全 文 ：第 23卷　第 1期 　　　　　　　　　　　　　　云南农业大学学报　　　　　　　 Vol.23　No.1
2008年　1月 　　　　　　　　　　JournalofYunnanAgriculturalUniversity　　　　　 Jan.2008
　收稿日期:2007-05-28　
＊基金项目:云南省自然科学基金重点项目 (2004C0007Z)　　＊＊通讯作者　E-mail:fanlikm@126.com
　作者简介:陈精兰 (1982-), 女 , 湖南人 , 硕士研究生 , 主要从事植物病毒学研究。
侵染野茼蒿引起黄脉症状的联体病毒的分子鉴定＊
陈精兰 , 李　凡＊＊ , 李　越 , 扆守鑫 , 郭　俊 , 陈海如
(云南农业大学 , 农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室 , 云南 昆明 650201)
摘要:采自云南元江的野茼蒿表现为明显的叶脉黄化症状 , 从中检测到的病毒分离物分别命名为 YYJ1,
YYJ2, YYJ3。利用已经报道的联体病毒通用引物 PA/PB对多株野茼蒿样品进行 PCR检测 , 扩增到约 500bp
大小的特异性基因片段 。扩增产物序列测定表明 , YYJ1, YYJ2与云南烟草曲叶病毒 (TobaccoleafcurlYun-
nanvirus, TbLCYNV)各分离物的同源性最高 , 分别为 96%, 98%。 YYJ3与景洪野茼蒿黄脉病毒 (Crass-
ocephalumyellowveinvirus-Jinghong)的同源性达 98%。初步断定云南烟草曲叶病毒与景洪野茼蒿黄脉病毒是
侵染元江野茼蒿的两个主要病毒。同时 , 利用扩增联体病毒卫星 DNAβ 的引物 beta01/beta02对不同染病植株
进行检测 , 未检测到联体病毒的卫星 DNAβ。
关键词:野茼蒿;联体病毒;分子鉴定
中图分类号:S436.3　　文献标识码:A　　文章编号:1004-390X(2008) 01-0029-04
MolecularIdentificationofGeminivirusesInducingVein
YelowinginCrassocephalumcrepidioides
CHENJing-lan, LIFan, LIYue, YIShou-xin, GUOJun, CHENHai-ru
(KeyLaboratoryofAgriculturalBiodiversityforPestManagementofMinistryofEducation,
YunnanAgriculturalUniversity, Kunming650201, China)
Abstract:CrasocephalumcrepidioidesSampleswithveinyelowingsymptomwerecolectedfromYuan-
jiang, andthreevirusisolates, namelyYYJ1, YYJ2 andYYJ3, wereisolatedfromthediseased
plants.PCRdetectionwasconductedanda-500bpfragmentwasamplifiedfromdiseasedtissueswith
thereportedprimersPA/PB, thePCRfragmentwasclonedandsequenced.Sequenceanalysisresult
showedthatYYJ1, YYJ2 shared96% and98% nucleotidehomogeneitywiththeTobaccoleafcurl
Yunnanvirus(TbLCYNV)separately, andYYJ3 shared98% nucleotidehomogeneitywithCrass-
ocephalumyelowveinvirus-Jinghong.ItwasindicatedthatTbLCYNVandCrassocephalumyelow
veinvirus-JinghongweretwovirusesfoundinCrasocephalumcrepidioidesfromYuanjiang.Nofrag-
mentscouldbedetectedfromdiseasetissuesbyPCRidentificationwithprimersbeta01/ beta02.
Keywords:Crassocephalumcrepidioides;Geminivirus;molecularidentification
　　粉虱传联体病毒 (Whiteflies-TransmitedGem-
iniviruses, WTGs)大 部分 属 于联 体 病毒 科
(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属 (Begomo-
virus)病毒 [ 1, 2] 。广泛分布于热带与亚热带地区 ,
随着国际贸易间的不断增加 , 联体病毒在世界范
围内大面积爆发 , 在多种农作物上引起严重危
害[ 3] , 报道较多的有黄秋葵 、 烟草 、 木薯 、 番
茄[ 4 ～ 6]等 。我国在云南 、广东 、 广西 、 海南等地
的香料烟 、 番茄 、 番木瓜 、 扶桑等作物 [ 7 ～ 9]以及
胜红蓟 、假马鞭 、稀硷 、 长蒴母草 、 金腰箭等杂
DOI :10.16211/j.issn.1004-390x(n).2008.01.021
草上发现有联体病毒的侵染 [ 10 ～ 12] 。被感染的植物
一般表现为曲叶 、曲茎 、 叶脉增厚 、 黄脉 、明脉 、
叶背产生耳突 , 植株矮化等典型症状 [ 7] 。
野茼蒿 (Crasocephalumcrepidioides)又名革
命菜 、 凉干菜 , 为菊科三七草属一年生草本植物 ,
适应能力和繁衍能力强 。到目前为止没有关于野
生茼蒿上鉴定出联体病毒的相关报道 。本文对采
自云南元江表现为典型叶脉黄化的野茼蒿的病原
物进行了分子鉴定 , 并初步断定引起野茼蒿叶脉
黄化的病原物为云南烟草曲叶病毒 (Tobaccoleaf
curlYunnanvirus, TbLCYNV)及景洪野茼蒿黄脉
病毒 (Crassocephalumyelowveinvirus-Jinghong)。
1　材料与方法
1.1　染病样品
病样采集于云南元江 , 主要表现为沿叶脉黄
化等典型症状的野茼蒿植株。
1.2　方法
1.2.1　DNA的提取
取约 50mg的植物样品 , 于液氮中研碎 , 加 1
mLpH8.0的 CTAB抽提缓冲液 [ 2%CTAB, 40
mmol/LEDTA, 140 mmol/LNaCl, 200mmol/LTris
-HCl(pH8.0), 1% PVP, pH8.0] , 混匀后于 65
℃温育 30 ～ 60min。用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇
(25∶24∶1)抽提两次 , 上清用等体积的异丙醇沉淀 ,
70%乙醇洗涤 , 溶于双蒸馏水中 , – 20℃保存备用。
1.2.2　PCR检测
根据已报道的联体病毒基因组间隔区及外壳蛋
白保守序列设计的简并引物 PA/PB[ 13] , 扩增 DNA-
A部 分 区 域。 PA (5′- TAATATTACCKG-
WKGVCCSC-3′)和 PB(5′-TGGACYTTRCAWG-
GBCCTTCACA-3′)(K=G或 T;W=A或 T;V
=A, C或 G;S=C或 G;Y=C或 T;R=A或 G;
B=C, T或 G), 引物能扩增约 500bp的特异片
段。 PCR反应条件如下:94℃预变性 2min;然后
94℃变性 45s, 45℃退火 45s, 72℃延伸 1min, 5
个循环;94℃变性 45s, 55℃退火 45s, 72℃延伸
1min, 30个循环后 72℃延伸 10min。
根据 ZHOU等 [ 14] 设计的引物 beta01 (5′-
GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3′)和 be-
ta02 (5′-GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC-
3′)对样品进行 PCR扩增 , 引物能扩增 DNAβ全
长序列 , 检测病毒是否伴有卫星 DNAβ 分子。
PCR反应在如下条件下进行:94℃预变性 2min;
然后 94℃变性 45s, 45℃退火 45s, 72℃延伸 1
min, 5个循环;94℃变性 45 s, 50℃退火 45s,
72℃延伸 1min, 30个循环后 72℃延伸 10min。
1.2.3　PCR产物克隆及序列测定
PCR产物经 1.5%琼脂糖凝胶分析后 , 分别
割取预期的扩增条带 , 经 QIAGEN公司的 QIA-
quickGelExtraction试剂盒纯化 。纯化后的 DNA
片段采用 Sangon公司的 pUCm-TVectorSystem
试剂盒进行连接 , 连接产物转化大肠杆菌 DH5α
菌株 。在含氨苄青霉素的麦康凯平板上挑取白色
菌落 。抽提质粒 DNA, PCR及酶切筛选出重组
子 , 送上海生工公司进行序列测定 。
1.2.4　序列分析
利用 DNAMANVersion5.22进行序列处理分
析 , 序列比较采用 DNAMAN的 homologytree法 。
用于序列分析比较的 TbLCYNV分离物主要有:
Y218 (AJ971505), Y310 (AM261658), Y276
(AJ971508 ), Y143 (AJ512762 ), Y136
(AJ512761 ), Y131 (AJ512760 ), Y314
(AM261660 ), Y309 (AM261657 ), Y273
(AJ971506 ), Y123 (AJ512759 ), Y317
(AM261662 ), Y4 ( AJ320074 ), Y316
(AM261661 ), Y275 (AJ971507 ), Y118
(AJ512758 ), Y311 (AM261659 ), Y315
(AM261667)。 Crassocephalum yelowveinvirus-
Jinghong的一个分离物 (EF165536)。 Tobaccoleaf
curlThailandvirus的一个分离物 (DQ871221)。
2　结果
2.1　症状表现
采自元江的野茼蒿植株主要表现为沿叶脉黄
化 , 叶脉有的有增厚现象 , 植株有轻微的矮化现
象 (图 1)。
30 云南农业大学学报 　　　　　　　　　　　　　　第 23卷
2.2　PCR检测结果
利用引物 PA/PB对采集的不同野茼蒿植株做
PCR检测 , 电泳后均能特异性的检测到约 500bp
左右的核酸条带 , 阴性对照无扩增产物 (图 2)。
用联体病毒卫星 DNAβ的引物 beta01 / beta02对
不同植株进行 PCR检测 , 扩增不到任何条带 。
2.3　序列分析结果
扩增的片段测序后结果显示 , 分离物 YYJ1,
YYJ2, YYJ3片段分别为 502 nts, 524 nts, 524
nts。其中 , YYJ1, YYJ2分离物与 TbLCYNV的同
源性分别为高达 96%, 98%, 与其他联体病毒的
同源性同源性相对较低 (图 3)。 YYJ3分离物与
景洪野茼蒿黄脉病毒 (Crassocephalumyelowvein
virus-Jinghong)的同源性达 98%, 与泰国烟草曲
叶病毒 (TobaccoleafcurlThailandvirus)的同源
性达 91%, 与云南烟草曲叶病毒的同源性相对较
低 , 为 90%, 与其他联体病毒的同源性低于 90%
(图 4)。
3　讨论
对从元江草本植物野茼蒿上分离到的病毒分
离物 YYJ1, YYJ2, YYJ3的部分保守序列测定和
分析表明 , 分离物 YYJ1 与分离物 YYJ2 与
TbLCYNV的同源性最高 , 分别达到 96%, 98%。
初步可以断定 , YYJ1, YYJ2是属于云南烟草曲
叶病毒的两个分离物 。YYJ3与景洪野茼蒿黄脉病
毒的同源性最高达 98%, 初步认为 YYJ3是属于
景洪野茼蒿黄脉病毒的 1个分离物 。同时 YYJ3
与泰国烟草曲叶病毒的同源性达 91%。到目前为
31第 1期　　　　　　　陈精兰 , 等:侵染野茼蒿引起黄脉症状的联体病毒的分子鉴定
止 , Genbank中登录的景洪野茼蒿黄脉病毒与泰
国烟草曲叶病毒都只有一条序列可供比对 , 试验
中测序部分是联体病毒相对保守的区域 , 根据联
体病毒分类标准 , 基因组全序列同源性大于 89%
则认为是同一病毒的不同株系 , 因此笔者认为进
一步对侵染野茼蒿病毒的确定则需要对分离物的
全基因组进行序列测定 , 全长序列分析将有助于
掌握分离物中病毒的确切分类地位。
到目前为止 , 尚未见有关侵染野茼蒿的联体
病毒的报道 , 本研究是首次从该植物中分离到联
体病毒的正式报道。野茼蒿生命力强繁殖快 , 作
为联体病毒传播的中间寄主应引起注意 。研究结
果将为为有效地控制联体病毒的传播提供一定的
理论参考。
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32 云南农业大学学报 　　　　　　　　　　　　　　第 23卷