全 文 ：植 原 体 （Phytoplasma） ， 原 称 类 菌 原 体
（Mycoplasma like organisms， MLO）， 缺少细胞壁，
对四环素类抗生素敏感， 在自然界中主要通过昆虫
传播。 目前全世界大约有 1 000 多种植物感染植原
体病害。 因植原体不能分离培养， 因而适用于其它
原核生物类群的种群划分标准在植原体上就无法进
行， 植原体的分类学研究一直比较缓慢， 直到 20
世纪 80 年代末期， 分子生物学技术的发展， 才大
大加快了植原体的研究进展， 研究者们根据植原体
16S rRNA 基因的 RFLP 图谱构建了植原体的分类
体系[1-4]。
野茼蒿（Gynura crepidioides）， 别名革命菜、 凉
干菜， 为菊科一年生草本植物， 适应力强， 繁殖
快。 在我国主要分布于广东、 海南、 广西、 云南等
省。 笔者首次在海南的琼海和儋州发现了感染变叶
病的野茼蒿， 采用分子生物学方法对田间采集到感
病样品进行 16S rDNA 的克隆、 测序， 以明确其分
类地位。
1 材料与方法
1.1 材料
表现典型变叶症状的野茼蒿感病样品采自海南
儋州（1 株）： Gdz 1， 琼海（2 株）： Gqh1 与 Gqh2。
健康样品采自海南儋州。
1.2 野茼蒿样品总 DNA的提取
参照 Lee等[5]的提取方法， 提取的 DNA于-20℃
冰箱保存备用。
1.3 16S rDNA巢式 PCR扩增（Nested-PCR）和克隆
热带作物学报 2011， 32（2）： 289-292
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期： 2010-09-03 修回日期： 2010-10-14
基金项目： 海南省自然科学基金项目（No. 310069）； 中央级科研院所基本科研业务费专项（No. 2011hzs1J007）。
作者简介： 车海彦（1976年—）， 女， 助理研究员。 研究方向： 植物病毒/植原体病害研究。 *通讯作者： 罗大全， E-mail： luodaquan@163.com。
野茼蒿变叶病病原物的分子鉴定
车海彦 1，2，3， 郑文虎 1，4， 符瑞益 1，2，3， 温衍生 1，2，3， 罗大全 1，2，3*
1中国热带农业科学院环境与植物保护研究所， 海南儋州 571737
2农业部热带农林有害生物入侵监测与控制重点开放实验室， 海南儋州 571737
3海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室， 海南儋州 571737
4 海南大学环境与植物保护学院， 海南儋州 571737
摘 要 利用植原体 16S rDNA 通用引物 R16mF2/R16mR1 对海南表现变叶症状的野茼蒿样品总 DNA 进行 PCR
扩增， 获得约 1.4 kb 的特异片段， 并对扩增产物进行核苷酸序列测定。 通过 BLAST 程序比较、 系统进化树构建
及 iPhyClassifier 分析表明 ， 海南发生的野茼蒿变叶植原体在分类上属于花生丛枝植原体组中的 A 亚组 ， 即
16Sr II-A 亚组。 这是我国首次在野茼蒿上发现植原体病害。
关键词 野茼蒿变叶病； 植原体； 16S rDNA； 分子鉴定
中图分类号 S432.1 文献标识码 A
Molecular Identification of the Pathogeny of Gynura
crepidioides Phyllody Disease in Hainan
CHE Haiyan1，2，3， ZHENG Wenhu1，4， FU Ruiyi1，2，3， WEN Yansheng1，2，3， LUO Daquan1，2，3
1 Environment and Plant Protection Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China
2 Key Laboratory of Monitoring and Control of Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests， Ministry
of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China
3 Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Danzhou， Hainan 571737， China
4 College of Environment and Plant Protection， Hainan University， Danzhou， Hainan 571737， China
Abstract A PCR product （about 1.4 kb） was amplified by employing phytoplasma universal 16S rRNA gene primers
（R16mF2/R16mR1）and total DNA sample extracted from diseased Gynura crepidioides phyllody as the amplified
template． Then the amplified fragments were cloned and sequenced. The results of sequences comparison of Blast
program in GenBank， construction of phylogenetic tree and analysis of iPhyClassifier indicated that the phytoplasma
caused Gynura crepidioides phyllody disease in Hainan belonged to Peanut witches -broom phytoplasma A
subgroup（16SrⅡ-A subgroup）. This is the first report of phytoplasma in naturally infected Gynura crepidioides.
Key words Gynura crepidioides phyllody disease； Phytoplasma； 16S rDNA； Molecular identification
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2011.02.020
第32卷热 带 作 物 学 报
2 000
1 000
M 1 2 3 4 5
M. DNA Marker DL 2 000； 1. Gdz 1； 2. Gqh1；
3. Gqh2； 4. 健康野茼蒿样品； CK. 空白对照
图 2 野茼蒿变叶病样品 16S rDNA 的 PCR 扩增
产物凝胶电泳
A. 健康野茼蒿 B. 感病的野茼蒿
图 1 野茼蒿变叶病症状
根据 Gundersen 等 [6]报道的引物对 R16mF2/
R16mR1 扩增植原体 16S rDNA 基因片段序列。 引
物对序列如下：
R16mF2： 5ˊ-CATGCAAGTCGAACGGA-3ˊ；
R16mR1： 5ˊ-CTTAACCCCAATCATCGAC-3ˊ；
引物 R16mF2/R16mR1 由上海英俊生物技术有
限公司合成。
PCR 反应以健康野茼蒿样品总 DNA 为阴性对
照和无菌双蒸水为空白对照。 反应体系为 25 μL，
含有 10×PCR buffer 2.5μL、 10μmol/L引物各 1μL、
10 mmol/L dNTP 2 μL、 0.125 μL Taq DNA 聚合酶
5 U/μL（大连 TaKaRa 公司）、 1 μL 模板 DNA、 无菌
水 18.375 μL。 PCR 反应条件为 94℃预变性 2 min，
94℃变性 1 min， 45 ℃退火 45 s， 72 ℃延伸 1 min，
共 30 个循环， 最后 72 ℃延伸 10 min。 PCR 产物
于 1％琼脂糖凝胶中电泳， 经溴化乙锭染色后， 用
UVI凝胶成像系统观察。 PCR扩增出的目标产物由
TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0
纯化回收， 将目标产物与 pMD18-T Simple 载体连
接， 转化到大肠杆菌 DH5α 中， 利用 PCR 反应筛
选阳性克隆。
1.4 核苷酸序列测定与分析
序列测定委托上海英骏生物技术有限公司进
行 。 序列拼接用 DNAStar 软件包中的 SeqMan 进
行； 序列相似性比较及分析用 MegAlign 的 Clustal
V 方法进行。 序列相似性查找通过 BLAST（http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/）程序进行。
进化树构建用MEG4.0软件， 最小进化（Minimum
Evolution）分析用近邻交换算法（Close-Neighbor-
Interchange， CNI）完成 ， 起始树用邻近相邻法
（Neighbour-Joining， NJ）建立， 以 1 000 为重复值
进行 Bootstrap 效验 。 选择 Acholeplasma laidlawii
（M23932）为外群。
1.5 计算机模拟 16S rDNA 限制性内切酶酶切及
相似性分析
利用植原体分类鉴定的在线工具-iPhyClassifier
进行序列分析 [9]， 任意两个植原体株系间相似系数
（similarity coefficient， F）根据公式 F＝2Nxy/（Nx+
Ny） 进行计算， 其中 x、 y 为酶切的两个植原体株
系， Nx 和 Ny 分别代表两个株系用 17 种限制性内
切酶（AluⅠ、 BamHⅠ、 BfaⅠ、 BstUⅠ、 DraⅠ、
EcoRⅠ、 HaeⅢ、 HhaⅠ、 HinfⅠ、 HpaⅠ、 HpaⅡ、
KpnⅠ、 Sau3AⅠ、 MseⅠ、 RsaⅠ、 SspⅠ、 TaqⅠ）
酶切产生的 RFLP 条带数， Nxy 为 x 和 y 两个株系
共有的 RFLP 条带数。 相似系数 F≤0.85， 被划分
为不同的组， 相似系数 F≤0.97， 被划分为不同的
亚组； 待分析序列和亚组中的代表性株系的相似系
数为 0.99或 0.98时， 该序列为该亚组的变种， 用 1
个或 2个星号表示（*或 **）， 如， 16SrⅠ-A*（F=0.99），
16SrⅠ-A**（F=0.98）。
2 结果与分析
2.1 田间症状表现
感病植株表现为叶芽丛生， 叶片变小， 花序聚
生， 花器绿变等症状（见图 1）。
2.2 PCR检测结果
从表现变叶症状的 3 个野茼蒿感病样品总
DNA 中扩增到大小约 1.4 kb 的特异片段， 片段大
小与 Gundersen 等[6]报道的相符， 而健康植株和双
蒸水对照均未出现特异扩增片段（见图 2）。
2.3 植原体 16S rDNA基因片段的序列分析
将 Gdz1、 Gqh1 和 Gqh2 样品扩增到的特异片
bp
290- -
第2期 车海彦等： 野茼蒿变叶病病原物的分子鉴定
断进行纯化、 克隆、 测序， 结果表明： Gqh1和 Gqh2
样品的测序结果相同， 上述 3 个样品的 16S rDNA
基因扩增片段均含有 1 430 个核苷酸， G+C 的含量
均为 47.6％。 Gdz1 和 Gqh1（Gqh2）的 GenBank 登录
号分别为 GU113158 和 GU113159， Gdz1 和 Gqh1
（Gqh2）样品的 16S rDNA基因同源性为 99.9％。 利
用国际基因数据库 GenBank 中的 BLAST 程序对测
序结果进行同源性检索发现， 与该序列同源性较高
的均为 16SrⅡ组中的植原体序列。 其中与花生丛
枝植原体（L33765）、 猪屎豆丛枝植原体（EU650181）
和梨衰退植原体（EF193157）等的同源性高达 99.9％。
与候选种 “Candidatus Phytoplasma aurantifolia” 的
同源性为 98.1％， 将 Gdz1 和 Gqh1（Gqh2）植原体
株系暂分别命名为野茼蒿变叶植原体GP1株系（Gynura
crepidioides phyllody phytoplasma strain GP1）和野
茼蒿变叶植原体GP2株系（Gynura crepidioides phyllody
phytoplasma strain GP2）
2.4 计算机模拟 16S rDNA-RFLP 电子酶切图谱
及相似系数分析
利用植原体分类鉴定的在线工具-iPhyClassifier
进行分析表明， 均与 16Sr II-A亚组中的花生丛枝植
原体 （Peanut witches-broom phytoplasma， L33765）
的 17 种限制性内切酶的酶切图谱完全一致（图 3），
相似系数均为 1.0。
2.5 系统进化树构建及分析
用 MEGA 4.0软件构建了野茼蒿变叶病植原体
和植原体组/亚组中代表性株系的进化树， 野茼蒿变
叶病植原体与 16SrⅡ组的关系最近， 与 16Sr II-A
亚组中的花生丛枝植原体（Peanut witches-broom
phytoplasma， L33765）在同一进化分支上（图 4）。
图 3 16S rDNA 的模拟 RFLP 酶切图谱
图 4 基于 16S rDNA 序列构建的野茼蒿变叶病植原体和 16Sr 组/亚组中代表性的植原体株系的进化树
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第32卷热 带 作 物 学 报
3 讨论
植原体在植物体中含量较低， 分布不均匀， 不
能人工培养， 这些特点严重影响着植原体的研究进
展， 分子生物学技术的发展为该类病原物的分类鉴
定提供了一种有效方法 。 人们根据 16S rDNA 的
RFLP 建立了植原体分类的基本框架。 近年来， 随
着计算机软件及网络的发展及植原体快速鉴定的
需要， 科研工作者们开始用计算机模拟 RFLP 分
析对植原体株系进行快速准确的分类鉴定 [7 -8]，
Zhao 等 [9]设计了一个植原体分类鉴定的在线工具
-iPhyClassifier（http://plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-
bin/resource/iphyclassifier.cgi）， 将相似系数 F≤0.85
的划分为不同的组， F≤0.97 的划分为不同的亚组，
F=0.99 或 0.98 时， 分别用 “*” 或 “**” 表示， 代
表相应亚组的变种。 通过 BLAST分析发现， 海南发
生的野茼蒿变叶植原体与 16SrⅡ组中的同源性最
高， 达 99.9％， 与候选种 “Candidatus Phytoplasma
aurantifolia” 的同源性为 98.1％ ， 根据 2004 年 ，
IRPCM Phytoplasma/Spiroplasma Working Team
Phytoplasma taxonomy group 发表的植原体候选种
的描述规则： 用于候选种命名的植原体株系为 “参
考株” 而不是 “模式株”。 即使与 “参考株” 的
16S rRNA 基因序列差别再小， 也不能将其归 “属
于” 此候选种， 而只是与它相关[10]， 因此该植原体
与候选种 “Candidatus Phytoplasma aurantifolia” 相
关。 利用 iPhyClassifier 和系统进化树分析表明 ：
采集自海南儋州和琼海的 3 个样品均与 16Sr II-A
亚组中的花生丛枝植原体（Peanut witches-broom
phytoplasma， L33765）的 17 种限制性内切酶的酶切
图谱完全一致， 相似系数均为 1.0， 在同一进化分
支上， 上述结果表明， 海南发生的野茼蒿变叶植原
体在分类上属于花生丛枝植原体组中的 A 亚组，
即 16Sr II-A 亚组。 这是我国首次在野茼蒿上发现
植原体病害。
参考文献
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责任编辑： 沈德发
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