulum (ER)andtheGolgicomplex.Ayeasttemperature
sensitivemutantASY01isastrainwithamutatedYpt1genethatcodesforatemperaturesensitiveprotein.
Thisstraingrowsnormalyat26℃,butdoesnotgrowat37℃.Arabidopsiscontains4Rab1genes,which
areAtRab1A1,AtRab1B1,AtRab1B2,AtRab1C1.AlthefourRab1geneswerecloned,andtransformedinto
Ypt1mutantstrain.TemperaturesensitiveexperimentsshowedthatalthefourAtRab1genesrestoredthe
normalgrowthofthemutantstrainat37℃,suggestingthatalAtRab1familymemberscomplementwith
yeastYpt1geneandareresponsiblefortheregulationofvesicletrafickingbetweenERtoGogi.
Keywords:GTPbindingprotein;smalGTPase;Rab1;Ypt1;complementation
(LifeScienceResearch,2008,12(1):035～039)
收稿日期:2007-10-09;修回日期:2008-01-10
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30571064)
作者简介:伍祚斌(1981-),男,广西北海人,硕士研究生,主要从事生物化学和分子生物学研究,Tel:0898-66984866,E-mail:wuzuobin125@tom.
com;张家明(1966-),男,湖北公安人,热带生物技术研究所研究员,博士生导师,通讯作者,主要从事作物遗传育种和分子生物学研究,
Tel:0898-66986190,E-mail:jmzhang@vip.163.com.
第12卷 第1期 生命科学研究 Vol.12No.1
2008年3月 LifeScienceResearch Mar.2008
DOI:10.16605/j.cnki.1007-7847.2008.01.005
生 命 科 学 研 究 2008年
A1F1
A1R1
A1F2
A1R2
B2F1
B2R1
B2F2
B2R2
B1F1
B1R1
B1F2
B1R2
C1F1
C1R1
C1F2
C1R2
表1用于构建表达载体的引物序列
Table1Primersforexpressionvectors
作的完成对拟南芥 Rab基因的研究有着极大的
帮助.拟南芥中发现了93个小G蛋白,分属小G
蛋白家族中的4个亚家族,其中有57个是Rab蛋
白[1,5].拟南芥 Rab基因被分为 AtRab1、AtRab2、
AtRab5、AtRab6、AtRab7、AtRab8、AtRab11、
AtRab16等 8个亚家族,其中 AtRab1基因有 4
个,分别是 AtRab1A1、AtRab1B1、AtRab1B2、
AtRab1C1[1].对 Rab1功能的研究表明,哺乳动物
的 Rab1及酵母 Ypt1蛋白都是在细胞内质网到
高尔基体的囊泡运输中起调节作用的[6~8].尽管氨
基酸序列只有71%相同,哺乳动物的Rab1A基因
能代替酵母Ypt1基因的功能,使Ypt1功能缺陷
菌株正常生长[9].在植物方面,双子叶植物大豆[10]
和甘蓝型油菜[11]各有1个Rab1基因被证明同酵
母的 Ypt1基因功能互补.单子叶植物玉米的
Rab1B基因也与酵母的Ypt1基因功能互补[12],甘
蔗的1个 Rab1基因与 Ypt1互补(未发表结果),
另 1个 Rab1基因虽然不能完全恢复 Ypt1突变
株的功能,但是能部分恢复 [13].由于酵母只有1
个Rab1基因,而植物有多个.目前还不知道是否
所有的Rab1基因都调控囊泡从内质网到高尔基
体的运输.本研究克隆了拟南芥所有 4个 Rab1
基因,通过转化酵母温敏突变株ASY01来研究它
们的功能.
1材料和方法
1.1植物材料和酵母菌株
拟南芥生态型Col-0来自NotinghamArabido-
psisStockCenter.种子播种在标准营养土上,4℃
放置 4d后转到培养室培养.培养室温度 20℃,
光照16h/d,光照强度5000lx.酿酒酵母温敏突
变型ASY01、野生型NSY125由本课题组保存[12].
1.2 拟南芥RNA提取和cDNA合成
以拟南芥现蕾植株的叶片为材料,采用 3S
TrizolTotalRNAIsolationKit(申能博彩生物科技
有限公司) 提取拟南芥总 RNA.用上海生工
MMLV第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA.
1.3酵母表达载体构建
拟 南 芥 AtRab1A1(At3g11730)、AtRab1B1
(At5g47200)、AtRab1B2(At4g17530)、AtRab1C1
(At1g02130)基因cDNA序列在编码区具有较高
的相似性,根据序列比对结果,利用 5′和 3′端非
编码序列设计基因特异引物 (表 1).以叶片
cDNA为模板,用基因特异引物分别扩增 4个
Rab1基因,然后用带有限制性内切酶位点的引物
扩 增 编 码 区 .PCR 产 物 经 DNA Fragment
PurificationKit(大连宝生物公司)纯化后,用
EcoRI和 XhoI酶切(由于 AtRab1A1内部有一
个 EcoRI位点,AtRab1A1扩增片段仅经 EcoRI
部分酶切)后,插入酵母表达载体 pYX142的
EcoRI和XhoI位点.DNA聚合酶采用大连宝生
物公司的高保真 LATaq.T4DNA连接酶也来自
大连宝生物公司.将连接产物转化 E.coli感受态
细胞.挑取单克隆培养,用碱裂解法提取质粒.经
EcoRI和XhoI酶切鉴定后,挑选酶切产物片段
大小与预期相符的克隆寄往上海闪晶公司测序,
选择序列与 GenBank中基因序列完全一致的克
隆转化酵母.
引物名
Primers
限制性酶切位点
Restrictionenzymes
序列
Sequences
5′CAAATCTCGGAAACGCAGTC3′
5′AGCCATTGGTTTTCACAACAC3′
5′AGAGAATTCATGAGCAACGAGTACGATTATCTG3′
5′GAGCTCGAGCTACTGACCGCAGCAACCGC3′
5′TAGATCGATCCAGCTCCGAGA3′
5′GATTTCTTACATGCAAACGAATGAC3′
5′AGAGAATTCATGAATCCTGAATATGACTATTTGTTC3′
5′GAGCTCGAGCGAATTAAGAGGAGCAGCAGC
5′CGTCTCTCTCGTTTTTTTGGC3′
5′ATGATCGAAAGAGGAGTGGTGAC3′
5′AGAGAATTCATGAATCCTGAATATGACTATCTGT
5′GAGCTCGAGTCAAGAAGAACAACAGCCTG
5′TGTATCGCTCGCTGCTCTTC3′
5′GGGGATGTTGTGTAAAAACCAAG3′
5′AGAGAATTCATGAATCCTGAGTACGACTATCTTTTC3′
5′GAGCTCGAGGCTGGTCACGTCAATCAAGT3′
EcoRI
XhoI
EcoRI
XhoI
EcoRI
XhoI
EcoRI
XhoI
36
第1期
图24个pYX142-AtRab1连接产物的酶切鉴定
M:相对分子质量标准;1:经 EcoRI、XhoI酶切的
AtRab1A1的 表 达 载 体 ;2: 经 EcoRI、XhoI酶 切 的
AtRab1B1的 表 达 载 体 ;3: 经 EcoRI、XhoI酶 切 的
AtRab1B2的 表 达 载 体 ;4: 经 EcoRI、XhoI酶 切 的
AtRab1C1的表达载体.
Fig.2 Restrictiondigestionidentificationof4pYX142-
AtRab1geneexpressionconstructs
M:molecularweightmarker;1:expressionvectorofAtRab1A1
digestedwithEcoR IandXhoI;2:expressionvectorof
AtRab1B1digestedwithEcoRIandXhoI;3:expression
vectorofAtRab1B2digestedwithEcoRIandXhoI;4:
expressionvectorofAtRab1C1digestedwithEcoRIand
XhoI.
1.4 酵母ASY01感受态制备和遗传转化
挑取温敏突变株ASY01于YPD液体培养基
中,置于 26℃振荡培养至 OD=1.5.离心收集菌
体,用预冷灭菌水洗涤两次,预冷灭菌1mol/L山
梨醇溶液洗涤两次,再用1mol/L山梨醇重悬即
为酵母感受态细胞.
采用大连宝生物公司 MiniBESTPlasmid
PurificationKit提取质粒,电击法转化酵母ASY01
感受态细胞(电压 1500V,电阻 200Ω,电容 25
μF),均匀涂布于选择培养基SD-leu平板上,风干
后置于 26℃静止培养 3d.使用 pYX142空载体
做对照.
SD-leu培养基:每升培养基中含100mLYNB
(YeastNitrogenBase,酵母氮源,不含氨基酸),
1mg尿嘧啶,His、Trp、Lys各1mg,琼脂粉12g.
1.5 转基因酵母的检测
用大连宝生物公司的基因组 DNA提取通用
试剂盒,分别从 AtRab1A1、AtRab1B1、AtRab1B2、
AtRab1C1基因的转化酵母提取总 DNA.用 PCR
方 法 扩 增 AtRab1A1、AtRab1B1、AtRab1B2、
AtRab1C1基因.扩增 AtRab1A1采用引物 A1F2
和 A1R2,扩增 AtRab1B1采用引物 B1F2和
B1R2,扩增 AtRab1B2采用引物 B2F2和 B2R2,
扩增AtRab1C1采用引物C1F2和C1R2(引物序
列见表 1).以未转基因的 ASY01菌株的总 DNA
为对照.
用3STrizolTotalRNAIsolationKit(申能博
彩生物科技有限公司)提取转基因酵母总 RNA.
用上海生工 MMLV第一链 cDNA合成试剂盒合
成 cDNA.用 RT-PCR方法分别扩增 AtRab1A1、
AtRab1B1、AtRab1B2、AtRab1C1基因.扩增反应
采用引物同上.以未转基因的 ASY01菌株的总
RNA为对照.
1.6转基因酵母的温度敏感性实验
26℃静培养3d长出单克隆后,随机挑取单
克隆分别于YPD液体培养基中,置26℃振荡培
养,将悬浮培养物点样(3μL)于 YPD固体平板,
以未转基因的ASY01、野生型NSY125做对照,分
别置于26℃、37℃静培养2d,观察转基因酵母
的温度敏感性.
2结果与分析
2.1拟南芥Rab1家族基因的扩增和序列分析
拟南芥Rab1家族的4个基因都在叶片中表
达,以叶片cDNA为模板,用基因特异引物扩增出
4个Rab1基因的全长编码区(图1).以PCR片段
为模板测序,序列与利用拟南芥(Col-0)基因组
DNA序列预测的编码区完全一致,所有4个基因
都由8个外显子、7个内含子组成.
2.2 酵母表达载体的构建和转化
分别以4个基因的PCR片段为模板,用带限
制性内切酶位点的引物(表1)扩增,酶切后,连接
到酵母表达载体pYX142,转化E.coliDH5α.碱提
取法提取质粒,经 EcoRI和 XhoI双酶切鉴定
(图2).选择插入片段符合预期的克隆测序.挑选
编码氨基酸序列正确的克隆转化酵母突变体.
图1拟南芥AtRab1cDNA片断的RT-PCR扩增
M: 相 对 分 子 质 量 标 准 ;1:AtRab1A1;2:AtRab1B1;3:
AtRab1B2;4:AtRab1C1.
Fig.1 PCRamplificationofArabidopsisAtRab1cDNA
fragments
M:molecularweightmarker;1:AtRab1A1;2:AtRab1B1;3:
AtRab1B2;4:AtRab1C1.
M 1 2 3 4bp
2000
1000
750
500
250
100
M 1 2 3 4
bp
7500
2500
2000
1000
750
500
250
100
伍祚斌等:拟南芥Rab1家族基因的克隆和功能研究 37
生 命 科 学 研 究 2008年
图 5AtRab1家族基因在酵母突变体 ASY01中的功能互
补分析
NSY125是野生型菌株,在 26℃和 37℃都能正常生长.
ASY01是温敏突变型菌株,在26℃能正常生长,但在37℃
不能生长.转基因 ASY01都在 37℃正常生长.ASY01+A1
为 AtRab1A1转基因 ASY01,ASY01+B1为转化 AtRab1B1
基 因 的 ASY01菌 株 ,ASY01+B2为 转 化 AtRab1B2的
ASY01,ASY01+C1为转化AtRab1C1的 ASY01菌株.从左
往右,每列间是30倍稀释度.
Fig.5 FunctionalcomplementationanalysisofAtRab1
familymembersinyeastmutantASY01
NSY125iswildtypeandgrewnormalyat26℃和 37℃,
ASY01ismutantstrainandgrewnormalyat26℃,butdid
notshowgrowthat37℃,ASY01+A1isthemutantstrain
ASY01 transformed with AtRab1A1 gene,ASY01+B1
transformedwithAtRab1B1,ASY01+B2transformedwith
AtRab1B2,ASY01+C1transformedwithAtRab1C1.Dots
fromlefttorightineachlanearein30-folddilutions.
图3转基因酵母的PCR检测
M:相对分子质量标准;1:转化了 AtRab1A1的 ASY01;2:1
的对照;3:转化了AtRab1B1的 ASY01;4:3的对照;5:转化
了 AtRab1B2的 ASY01;6:5的对照;7:转化了 AtRab1C1
的ASY01;8:7的对照.
Fig.3 Confirmationofforeigngeneintransgenicyeast
strain
M:Molecularmarker;1:ASY01transformedwithAtRab1A1;
2:Controlof1;3:ASY01transformedwithAtRab1B1;4:
controlof3;5:ASY01transformedwithAtRab1B2;6:control
of5;7:ASY01transformedwithAtRab1C1;8:controlof7.
图4外源基因在转基因酵母中的表达检测(RT-PCR)
M:相对分子质量标准;1:转化了 AtRab1A1的 ASY01;2:1
的对照;3:转化了 AtRab1B1的 ASY01;4:3的对照;5:转
化了AtRab1B2的ASY01;6:5的对照;7:转化了AtRab1C1
的ASY01;8:7的对照.
Fig.4Expressionanalysisofforeigngenesintransgenic
ASY01usingRT-PCR
M:molecularmarker;1:ASY01transformedwithAtRab1A1;
2:Controlof1;3:ASY01transformedwithAtRab1B1;4:
controlof3;5:ASY01transformedwithAtRab1B2;6:control
of5;7:ASY01transformedwithAtRab1C1;8:controlof7.
M 1 2 3 4 5 6 7 8bp
7500
2500
2000
1000
750
500
250
100
M 1 2 3 4 5 6 7 8bp
7500
2500
2000
1000
750
500
250
100
26℃ 37℃
NSY125
ASY01
ASY01+A1
ASY01+B1
ASY01+B2
ASY01+C1
2.3外源基因在酵母中的表达检测
分别提取 AtRab1A1、AtRab1B1、AtRab1B2、
AtRab1C1基因的转化酵母 ASY01的总 DNA及
RNA,用PCR方法扩增相应基因.以未转化酵母
ASY01的总 DNA及 RNA为模板,用相应基因的
引物扩增的结果为对照.经 过 PCR检 测 ,
AtRab1A1、AtRab1B1、AtRab1B2、AtRab1C1都 成
功地导入到相应的转基因酵母菌株中(图3).RT-
PCR结果表明,4个基因都在转基因酵母中表达
(图4).
2.4AtRab1家族的功能互补实验
酵母菌株ASY01的Ypt1基因由于在136位
的丙氨酸突变为天冬氨酸,导致在 37℃失去功
能,菌株不能在 37℃生长.将拟南芥 4个 Rab1
基因分别导入 ASY01,温度敏感性实验结果表
明,4个基因的转基因菌株都能在37℃正常生长
(图 5).说明拟南芥 Rab1家族成员都与酵母的
Ypt1基因互补,都具有调控囊泡从内质网到高尔
基体运输的功能.
3讨论
我们的研究结果表明拟南芥的所有 4个
Rab1基因均能与酵母的Ypt1基因互补,使功能
缺失的温敏突变型酵母 ASY01在 37℃正常生
长.说明拟南芥 Rab1家族成员都具有调控囊泡
从内质网到高尔基体运输的功能.4个AtRab1基
因都是从拟南芥叶片cDNA扩增得到的,说明4
个基因同时在叶片表达,可能拟南芥的 Rab1基
因具有冗余的功能.拟南芥基因家族基因的冗余
性已有一些报道,比如芥子酶基因TGG1和TGG2
具有类似的组织表达特性[14],单基因的突变对植
株的生长发育及抗性等没有任何影响,只有当两
个基因同时突变时,才有表型变化[15].当然,也不
能排除 4个 AtRab1基因存在功能分化的可能
38
第1期 伍祚斌等:拟南芥Rab1家族基因的克隆和功能研究
《生命科学研究》2008年专辑征稿启事
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科学领域中最新研究成果的综合性学术期刊,属国家科技部中国科技论文统计源期刊、中国科技核心
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学科最新研究进展,特别欢迎反映各学科国内外最新研究动态的综述类文章。该专辑的公开刊号、版式
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·简 讯·
性,比如它们可能在不同类型的细胞中表达,或者
运输不同类型的蛋白质等.单子叶植物甘蔗和玉
米已被发现 Rab1家族成员功能分化的情况,它
们有些成员与酵母Ypt1互补,有些成员只能部分
恢复Ypt1的功能[12,13].
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