全 文 ：人参研究 GINSENG RESEARCH 2016 年第 3 期
玉竹叶斑病病原菌拮抗菌株的筛选及其发酵条件的优化
吕东明 宫丽婷 任跃英 王天媛 张飞飞 许 嘉 李嘉丰
（吉林农业大学中药材学院·吉林 长春·130118）
摘 要：采用平板培养法从玉竹根茎中分离得到的 18株内生真菌，通过对峙培养法，筛选出部分菌株对于
供试的 5种病菌均有不同的抑制作用。 其中菌株 DP06对玉竹叶斑病病原菌具有较强拮抗性，并
对其他几种病菌均有抑制效果，通过分子鉴定，鉴定该菌株为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。
通过 Design-expert软件进行单因素方差分析，利用 Box-behnken法进行响应面优化，确定了其最
佳发酵条件为培养时间 13.29d，温度 24.55℃，转速 120rpm，抑菌活性达到了 82.25%。
关键词：玉竹；分子鉴定；拮抗；响应面法
Screening of antagonistic strains and optimization of fermentation
conditions to Polygonatum odoratum leaf spot pathogen
Lv Dong-ming Gong Li-ting Wang Tian-yuan Ren Yue-ying Zhang Fei－fei Xu Jia Li Jia-feng
(College of Chinese Medicines, Jilin Agricultural University，Changchun 130118)
Abstract:By plate culture isolated 18 endophytic fungi from the roots of Polygonatum odoratum，by
confrontation culture，screening test for some strains of five kinds of Pathogens have different degrees
of inhibition.Wherein the strain DP06 to the leaf spot pathogen of Polygonatum odoratum has strong
antagonistic，and several other pathogen also have inhibitory effect，through the molecular
identification，this strain was identified of Fusarium oxysporum.Through the Design-expert carry out
single factor analysis of variance，use Box-behnken method take response surface，determine the
optimum fermentation conditions is：Training time 13.29 days,temperature 24.55℃，Rotating speed
120rpm，antibacterial activity reached 82.25%。
Key words:Polygonatum odoratum; Molecular identification; Antagonism; Response surface method
玉竹 Polygonatum odoratum （Mill.）Druce，又名葳
蕤，为百合科多年生草本植物，在我国多地均有种植。
根茎入药，地下茎分枝横走，根茎上多须根，有明显纵
纹。久服去面黑皯，好颜色，润泽，轻身不老。清肺金而
润燥，滋肝木而清风[1]。现代化学分析技术从玉竹的根
茎内检测到了许多药用化学成分以及生物活性，如多
糖、木脂素、甾体皂苷、醇类、脂肪酸等 [2,3]，具有显著的
抗肿瘤、降血糖、降血压、作用等[4]。玉竹作为一类药食
兼用的传统中药材，目前正作为一种营养滋补品受到
国内外人们的喜爱，在我国部分地区以及东南亚等地
已将玉竹开发至食品饮料、护肤化妆品、保健品等各
个领域，开发应用前景广泛，大量的需求使玉竹的发
展前景看好[5,6]。 但同时，玉竹的各类病患却是影响产
量的重要因素，如根腐病，叶斑病，紫轮病等。 玉竹叶
斑病是玉竹常见的一种病害，在 5 月到 6 月间为染病
初期，初时叶片上出现小型枯黄斑点，边缘紫红色，内
部黄褐色病斑，从病斑逐渐向整个叶片蔓延，严重时
可以导致叶片大面积出现病斑乃至全部枯死 [7, 8]。
笔者在外出调研的过程中发现了不同的现象，有
的地区玉竹叶斑病病患严重，有的地区则保持良好的
健康性状，几乎从未患过叶斑病。 因此笔者考虑到可
能是因为环境因素的不同与玉竹内生菌的差异性导
致玉竹拥有良好的抗病效果，经过长久以来的自然选
择，内生菌的多样性更加丰富，感染内生菌的药用植
物通常表现出良好的抗逆性，内生真菌能够以多种多
样的形式寄主植物并产生与之相近生物活性的天然
产物，能够影响病原菌正常生长代谢、破坏病原菌的
细胞结构、干扰病原菌的生物合成能力，保护宿主植
物，潜在的生物活性使它们成为开发新化合物、应用
于生防控制植物病害的新资源[9,10]。因此笔者从内生真
菌方面进行试验考证。现通过健康玉竹中分离得到的
内生真菌与其进行拮抗实验，筛选出拮抗效果良好的
菌株，旨在为开发生物防治与微生物农药、绿色农业
提供参考作用。
在国内对于此类研究尚少，本研究意在找出引起
此类病症的病原菌， 并对其生物学特性做出研究结
论，为今后的此类研究做出理论基础，达到减少病害、
减少生产损失的目的。
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人参研究 GINSENG RESEARCH 2016 年第 3 期
1材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1供试病原菌菌株
患病玉竹植株叶片采自辽宁省本溪县中药材试
验研究基地，经吉林农业大学中药材学院任跃英教授
鉴定为玉竹叶斑病。笔者前期实验中从患有玉竹叶斑
病的玉竹叶片分离出了索兰尼氏链格孢（Alternaria
solani），通过柯赫氏法证明了该病原菌为引起玉竹叶
斑病病症的病原菌之一。
人参锈腐病病菌，人参黑斑病病菌，人参灰霉病
病菌，欧文氏菌菌株，保存于吉林农业大学中药资源
实验室。
1.1.2 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基、 马铃薯葡萄糖琼脂培养
基、高氏一号培养基、察氏培养基、马铃薯葡萄糖培养
基
1.1.3 实验仪器
BCN-1360 型生物洁净工作台（北京东联哈尔）；
LHP-250型人工气候箱（哈尔滨东联电子科技有限公
司）； 立式压力蒸汽灭菌器 （上海博讯设备厂）；HC-
2518R 高速冷冻离心机 （杭州华创仪器有限公司）；
Geneamp 9700 型 PCR 仪 （Applied Biosystems）；BIS-
910 凝胶成像分析系统（北京东胜生物科技公司）；空
气恒温振荡器（上海新苗器械公司：KYC-100B）。
1.2 方法
1.2.1 拮抗内生真菌的筛选
从玉竹根茎中分离纯化得到 18 株内生真菌，采
用生长对峙法测定上述分离得到的内生真菌的抑菌
活性，具体操作如下：将病原菌接种到活化培养基上，
在 27 ℃培养箱内培养 5~8 d， 待培养基上长满菌丝
后， 用直径 0.7 cm 的打孔器在培养基中心对称的两
端选取菌饼，按相同位置摆放到新的培养基内，中心
位置放置待测拮抗菌种菌饼。 每组重复做三个，一个
只放病原菌作空白对照。 5~8 d后观察菌落的生长状
态，以拮抗带宽度稳定时的平均值作为抑菌活性强弱
的指标，并作相应记录 [11]。
1.2.2分子鉴定
采用试剂盒法 [12]提取内生真菌总基因组，以真菌
rDNA 扩增的通用引物 ITS1:5′- TCCGTAGGTGAAC-
CTGCGG-3′(19bp) 作为上游引物，ITS4: 5′- TCCTC-
CGCTTATTGATATGC-3′(20bp) 作为下游引物进行扩
增。PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mmol/L，
dNTP mix 4.0μL，NS1/ITS4 引物 (20ng/μL)各 1.0μL，
DNA 模板 3.0μL， Taq 聚合酶 （2.5 U/uL）1.0μL，加
ddH2O 至 25μL。 反应条件为 ： 94℃预变性 5 min，
94℃变性 50s，50℃退火 1min，72 ℃下延伸 1 min ，共
30 个循环；后延伸 72℃ 10min[13～16]。 PCR 产物送金唯
智（北京）生物科技有限公司测序。 将测序获得的 ITS
序列通过 NCBI Blast 程序在 GenBank 上进行比对，
下载 blast 匹配结果以及同源性达到 98%以上的 ITS
序列。 分析 Blast 比对结果。
1.2.3拮抗菌株的发酵条件优化
对拮抗菌株进行单因素试验设计：分别改变活性
菌株的培养温度、培养时间、转速进行单因素实验，测
定活性菌株抑菌效果，结果见表 1。
表 1 拮抗菌株单因素试验设计
Table 1 Antagonistic Strains single factor design
当培养温度设定为 25℃，培养时间设定为 11 d，
改变转速 (100 rpm，110 rpm，120 rpm，130 rpm，140
rpm)，观察转速对发酵液抑菌效果的影响。 每个样品
重复做三次。
当转速比设定为 120， 培养时间设定为 11 d，改
变培养温度(15℃，20℃，25℃，30℃，35℃)，观察培养温
度对发酵液抑菌效果的影响。 每个样品重复做三次。
当转速设定为 120，培养温度设定为 25℃，改变提
取时间(7 d，9 d，11 d，13 d，15 d)，观察培养时间对发
酵液抑菌效果的影响。 每个样品重复做三次。
根据前期单因素试验结果， 选取最显著的时间、
温度、转速为实验因素，采用 Design-Expert 8.05 设计
实验方案，通过响应面法(Response Surface Methodol-
ogy)回归分析得到发酵条件与发酵结果的回归关系，
从而获取最佳发酵工艺。分别改变培养时间、转速、温
度进行单因素试验，测定拮抗活性[17]，结果见表 2。
表 2 拮抗菌株发酵工艺设计
Table 2 Antagonistic strain fermentation process design
2结果与分析
2.1拮抗菌株筛选结果
通过经过拮抗试验筛选表明，由玉竹根茎中分离
得到 18株内生真菌中， 对玉竹叶斑病病菌具有拮抗
吕东明等：玉竹叶斑病病原菌拮抗菌株的筛选及其发酵条件的优化
因素
水平
1 2 3 4 5
时间 7 d 9 d 11 d 13 d 15 d
转速 100 rpm 110 rpm 120 rpm 130 rpm 140 rpm
温度 15℃ 20℃ 25℃ 30℃ 35℃
因素
水平
-1 0 1
时间 11d 13d 15 d
转速 120 rpm 130 rpm 140 rpm
温度 20℃ 25℃ 30℃
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2.2优良拮抗菌株的分子鉴定
对玉竹叶斑病具有优良拮抗效果的菌株 DP06
进行分子鉴定， 通过 NCBI Blast 程序在 GenBank 上
对 rDNA 进行 ITS 序列进行比对 [18]，下载 blast 匹配结
果以及同源性达到 98%以上的 ITS 序列，匹配结果鉴
定该菌株为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。
2.3 拮抗菌株 DP06的发酵条件优化结果
采用 Box-Benhnken 实验设计对活性菌株的发
酵条件进行 3 因素 3 水平的响应面分析实验， 包括
14个析因试验和 3个中心试验。
表 4 Box -Behnken正交试验结果
Table4 Box -Behnken orthogonal test results
根据表 4 的实验数据， 利用 Design-Expert 进行
多元回归分析，得到响应变量与响应值之间的多元二
次回归方程：
Y=80.60+0.24A-0.025B-2.19C+0.65AB-1.02AC+
0.85BC-4.02A2-4.24B2-0.76 C2
表 5拮抗菌株 DP05发酵数据方差分析
Table 5 Strains DP05 fermentation data analysis of variance
由表 5 可看出：模型的 P 值 0.0006<0.0500，该模
型表示非常显著， 方程中 C、A2、B2 对 Y 值的影响达
到了极显著的水平。复合相关系数——因变量和全体
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 Prob>F
模型 233.9 9 25.94 16.53 0.0006
A-时间 0.45 1 0.45 0.29 0.6084
B-温度 5.000E-003 1 5.000E-003 3.187E-003 0.9566
C-转速 44.63 1 44.63 28.45 0.0011
AB 1.69 1 1.69 1.08 0.3339
AC 4.20 1 4.20 2.68 0.1457
BC 2.89 1 2.89 1.84 0.2169
A2 65.29 1 65.29 41.61 0.0004
B2 72.81 1 72.81 46.40 0.0003
C2 2.23 1 2.23 1.42 0.2720
残差 10.98 7 1.57
失拟项 9.55 4 2.39 5.00 0.1085
纯误差 1.43 3 0.48
总差 244.48 16
作用的有 4 株，其中 DP06 的拮抗效果最佳，并且其
对人参灰霉病病菌以及欧文氏病菌均有拮抗效果；菌
株 DP09 对人参锈病病菌表现出了良好的拮抗效果；
DP14 对欧文氏病菌拮抗效果较好； 其中有 6 株内生
真菌发酵液对 2 种以上供试病原菌表现出一定的抑
菌活性，结果见表 3。
表 3 部分内生真菌对 4种病原菌抑菌结果
Table 3 Part of endophytic fungal on four kinds of pathogens antibacterial results

 Pathogens

Test species








 









 +  ++
++

+


+

+++
  ++ 
DP01
DP03
DP06
DP08
DP09
DP13
DP14
DP16
++

+


+

++
+



+


+


+

+

++

注：表中数据为 3次重复的平均值，“—”表示无抑菌圈，“+”表示抑菌圈可见，“++”表示抑菌圈清
晰，“+++”表示抑菌圈非常明显。
编号 温度 时间 转速 抑菌活性
1 0 -1 -1 78.3
2 -1 -1 0 72.5
3 0 -1 1 73.9
4 0 0 0 90.2
5 0 0 -1 83.1
6 1 -1 0 71.3
7 0 0 0 81.2
8 0 0 -1 82.6
9 1 0 1 72.4
10 -1 0 1 73.6
11 0 1 1 74.2
12 -1 0 -1 76.8
13 1 0 -1 79.7
14 -1 1 0 72.5
15 0 0 0 79.6
16 0 1 -1 75.2
17 1 1 0 73.9
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自变量之间的线性关系显著（R2）=95.51%，说明回归
方程的拟合度良好，失拟度较小；校正决定系数（Adj
R2）=0.8973，表明 89.73% 的实验数据变异性可用此
模型解释；信噪比（Adeq precision）=0.5542，变异系数
（C.V.%）=1.64，模型精密度（Adeq Pre）=11.036，表明
该模型可信度很高[19～22]。最佳工艺的确定：通过 Design-
expert的优化功能， 得到了菌株 DP06 的最佳发酵工
艺，即培养时间 13.29 d，温度 24.55℃，转速 120 rpm，
抑菌活性可达到 82.25%，与此前试验结果基本相同。
3 结论
本研究通过对玉竹根茎中的内生真菌进行分离
纯化及拮抗试验，部分菌株对于供试的 5 种病菌均有
不同的抑制作用，其中菌株 DP06 对玉竹叶斑病病原
菌具有较强拮抗性， 并对其他几种病菌均有抑制效
果，通过对其的 ITS 序列进行比对，鉴定该菌株为尖
孢镰刀菌 （Fusarium oxysporum）。 并通过 Design-
expert 对其发酵工艺进行了优化，确定了其最佳发酵
工艺。其发酵产物中的抑菌活性物质在绿色农药应用
上具有开发价值，为今后的玉竹病害的生防药剂的研
制提供了借鉴。
参 考 文 献
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