全 文 ：浙江农业学报 ActaAgriculturaeZhejiangensis22(6):716 ～ 721, 2010
马唐炭疽菌 Coletotrichumhanaui三类 Gα亚基基因的克隆与
序列分析
张　勇 1, 2 ,张　震2 ,邱海萍 2 ,王艳丽 2 ,王教瑜2 ,孙国昌 2, ＊
(1 杭州师范大学 生物医药与健康研究中心,浙江 杭州 310012;2浙江省农业科学院 植物保护与微生物研究所 ,浙江 杭州 310021)
收稿日期:2010 -03-02
基金项目:国家 “ 863计划 ”(2006AA10A214);杭州市科技发展计
划(20052432B1)
作者简介:张勇(1984-),男 ,山东泰安人 ,硕士 ,主要从事植物病
原真菌致病分子机理的研究。 E-mail:zy2003401529@163.com
＊通讯作者 ,孙国昌 , E-mail:sungc@zaas.org;Tel:0571-86404073
摘　要:利用同源克隆的方法 ,首先克隆马唐炭疽菌 Gα亚基基因的同源片段 ,再通过 TAIL-PCR扩增基因片
段的上下游邻接序列 , 经过序列拼接最终成功获得了 3类 Gα亚基基因 cagA, cagB和 cagC的全长序列。根
据基因序列及 CDS序列 ,运用相关生物学软件对基因序列及其推测蛋白进行了生物信息学分析。 基因 cagA
全长 1 380bp, 含 5个内含子 , 编码 355个氨基酸;cagB全长 1 283 bp,含 3个内含子 ,编码 353个氨基酸;cagC
全长 1 382 bp,含 4个内含子 , 编码 354个氨基酸。蛋白同源分析表明 ,该菌的这 3类基因推测蛋白与稻瘟病
菌 、小麦赤霉病菌中同类基因编码蛋白高度同源 , 同源率均在 75%以上 ,最高可达 99%。
关键词:马唐炭疽菌;G蛋白;Gα亚基;基因克隆;序列分析
中图分类号:S451;S476+.1　　　　　文献标识码:A 文章编号:1004-1524(2010)06-0716-06
CloningandsequenceanalysisofthreeGαsubunitgenesfrom Coletotrichum
hanaui
ZHANGYong1, 2 , ZHANGZhen2 , QIUHai-ping2 , WANGYan-li2 , WANGJiao-yu2 , SUNGuo-chang2, ＊
(1CenterforBiomedicineandHealth, HangzhouNormalUniversity, Hangzhou310012 , China;2InstitueofPlant
ProtectionandMicrobiology, ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences, Hangzhou310021 , China)
Abstract:ThegenefragmentsofGαsubunitswereisolatedfromColletotrichumhanauibyusinghomologuecloning
method.The5′and3′flankingsequencesofthefragmentswereclonedbyTAIL-PCRmethodandsequenced.After
sequenceassembling, thecompletesenquencesofcagA, cagBandcagCwereobtained.Thestructuresofthethree
geneswerecharacterizedbycomparinggenomeandCDSsequences.ThecagAhasanopenreadingframe(ORF)of
1 380 bpinterruptedby5 intronsandputativelyencodesa355aaprotein.ThecagBhasanORFof1 283 bpinter-
ruptedby3 intronsandputativelyencodesa353aaprotein.ThecagChasanORFof1382 bpinterruptedby4 in-
tronsandputativelyencodesa354aaprotein.Theresultsofaminoacidsequencealignmentsshowedthatthepredica-
tedproteinswerehomologouswithGαsubunitsofotherascomycetousphytopathogenssuchasMagnaporthegrisea,
Gibberellazeae, withtheaminoacididentitybetween75% and99%, respectively.
Keywords:Colletotrichumhanaui;Gprotein;Gαsubunit;geneclone;sequenceanalysis
　　马唐 (Digitariasanguinalis)是世界 18种恶
性杂草之一 ,广泛分布于世界热带和温带地区 ,
主要危害玉米 、大豆 、棉花等旱田作物 [ 1, 2] 。马唐
炭疽菌(Coletotrichumhanaui)Col-68分离自马唐
罹病植株 ,前期研究结果表明该菌对马唐致病力
强 、防除效果好且对作物安全 ,具有潜在的生物
除草剂开发价值 。
植物病原真菌的侵染过程起始于病原菌对
寄主及环境信号的识别 ,而这一识别则主要由 G
蛋白等介导的一系列信号转导以及应答机制来
完成的 。异三聚体 G蛋白(heterotrimericGpro-
tein)是普遍存在于真核生物细胞中的一个具有
重要生理调节功能的蛋白家族 。 G蛋白位于质
膜内胞浆一侧 ,由 α、β和 γ三个亚基组成。 G蛋
白在信号转导过程作为一种分子开关 ,控制信号
的传递 ,调控特定基因的表达 ,最终引起细胞的
应答反应 [ 3] 。与动 、植物中的研究相比 ,真菌中
G蛋白的研究起步较晚 ,但也已取得了相当大的
进展。自从 1993年首次在丝状真菌中报道 G蛋
白以来 ,已经对其中 25个属的 29个种进行了研
究 [ 4] 。研究发现 ,大多数丝状真菌中 Gα亚基有
3类 ,而米曲霉(Aspergilusoryzae)中却有 4类 [ 5] 。
首个被分离出来的 Gα亚基是粗糙脉孢霉(Neu-
rosporacrassa)GNA-1,它与哺乳动物中的 Gαi亚
基有 55%的一致性 ,属于 Ⅰ类 Gα亚基。 Ⅱ类
Gα亚基不如Ⅰ类和 Ⅲ类 Gα亚基保守 ,功能也不
是很明显。 Ⅲ类 Gα亚基高度保守 ,大多在氨基
端有一个十四酰化序列。 Ⅲ类 Gα亚基多数能影
响 cAMP水平 ,通常被认定为 Gαs亚基 。研究表
明 G蛋白的 α亚基参与了多条信号通路的调控 ,
对于稻瘟病菌 (Magnaporthegrisea)等植物病原
真菌的生长 、繁殖以及致病性都具有重要的作
用 [ 4] 。
目前在利用植物病原菌开展除草的研究中 ,
对菌株侵染靶标杂草的分子机制研究甚少[ 6, 7] 。
开展马唐炭疽菌 Col-68致病相关基因的克隆以
及功能研究 ,将有助于认知该菌的致病机制 ,并
为今后利用基因工程的方法对该菌进行菌株改
良奠定了基础。因此 ,本文对该菌 3类 Gα亚基
基因进行了克隆和序列分析。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　菌株
马唐炭疽菌(C.hanaui)菌株 Col-68分离自
马唐罹病植株 ,经过单孢分离纯化后由本实验室
保存;大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株 DH5α为本
实验室保存 。
1.1.2　主要试剂
TaKaRaExTaq酶 、RNAPCRKit(AMV)Ver.
3.0试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司;
DNAMarker购自北京全式金生物技术有限公司;
DNA凝胶回收试剂盒 AxyPrepTM DNAGelExtrac-
tionKit购自爱思进生物技术(杭州)有限公司;
pGEM-TEasyVector购自 Promega公司;Trizol购
自 Invitrogen公司;引物合成及样品测序均由上
海生工生物工程技术服务有限公司完成。
1.2　Gα亚基基因的克隆
1.2.1　基因组 DNA与总 RNA的提取
菌株 Col-68经 PDA平板活化后 ,取少量菌
丝块接于装有 50 mL马铃薯葡萄糖液体培养基
的三角瓶中 ,于 26℃摇床以 140 r/min转速振荡
培养 3 ～ 4 d,收集菌丝体 ,无菌水冲洗 2 ～ 3次 ,
用于 DNA和 RNA的提取 。真菌基因组 DNA的
提取参照文献 [ 8]所描述方法 。总 RNA提取参
照 Trizol试剂使用说明书 ,提取后利用 RNAPCR
Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒反转录合成第一链 cD-
NA。
1.2.2　基因同源片段的克隆
利用 DNAMAN软件 , 对已知的稻瘟病菌
(M.grisea)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminea-
rum)等植物病原菌的 3类 Gα亚基氨基酸序列进
行比对 ,根据保守氨基酸序列分别设计简并引物
扩增 Gα亚基基因的同源片段 。具体为:根据保
守序列 KRLRKECKI和 IYETRFQMG设计引物
GanB-F1和 GanB-R1;根据保守序列 RVILEAME
和 PMKNYFPDYEG设计引物 FadA-F1和 FadA-
R1;根据保守序列 AQGFSKNEK和 MFDVGGQR
设计引物 GanA-F1和 GanA-R1(表 1)。利用引
物对 GanB-F1/GanB-R1, FadA-F1/FadA-R1 和
GanA-F1 /GanA-R1,以马唐炭疽菌基因组 DNA
为模板扩增 3类 Gα亚基基因同源片段 。PCR反
应条件为:95℃ 2 min;94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃
90 s, 30 Cycles;72℃ 10 min。 PCR产物进行
1.0%凝胶进行电泳 ,片段回收后连接 T载体 ,转
化大肠杆菌感受态 ,质粒酶切验证后选取阳性克
隆测序 。
1.2.3　基因全长片段的克隆
根据扩增的基因同源片段序列分别设计引物
(表 1),利用 GenomeWalking技术 ,以马唐炭疽菌
基因组 DNA为模板利用 TAIL-PCR(Thermal
AsymmetricInterlaced-PCR)法 [ 9]延伸基因片段上 、
下游邻接序列 ,获得马唐炭疽菌三类 Gα亚基同源
·717·张　勇等:马唐炭疽菌 Colletotrichumhanaui三类 Gα亚基基因的克隆与序列分析
基因的全长基因组序列。具体过程为:利用随机
引物 LAD1/LAD2/LAD3/LAD4及引物 AC1分别
与特异性引物组 cagA51/cagA52/cagA53, cagB51 /
cagB52/cagB53和 cagC51/cagC52/cagC53进行三
步 TAIL-PCR反应 ,扩增基因片段的上游邻接序
列 ,第三步 TAIL-PCR产物进行电泳并回收特异性
条带 ,转化大肠杆菌后选取阳性克隆测序。同样 ,
利 用 引 物 组 cagA31/cagA32/cagA33, cagB31 /
cagB32/cagB33和 cagC31/cagC32/cagC33,进行基
因片段下游邻接序列的扩增。测序结果利用
DNAMAN软件进行序列拼接。
1.2.4　基因 CDS的扩增
为进一步分析 cagA, cagB和 cagC的基因结
构特征 ,基于所得基因序列并结合基因开放阅读
框(ORF)预测结果(htp://linux1.softbery.com/
bery.phtml)设计引物 CDS-AF/CDS-AR, CDS-
BF/CDS-BR和 CDS-CF/CDS-CR(表 1),以马唐
炭疽菌总 RNA反转录合成的第一链 cDNA为模
板 , PCR扩增 cagA, cagB和 cagC的 CDS序列 。
1.3　基因及其推测蛋白的同源分析
表 1　引物列表
Table1　Primersusedinthisstudy
引物 序列(5′※ 3′) 用　　途
GanB-F1 CAAGAGGCTGCGGAAGGARTGYAARAT 扩增同源 Gα基因 cagA片段
GanB-R1 CCCATCTGGAACCGGGTYTCRTADAT
FadA-F1 TGCGGGTGATCCTGGARGCNATGGA 扩增同源 Gα基因 cagB片段
FadA-R1 TAGTCGGGGAAGTAGTTYTTCATNGG
GanA-F1 GCCCAGGGCTTCACCAARAAYGARAA 扩增同源 Gα基因 cagC片段
GanA-R1 CGCTGGCCGCCCACRTCRAACAT
LAD1 ACGATGGACTCCAGAGAGCGCGGCCGC(G/C/A)N(G/C/A)NNNGGAA LAD1～ 4用于 TAIL-PCR第一步反
应 , AC1用于第二 、三步反应。 由
Liu等设计 [ 9]
LAD2 ACGATGGACTCCAGAGAGCGCGGCCGC(G/C/T)N(G/C/T)NNNGGTT
LAD3 ACGATGGACTCCAGAGAGCGCGGCCGC(G/C/A)(G/C/A)N(G/C/A)NNNCCAA
LAD4 ACGATGGACTCCAGAGAGCGCGGCCGC(G/C/T)(G/A/T)N(G/C/T)NNNCGGT
AC1 ACGATGGACTCCAGAG
cagA51 CTTGACGATTGTGGATTTCCCACT TAIL-PCR扩增 cagA基因的 5′上游
和 3′下游片段cagA52 CAGAGCCTGCGGAATTGTTAGCATGTC
cagA53 GCGAACTGGGAACGTACCGAGCAGTAG
cagA31 ACTCTACAACTATCGGCCGACAGT
cagA32 AGAACCTGGTAGAATGCGCAAAAGCAG
cagA33 TGATACAGGCGATGCGACAGTTCGAC
cagB51 CAATTTGAGCGGGTTGCATGAAG TAIL-PCR扩增cagB基因的 5′上游
和 3′下游片段cagB52 ATGGTCTGGACGTGGTACTCCATGCGT
cagB53 TGGTCCTCGAGAGGCAATTCCAGTGAC
cagB31 ACTGTCAACCGCATGCAGGAGGCT
cagB32 CATCATCCTCTTCCTCAACAAGATCG
cagB33 CGGTTCAAGGAGAAGCTCCCCGTCAGC
cagC51 GTGTTCCACGAGGATATGCGCCAT TAIL-PCR扩增cagC基因的 5′上游
和 3′下游片段cagC52 CAGTAAATGTTAGCCAGGGCGTTCGA
cagC53 GGATCTCGCACGCTTGCGACATGCGAT
cagC31 AGATCAGGACTTGCTGCGCTCGAG
cagC32 TTGCGGACGACTGGTATTACCGAAACG
cagC33 TCTTCGACCTCGGTCAACTGACATACC
CDS-AF ACGCCCGTCAAAATGGGTGCCTGT 扩增 cagA基因的 CDS
CDS-AR AGTCGAGCCGGTTTCATAGGATTC
CDS-BF AACCGCCAAAATGGGTTGCGGAAT 扩增 cagB基因的 CDS
CDS-BR GATGGTTCTTAAATCAAGCCACAC
CDS-CF ATCTGCGCCATGTGCTTCGGGGCT 扩增 cagC基因的 CDS
CDS-CR GGCTCTGCCTTATAGTATCAGCTG
注:R=A或 G;Y=C或 T;D=A, T或 G;N=A, T, C或 G
·718· 浙江农业学报　第 22卷　第 6期(2010年 11月)
　　运用 htp://www.ncbi.nlm.nih.gov网站的
BLAST程序进行基因及氨基酸序列的比对分析;
运用 DNAStar软件包中的 MegAlign程序进行蛋
白系统发育分析 。
2　结果与分析
2.1　基因同源片段的克隆
利用简并引物 GanB-F1 /GanB-R1 , FadA-F1 /
FadA-R1和 GanA-F1 /GanA-R1,通过 PCR扩增获
得了 3个 Gα亚基基因片段 ,大小均在 600 bp左
右(图 1),测序结果显示大小分别为 612, 652和
601 bp。 BLAST比对分析表明这 3个基因片段分
别与稻瘟病菌基因 magA, magB和 magC的同源
性较高 ,推测为马唐炭疽菌 3类 Gα亚基基因的
一部分 ,暂命名为 cagA, cagB和 cagC。
1～ 3.用引物对 GanB-F1/GanB-R1, FadA-F1 /FadA-R1和 Ga-
nA-F1 /GanA-R1分别扩增 cagA, cagB和 cagC的基因片段;
M.Trans2KDNAMarker,箭头指示用于回收测序的目标条带。
图 1　PCR扩增 Coletotrichumhanaui同源 Gα基因片段
Fig.1 PCRamplificationofhomologousGαgenefrag-
mentsfromColetotrichumhanaui
2.2　基因全长片段和 CDS的克隆
通过 TAIL-PCR扩增 ,获得了 cagA, cagB和
cagC基因片段的上 、下游邻接序列(图 2、下游图
略)。测序结果显示:cagA片段上游扩增得到 1
645 bp,下游扩增得到 1 194 bp;cagB片段上游扩
增得到 1 672 bp,下游扩增得到 1 025 bp;cagC片
段上游扩增得到 1 228 bp,下游扩增得到 958 bp。
用 DNAMAN软件进行序列拼接 ,分别获得了大
小为 3 025, 3 273和 2 566 bp的基因片段 。序列
BLAST比对分析显示所得拼接片段分别包含了
cagA, cagB和 cagC的基因全长序列 ,大小分别为
1 380, 1 283和 1 382 bp。 (GenBank登录号为:
GU358700, GU358701和 GU358702)。
利用引物 CDS-AF/CDS-AR, CDS-BF/CDS-
BR和 CDS-BF/CDS-BR,以马唐炭疽菌总 RNA反
转录合成的第一链 cDNA为模板进行 PCR扩增
(图 3),获得了 cagA, cagB和 cagC的 CDS,测序
结果显示大小分别为 1 068, 1 062和 1 065 bp。
2.3　基因序列分析
基于 DNA和 CDS序列分析发现:cagA编码
355个氨基酸 ,由 6个外显子及 5个内含子组成 ,
6个外显子大小分别为 124, 346, 129, 130, 239和
100 bp, 5个内含子大小分别为 71, 71, 59, 55和
56 bp;cagB编码 353个氨基酸 ,由 4个外显子及
3个内含子组成 , 4个外显子大小分别为 118,
343 , 557和 44 bp, 3个内含子大小分别为 93, 53
和 75 bp;cagC编码 354个氨基酸 ,由 5个外显子
及 4个内含子组成 , 5个外显子大小分别为 118,
185 , 158, 259和 345 bp, 4个内含子大小分别为
73, 127, 57和 60 bp。该菌 cagA, cagB和 cagC这
三类基因中的绝大多数内含子符合 GU-AG剪切
规则 ,而 cagC第二个内含子的类型为 GC-AG型。
2.4　基因推测蛋白的同源性分析
在稻瘟病菌(M.grisea)、小麦赤霉病菌(F.
graminearum)、粗糙脉孢霉(N.crasa)、构巢曲霉
(Aspergilusnidulans)、烟曲霉(Aspergilusfumiga-
tus)和米曲霉(A.oryzae)等丝状真菌中 Gα亚基
的功能和分类研究较为明确[ 5, 10] , 通过数据库
(htp://www.broadinstitute.org/)进行蛋白序列
的检索 ,利用 MegAlign程序对马唐炭疽菌和这几
种丝状真菌的 Gα蛋白进行系统聚类 ,结果表明
cagA, cagB和 cagC推测蛋白分属于真菌 Gα蛋
白的Ⅲ , Ⅰ , Ⅱ类(图 4)。基因推测蛋白进行氨
基酸同源比对分析(htp://www.ncbi.nlm.nih.
gov),结果显示:cagA推测蛋白与稻瘟病菌的
MAGA,小麦赤霉病菌的 GBA3 ,粗糙脉孢霉的
GNA-3,构巢曲霉的 AnGanB, 烟曲霉的 AfGanB
和米曲霉的 AoGanB蛋白同源 , 同源率分别为
91%, 90%, 85%, 76%, 75%和 75%;cagB推测
蛋白与稻瘟病菌的 MAGB, 小麦赤霉病菌的
GBA1,粗糙脉孢霉的 GNA-1 ,构巢曲霉的 AnFa-
dA,烟曲霉的 AfFadA和米曲霉的 AoFadA蛋白同
源 ,同源率分别为 98%, 99%, 97%, 94%, 94%和
94%;cagC推测蛋白与稻瘟病菌的MAGC,小麦
·719·张　勇等:马唐炭疽菌 Colletotrichumhanaui三类 Gα亚基基因的克隆与序列分析
图为第三步 TAIL-PCR的结果。 1～ 4.分别利用简并引物 LAD1, LAD2, LAD3和LAD4扩增基因cagA的 5′上游序列;5～ 8.利用简
并引物(LAD1 ～ 4)扩增基因 cagB的 5′上游序列;9～ 12.利用简并引物(LAD1～ 4)扩增基因 cagC的 5′上游序列;M.Trans2KDNA
Marker,箭头指示用于回收测序的目标条带。
图 2　TAIL-PCR扩增 ColetotrichumhanauiGα基因的 5′上游序列
Fig.2 TAIL-PCRamplificationoftheGαgene5′flankingsequencesfromColletotrichumhanaui
1～ 3.分别利用引物对 CDS-AF/CDS-AR, CDS-BF/CDS-BR和
CDS-BF/CDS-BR扩增基因 cagA, cagB和 cagC的 CDS序列;
M.Trans2KplusDNAMarker。
图 3　PCR扩增 ColletotrichumhanauiGα基因的 CDS
Fig.3 PCRamplificationofGαgeneCDSfromColetotri-
chumhanaui
赤霉病菌的 GBA2,粗糙脉孢霉的 GNA-2,构巢曲
霉的 AnGanA, 烟曲霉的 AfGanA和米曲霉的
AoGanA蛋白同源 , 同源率分别为 84%, 77%,
81%, 49%, 50%和 50%。
Ⅰ,Ⅱ, Ⅲ和Ⅳ＊分别代表了 4个不同类别的真菌
G蛋白 Gα亚基 ,其中Ⅳ＊类 Gα亚基仅在米曲霉
(A.oryzae)存在(图 4)。以下为图中所涉及的真菌
G蛋白 Gα亚基及其序列号:M.grisea:MAGB(MGG
00365.6), MAGC(MGG 04204.6), MAGA(MGG
01818.6);F.graminearum:GBA1(FGSG 05535.3),
GBA2(FGSG 09988.3), GBA3(FGSG 09614.3);N.
crasa:GNA-1(NCU06493.3), GNA-2(NCU06729.3),
GNA-3(NCU05206.3);A.nidulans:AnFadA(ANID
00651.1), AnGanA(ANID 03090.1), AnGanB(ANID
01016.1);A.fumigatus:AfFadA(Afu1g13140), Af-
GanA(Afu3g12400), AfGanB(Afu1g12930);A.
注:横轴数据代表氨基酸替换数 ,各分支代表基因编码蛋白。
图 4　CAGA, CAGB, CAGC与其他真菌 Gα亚基的系统进
化分析
Fig.4 PhylogenicanalysisofCAGA, CAGBandCAGCand
otherfungalGαsubunits
oryzae: AoFadA (AO070343000576 ), AoGanA
(AO070334000130), AoGanB(AO070312000002),
AoGaoC(AO070307000122)。
3　讨论
对于一些基因组序列未公布 、分子研究基础
缺乏的丝状真菌来说 ,利用同源克隆的方法进行
基因克隆是一种相对简捷的方法 。本文利用该
法成功克隆了马唐炭疽菌 G蛋白的 3个 Gα基因
·720· 浙江农业学报　第 22卷　第 6期(2010年 11月)
并将基因序列提交到 GenBank。基于 DNA和
CDS序列分析:通过比对发现该菌的 3个 Gα基
因与稻瘟病菌等植物病原菌 Gα基因的外显子 、
内含子的数量基本一致 。这些基因的内含子基
本符合 GU-AG剪切规则 ,但其中 cagC第二个内
含子的类型为 GC-AG型 。 GC-AG型内含子在
人 、线虫和真菌等中均有分布 。粗糙脉孢霉基因
组中有 1.2%的内含子属于 GC-AG型 ,小麦赤霉
病菌基因组中有 1.0%的内含子属于该类型。粗
糙脉孢霉的 gna-2基因(Ⅱ类 Gα亚基基因)第二
个内含子为 GC-AG型 , 本研究中的 cagC基因
(Ⅱ类 Gα亚基基因)第二个内含子也同样为 GC-
AG型 ,这与目前的研究报道相一致 [ 11] 。 GC-AG
型内含子除了参与 mRNA的加工过程还是否具
有其它的功能 ,目前还不清楚。值得注意的是 ,
GC-AG型以及其它非经典类型内含子的发现 ,对
于指导基因的准确预测具有重要的意义。
基因 cagA, cagB和 cagC的推测蛋白与丝状
真菌 Gα蛋白有较高的同源性且分属于 Gα蛋白
的Ⅲ,Ⅰ,Ⅱ类。在马唐炭疽菌的三类 Gα亚基基因
中 , cagB最为保守 ,与稻瘟病菌 、小麦赤霉病菌 、粗
糙脉孢霉 、构巢曲霉 、烟曲霉 、米曲霉等丝状真菌 I
类 Gα蛋白的同源率均在 94%以上 ,与小麦赤霉病
菌的 GBA1同源率最高为 99%;cagA较为保守 ,与
以上几种丝状真菌的 II类 Gα蛋白同源率在 75%
～ 91%;cagC(Ⅱ类)不如 cagB(Ⅰ类)和 cagA(Ⅲ类)
保守 ,与稻瘟病菌的 MAGC同源率最高为 84%,与
构巢曲霉的 AnGanA同源率最低为 49%,这与丝
状真菌中三类 Gα基因的保守性相一致 [ 4] 。
对于丝状真菌 G蛋白信号通路及其相关组
件的功能研究 ,国内外已经开展了大量工作。在
稻瘟病菌中 , magB(Ⅰ类)的缺失 ,导致突变体生
长速率 、产孢量 、附着孢形成率以及致病性均显
著下降;magC(Ⅱ类)的缺失 ,导致突变体产孢量
下降且不能产生成熟的子囊;magA(Ⅲ类)的缺
失 ,导致突变体不能产生成熟的子囊 [ 12] 。在小麦
赤霉病菌中 , GzGPA1 (Ⅰ类)的缺失 ,导致突变体
不能产生子囊壳但毒素生成量明显提高;GzGPA2
(Ⅱ类)的缺失 , 导致突变体致病性明显下降;
GzGPA3(Ⅲ类)的缺失 ,突变体较野生型无明显
变化[ 13] 。由此可见 , Gα亚基对于植物病原菌的
生长 、繁殖以及致病性具有重要的作用 ,但每类
Gα亚基基因在不同的病原菌中的具体功能不尽
相同。本研究中所克隆的三类 Gα亚基基因在马
唐炭疽菌生长 、发育以及致病过程中具体有什么
功能 ,还有待进一步研究。
参考文献:
[ 1] 　朱云枝 ,强胜.马唐病原真菌的分离筛选及致病力测定
[ J] .中国生物防治 , 2004, 20(3):206 -210.
[ 2] 　WiederholtRJ, StoltenbergDE.Cros-resistanceofalarge
crabgrass(Digitariasanguinalis)accessiontoaryloxyphe-
noxypropionateandcyclohexanedioneherbicides[ J] .Wed
Technology, 1995, 9(3):518 -524.
[ 3] 　McCuddenCR, HainsMD, KimpleRJ, etal.G-proteinsigna-
ling:backtothefuture[ J].CelularandMolecularLifeSci-
ences, 2005, 62(5):551 -577.
[ 4] 　LiL, WrightSJ, KrystofovaS, etal.HeterotrimericGprotein
signalinginfilamentousfungi[ J] .AnnualReviewofMicrobiol-
ogy, 2007, 61:423 -452.
[ 5] 　LafonA, HanKH, SeoJA, etal.G-proteinandcAMP-media-
tedsignalinginaspergili:Agenomicperspective[ J].Fungal
GeneticsandBiology, 2006, 43(7):490-502.
[ 6] 　CharudatanR, DinoorA.Biologicalcontrolofweedsusing
plantpathogens:accomplishmentsandlimitations[ J].Crop
Protection, 2000, 19:691-695.
[ 7] 　LiYQ, SunZL, ZhuangXF, etal.Researchprogressonmicro-
bialherbicides[J] .CropProtection, 2003, 22(2):247-252.
[ 8] 　TalbotNJ, EbboleDJ, HamerJE.Identificationandcharacter-
izationofMPG1, ageneinvolvedinpathogenicityfromtherice
blastfungusMagnaporthegrisea[ J] .ThePlantCell, 1993, 5
(11):1575 -1590.
[ 9] 　LiuYG, ChenYL.High-efficiencythermalasymmetricinter-
lacedPCR foramplificationofunknownflankingsequences
[ J] .BioTechniques, 2007, 43(5):649 -656.
[ 10] 　BölkerM.Sexandcrime:HeterotrimericGproteinsinfungal
matingandpathogenesis[ J] .FungalGeneticsandBiology,
1998, 25(3):143 -156.
[ 11] 　RepM, DuyvesteijnRG, GaleL, etal.ThepresenceofGC-AG
intronsinNeurosporacrasaandothereuascomycetesdetermined
fromanalysesofcompletegenomes:Implicationsforautomated
geneprediction[J].Genomics, 2006, 87(3):338-347.
[ 12] 　LiuS, DeanRA.Gproteinasubunitgenescontrolgrowth,
development, andpathogenicityofMagnaporthegrisea[ J].
MolecularPlant-MicrobeInteractions, 1997, 10(9):1075 -
1086.
[ 13] 　YuHY, SeoJA, KimJE, etal.Functionalanalysesofheterot-
rimericGproteinGaandGβ subunitsinGibberelazeae[ J].
Microbiology, 2008, 154(2):392-401.
(责任编辑　陈华平)
·721·张　勇等:马唐炭疽菌 Colletotrichumhanaui三类 Gα亚基基因的克隆与序列分析